Способ получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей

 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской промышленности и касается способа получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей. Способ осуществляется следующим образом. Клетки дрожжей разрушают механическим методом, суспензию отмытых клеточных стенок обрабатывают ультразвуком с частотой 18-30 кГц, предпочтительно 18-22 кГц, сопутствующие полисахариды разрушают обработкой щелочью или ферментом и осаждением выделяют целевой продукт. Полученный бета-глюкан не содержит неразрушенных клеток и минимально загрязнен сопутствующими полисахаридами и продуктами их гидролиза. Способ позволяет получить препарат высокой степени очистки без многоступенчатых и трудоемких методов очистки.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и касается получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей.

Важным структурным элементом клеточной стенки дрожжей родов Pichia и Candida является бета-1,3-глюкан, а основу клеточной стенки дрожжей рода Saccharomyces составляет бета-1,6-глюкан и бета-1,3-глюкан.

Бета-глюканы входят в структуру внутреннего слоя клеточной стенки дрожжей, а ее внешняя оболочка образована другим полисахаридом-маннаном.

Бета-глюканы, являющиеся структурным элементом клеточной стенки дрожжей, обладают иммуномодулирующими свойствами, находят применение как носители лекарственных препаратов, как компоненты косметических средств, а также используются в пищевой промышленности как загустители и структурообразователи.

Бета-1,3-глюкан обладает гораздо более выраженной иммуномодулирующей способностью, чем бета-1,6-глюкан.

Принципиально способы получения бета-глюканов достаточно просты и сводятся к разрушению дрожжевых клеток и выделению бета-глюкановой фракции клеточных стенок. [Duffus J.H., Leli С., Munners D.J., Yeast Cell-Well Glucans 1 n "The Yeasts" 1982, v.3, p.151-181].

Конкретные варианты способов получения бета-глюканов касаются частных усовершенствований процесса и могут быть направлены, в том числе, на получение продукта более высокой степени чистоты. Наиболее близким к предложенному можно признать способ получения дрожжевого бета-глюкана из отходов дрожжевого производства, предусматривающий лизис клеток хлебопекарских или пивных дрожжей, отделение нерастворимых частиц центрифугированием, обработку их щелочной солью и удаление раствора, отделение цельных дрожжевых клеток и получение фракции клеточных оболочек, обработку этой фракции щелочным экстрагирующим агентом и отбеливающим или пищевым окислительно-восстановительным агентом и снижение рН обработанного материала до значения 5,0-6,0.

Полученный материал может входить в состав фармацевтической композиции вместе с одним или несколькими фармакологически активными компонентами [Патент РФ 2095408, С 12 N 1/06, 1991 г.].

Цель настоящего изобретения состояла в получении более стандартного препарата бета-глюкана с более высокой степенью чистоты.

Поставленная цель была достигнута с помощью физического отделения бета-глюкана, составляющего внутреннюю часть клеточной стенки дрожжей, от других полисахаридов, составляющих внешнюю часть клеточной стенки дрожжей, в результате обработки изолированных клеточных стенок дрожжей ультразвуком с частотой 18-30 кГц/с, предпочтительно 18-22 кГц/с.

Технический результат, достигаемый при использовании предложенного способа, состоит в повышении однородности и степени чистоты получаемого бета-глюкана клеточной стенки дрожжей.

Сущность предложенного способа получения бета-глюкана клеточной стенки дрожжей состоит в следующем.

Клетки дрожжей, выращенных традиционным образом, разрушают механическим способом, предпочтительно в мельнице с бусами баллотини. При этом получаемые фрагменты клеточных стенок имеют оптимальные для дальнейшей обработки размеры.

Разрушение дрожжевых клеток методом декомпрессии приводит к получению слишком мелких фрагментов клеточных стенок, затрудняющих дальнейшие этапы очистки.

При известных попытках разрушения цельных дрожжевых клеток ультразвуком с частотой порядка 20 кГц/с клетки полностью не разрушаются, а в клеточных стенках образуются отверстия, через которые вытекает содержимое клеток. Получить из такого исходного материала бета-глюкан высокой степени чистоты не удается. Клеточные стенки разрушенных дрожжевых клеток отделяют центрифугированием и промывают.

Суспензию отмытых клеточных стенок подвергают воздействию ультразвуком с частотой 18-30 кГц/с в течение 20-40 минут.

Оптимальная концентрация клеточных стенок в суспензии составляет от 1 до 5%. Мощность ультразвукового воздействия зависит от объема суспензии и концентрации в ней клеточных стенок.

В результате ультразвуковой обработки в указанном режиме внутренний слой клеточной стенки, образуемый бета-глюканом, физически отделяется от внешнего слоя клеточной стенки, образуемого другими полисахаридами. Фактически дрожжевая клеточная стенка расслаивается на всем протяжении и это четко видно при микроскопическом исследовании.

