Способ получения экзополисахаридов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению микробных полисахаридов. Экзополисахариды (ЭПС) получают культивированием продуцирующего штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 в условиях аэрации при 28-30°С на питательной среде, содержащей водный раствор минеральных солей, дрожжевой автолизат в качестве факторов роста и источник углеродного питания - этанол, с последующим выделением экзополисахаридов. Полученные ЭПС содержат значительное количество жирных кислот, что обуславливает более высокую вязкость их растворов: в присутствии одно- и двухвалентных катионов, при низких значениях рН, низких скоростях сдвига, в системе медь-глицин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению микробных полисахаридов, которые могут быть использованы в нефтедобывающей, химической, парфюмерной, пищевой и др. отраслях промышленности.

Известны способы получения полисахаридов культивированием штаммов Xanthomonas campestris NRLL В-12074 и NRLL В-12075 (US 4400467, 1983), Xanthomonas campestris ATCC-31601 (US 4418145, 1983). Однако штаммы Xanthomonas campestris являются фитопатогенными, некоторые из них генетически нестабильны, т.к. диссоциируют на мукоидные и немукоидные формы, что вызывает нестабильность качества синтезируемых полисахаридов, а также ограничивает использование препаратов.

Наиболее близким к изобретению является способ получения экзополисахаридов культивированием продуцирующего штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 в условиях аэрации, содержащей водный раствор минеральных солей, дрожжевой автолизат в количестве 0,5 об. % на 100 об. % питательной среды в качестве факторов роста и источник углеродного питания - этанол в количестве 1,5 об. % на 100 об. % питательной среды при рН 7,0, с последующим выделением экзополисахаридов, при этом водный раствор солей имеет следующий состав, мас.%: КН₂РO₄ - 0,68; NaOH - 0,0896; NaCl - 0,105; NH₄NO₃ - 0,06; MgSO₄ - 0,019; CaCl₂ - 0,00075; FeSO₄ - 0,0006; пантотенат кальция - 0,0003; вода - остальное; время культивирования - до 48 ч (UA 17290, 1997).

Используемый в известном способе состав питательной среды приводит к получению экзополисахаридов (ЭПС), растворы которых недостаточно увеличивают вязкость в системе Cu²⁺-глицин, в присутствии катионов калия и при понижении рН.

Техническим результатом изобретения является улучшение реологических свойств растворов получаемых ЭПС, а именно увеличение вязкости растворов продуцируемых ЭПС в системе Сu²⁺-глицин, в присутствии катионов калия и в области низких значений рН (при переводе полисахарида в Н ⁺-форму) за счет увеличения в составе ЭПС содержания жирных кислот (ацилированной жирными кислотами формы ЭПС).

Технический результат достигается тем, что в способе получения ЭПС культивированием продуцирующего штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 в условиях аэрации при 28-30° С на питательной среде, содержащей водный раствор солей, дрожжевой автолизат в количестве 0,5 об. % на 100 об. % питательной среды в качестве факторов роста и источник углеродного питания этанол, при рН 7,0, с последующим выделением ЭПС, используют питательную среду, включающую водный раствор солей следующего состава, мас.%:

NH₄NO₃ 0,06000

КН₂РO ₄ 0,20000

КОН 0,05500

КСl 0,56000

MgSO₄ 0,01900

NaCl 0,00450

CaCl₂ 0,00075

FeSO₄ 0,00060

Пантотенат кальция 0,00060

Вода Остальное до 100 мас.%

при содержании источника углеродного питания - этанола в количестве 1,0 об. % на 100 об. % питательной среды, причем процесс культивирования проводят в течение 90 ч.

Продуцирующий штамм Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 является результатом прямого ступенчатого отбора мутантов, устойчивых к антибиотикам, при выращивании исходного штамма Acinetobacter sp. ВКПМ В-3243 (исходный штамм известен, например, из SU 1579059, 1991) на агаризованной среде, содержащей от 100 до 500 мкг/мл стрептомицина.

Суспензию односуточной культуры (концентрация клеток в 1 мл - 10⁸-10 ⁹), выращенной на сусло-агаре, рассевали на агаризованную сусловую среду с концентрацией стрептомицина 100 мкг/мл. Выросшие колонии отбирали и пересевали на чашки с более высокой концентрацией антибиотика (до 500 мкг/мл). В результате был получен штамм Acinetobacter sp. ИМВ В-7005.

Основные признаки бактерии-продуцента: бактерии в логарифмической фазе роста - палочки, в стационарной фазе - кокковидные, диплококки, их размер - 0,95-1,5; 1,2-2,0 мкм, спор не образуют, грамотрицательные, неподвижные; на сусло-агаре образуют слизистые колонии белого или кремового цвета, диаметр колонии 4-8 мм; аэробы, каталазоположительные, оксидазоотрицательные; оптимальная температура роста 24-30° С, оптимум рН 6,5-7,5; желатин не разжижают, крахмал не гидролизуют, нитраты не восстанавливают, сероводород, индол и ацетоин не образуют; хемоорганотрофы, для роста нуждаются в дрожжевом автолизате и пантотеновой кислоте, непатогенные, нетоксичные.

Пример 1

Процесс проводят в условиях аэрации в 0,75-литровых колбах на качалках (240 об/мин), в которые вносят 5 мл посевного материала и 100 мл питательной среды. Время культивирования - 90 ч, температура - около 29° С, рН 7,0.

Состав питательной среды:

водный раствор содей, мас.%

NH₄NO₃ 0,06000

КН₂РO₄ 0,20000

КОН 0,05500

КCl 0,56000

MgSO₄ 0,01900

NaCl 0,00450

CaCl₂ 0,00075

FeSO₄ 0,00060

Пантотенат кальция 0,00060

Вода Остальное до 100 мас.%

и дополнительно: дрожжевой автолизат 0,5 об. % и этанол 1,0 об. % на 100 об. % питательной среды.

Культуральную жидкость, которая содержит ЭПС, диализовали против дистиллированной воды в течение 7 дней, разводили дистиллированной водой в 2-3 раза, центрифугировали для того, чтобы отделить клетки (12000 g в мин, 40 мин). Супернатант концентрировали в вакууме (50° С) до начального объема, после чего ЭПС осаждали добавлением 1,5 объема изопропанола. Осадок ЭПС промывали в чистом изопропаноле и высушивали при комнатной температуре.

Проводили пять параллельных экспериментов.

ЭПС разводили дистиллированной водой до концентрации 0,02 и 0,03% (по углеводам). К растворам ЭПС добавляли КСl до концентрации 0,1 М; для переведения растворов ЭПС в Н⁺-форму проводили обработку их катионитом КУ-2-8 (Н+) (300 мг смолы на 15 мл раствора ЭПС). Для изучения свойств растворов ЭПС в системе Сu⁺-глицин к раствору ЭПС добавляли 0,003 М CuSO₄· 5H₂ O, затем 0,015 М глицина; раствор нагревали до 80° С и выдерживали при этой температуре 5 мин, после чего охлаждали. Вязкость растворов ЭПС измеряли на стеклянном капиллярном вискозиметре типа "Оствальд" при 20° С.

Для выделения ацилированного полисахарида (АП) из препарата ЭПС его растворы с концентрацией углеводов 0,01-0,02% обрабатывали катионитом КУ-2-8 (Н⁺) (500 мг смолы на 100 мл раствора ЭПС) до достижения постоянного значения рН. Смолу отделяли центрифугированием (3000 g, 10 мин). 130 мл раствора ЭПС в Н⁺-форме переносили в цилиндрическую делительную воронку объемом 500 мл, добавляли 130 мл хлороформа или гексадекана, воронку закрывали шлифованной пробкой и встряхивали (эмульгировали) на протяжении 1-7 мин. При этом АП переходил в эмульсию, а неацилированный полисахарид (ПАП) оставался в водной фазе. Полученную после эмульгирования смесь оставляли в делительной воронке на 24 часа для разделения фаз, после чего отдельно сливали эмульсию и водную фазу, центрифугировали их при 1200 g, 30 мин для отделения одной фазы от другой и получения остатков. При использовании хлороформа водную фазу выпаривали на роторном испарителе для удаления хлороформа и концентрирования раствора полисахарида. С эмульсией проводили эту же операцию, заранее добавив к ней 3 объема дистиллированной воды. В случае использования гексадекана к эмульсии добавляли 2 объема изопропанола, осадок многоразово промывали изопропанолом для удаления остатков гексадекана. Полисахариды из водной фазы, а также из эмульсии изопропанола осаждали, добавляя 2 объема изопропанола. Полученные осадки полисахарида промывали чистым изопропанолом и сушили при комнатной температуре (I этап разделения).

Аналогичную операцию с хлороформом повторяли еще дважды для растворов полисахаридов, выделенных из водной фазы (II, III этапы разделения). АП, выделенные из эмульсии на трех этапах разделения, объединяли. НАП был выделен из водной фазы на III этапе разделения.

ЭПС состоит из двух кислых полисахаридов, один из которых является ацилированным. Ацилированный и неацилированный полисахариды идентичны по молярному соотношению D-глюкозы, D-маннозы, D-галактозы, L-рамнозы, D-глюкуроновой и пировиноградной кислот (3:2:1:1:1:1) и структуре повторяющейся единицы углеводной цепи. Различие между этими полисахаридами состоит в том, что ацилированный полисахарид содержит жирные кислоты (C₁₂-C₁₈), что обуславливает уникальные свойства его растворов.

Показатели процесса получения ЭПС (усредненные данные пяти экспериментов): биомасса - 1,50 г/л, ЭПС - 2,11 г/л или 1,40 г ЭПС на 1 г биомассы.

Содержание АП в ЭПС - 68-70%.

Вязкость 0,02% (0,03%)-ных водных растворов ЭПС, сСт: в дистиллированной воде - 2,8-3,6 (4,7-5,7), в системе Cu²⁺-глицин 30,49-31,91 (47,11-48,69), в Н⁺ -форме - 78,41-80,18 (93,18-93,82), в присутствии 0,1 М КСl - 20,19-21,21 (29,04-29,96).

Пример 2

Процесс осуществляли по примеру 1 (пять параллельных экспертиментов), но время культивирования составило 48 ч, содержание этанола 1,5 об. %, в качестве водного раствора солей был использован следующий состав, мас.%: КН ₂РO₄ - 0,68; NaOH - 0,0896; NaCl - 105; NH ₄NO₃ - 0,06; MgSO₄ - 0,019; CaCl ₂ - 0,00075; FeSO₄ - 0,0006; витамин В₅ - 0,0003; вода - остальное.

Показатели процесса (усредненные данные пяти экспериментов): биомасса - 1,10 г/л, ЭПС - 1,35 г/л или 1,23 г ЭПС на 1 г биомассы.

Содержание АП в ЭПС - 39,3-40,7%.

Вязкость 0,02% (0,03%)-ных водных растворов ЭПС, сСт: в дистиллированной воде - 2,8-3,6 (4,7-5,7), в системе Сu²⁺-глицин 12,65-13,95 (15,58-17,02), в Н⁺-форме - 42,44-43,96 (60,15-60,65), в присутствии 0,1 М КСl - 8,44-9,36 (14,23-15,27).

Таким образом, 0,02-0,03%-ные растворы ЭПС, синтезированного способом по изобретению, по сравнению с растворами ЭПС, полученными по UA 17290, характеризуются более высокой вязкостью в системе Cu²⁺-глицин, в Н⁺ -форме, в присутствии 0,1 М КСl.

Формула изобретения

Способ получения экзополисахаридов культивированием продуцирующего штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 в условиях аэрации при 28-30°С на питательной среде, содержащей водный раствор солей, дрожжевой автолизат в количестве 0,5 об. % на 100 об. % питательной среды, в качестве факторов роста, и источник углеродного питания - этанол, при рН 7,0 с последующим выделением экзополисахаридов, отличающийся тем, что используют питательную среду, включающую водный раствор солей следующего состава, мас.%:

NH₄NO₃ 0,06000

КН₂РO₄ 0,20000

КОН 0,05500

КСl 0,56000

MgSO₄ 0,01900

NaCl 0,00450

CaCl₂ 0,00075

FeSO ₄ 0,00060

Пантотенат кальция 0,00060

Вода Остальное до 100 мас.%

при содержании источника углеродного питания - этанола в количестве 1,0 об. % на 100 об. % питательной среды, причем процесс культивирования проводят в течение 90 ч.