Заявителем установлено, что воздействие ультразвуком с частотой, меньшей 18 кГц/с не приводит к расслоению клеточной стенки дрожжей, а воздействие ультразвуком с частотой, большей 30 кГц/с приводит к получению мелких фрагментов клеточной стенки, из которых как из исходного материала выделить целевой продукт высокой степени чистоты не удается.

Для удаления других полисахаридов, загрязняющих препарат бета-1,3-глюкана, их разрушают щелочным или ферментативным гидролизом с помощью ферментов, разрушающих эти полисахариды.

Поскольку бета-глюкан тоже является полисахаридом, "другими полисахаридами" в данном случае считаются все остальные полисахариды, кроме бета-глюкана, и, в первую очередь, маннан, из которого состоит основная часть внешней оболочки клеток дрожжей.

Гидролиз полисахаридов проводят традиционным образом и в обычно принятых для такого процесса условиях.

В частности, гидролиз полисахаридов может быть осуществлен обработкой озвученной суспензии с помощью 0,05-0,1 н. NaOH при значениях рН от 10 до 12 при температуре 70^oС в течение 30-40 минут.

Ферментативный гидролиз может быть проведен обработкой озвученной суспензии, преимущественно ферментным препаратом грибной эндоманнаназы, при ее концентрации 2-3 Е/мл при температуре 45-48^oС в течение 90 минут.

В результате гидролиза маннан и другие полисахариды, кроме бета-глюкана, превращаются в водорастворимые соединения и могут быть отделены от нерастворимого в воде бета-глюкана известными приемами, в частности центрифугированием. При такого рода обработки бета-глюкан не расщепляется и остается нерастворимым в воде.

Осажденный бета-глюкан может быть промыт и высушен.

Если исходньм материалом служили клетки дрожжей родов Pichia или Candida, получают бета-1,3-глюкан, если целевой продукт выделяли из клеток дрожжей рода Saccharomyces, получают бета-1,3-глюкан и бета-1,6-глюкан.

Полученный предложенным способом бета-глюкан не содержит неразрушенных клеток и минимально загрязнен сопутствующими полисахаридами и продуктами их гидролиза.

Полученные предложенным способом бета-1,3-глюкан или бета-1,6-глюкан содержат 80-85% бета-глюкана.

Для получения аналогичных препаратов со сравнимой степенью чистоты известными способами потребуются многостадийные и трудоемкие методы очистки [Гололобов А. Д. и др. Метод разрушения дрожжей рода Candida. Микробиологическая промышленность. 1972 г., стр.14-17].

Приводимые ниже Примеры лишь иллюстрируют сущность предложения и не носят ограничивающего характера.

ПРИМЕР 1. Клетки дрожжей Pichia membranafaciens, выращенные на среде, содержащей минеральные соли и этанол, отмывают от остатков питательной среды и суспендируют в воде до концентрации сухих веществ 10%. 100 мл дрожжевой суспензии помещают в сосуд мельницы, содержащей 50 г стеклянных бус баллотини, и подвергают разрушению в течение 2 минут. Разрушенные дрожжевые клетки, содержащие фрагменты клеточных стенок, промывают на фильтре водой для отделения бус баллотини. Гомогенат клеток центрифугируют при 1000 g для отделения неразрушенных клеток дрожжей. Супернатант центрифугируют при 5000 g для осаждения клеточных стенок, которые 2 раза промывают фосфатным буфером и 1 раз водой для более полного удаления компонентов клеток. Готовят суспензию промытых клеточных стенок с концентрацией 5%. Суспензию объемом 100 мл помещают в стеклянный сосуд емкостью 250 мл и подвергают воздействию ультразвуком с частотой 18 кГц/с и мощностью 200 Вт в течение 20 мин.

Озвученную суспензию подщелачивают до значения рН 11 с помощью 0,1 н. NaOH и в течение 45 мин осуществляют гидролиз полисахаридов, формирующих внешний слой клеточной стенки.

Суспензию центрифугируют при 12000 g в течение 45 мин, осадок несколько раз промывают деионизированной водой, а затем высушивают.

Готовый продукт содержал 78% бета-1,3-глюкана с выходом до 10% от веса исходной дрожжевой биомассы.

ПРИМЕР 2. Клетки дрожжей Candida valida, выращенных на среде, содержащей раствор минеральных солей и глюкозу, отмывают от остатков питательной среды. 100 г дрожжевой биомассы помещают в мельницу типа KDL и подвергают разрушению в течение 3 минут. Разрушенные дрожжевые клетки, содержащие фрагменты клеточных стенок, промывают водой и готовят суспензию промытых клеточных стенок с концентрацией 3%. Суспензию объемом 0,5 л помещают в стеклянный сосуд емкостью 1 л и подвергают воздействию ультразвуком с частотой 20 кГц/с и мощностью 250 Bт в течение 30 мин.

Озвученную суспензию доводят до значения рН 5,5, вносят 0,2 г ферментного препарата эндоманнаназы и в течение 2,5 часов осуществляют ферментативный гидролиз полисахаридов, формирующих внутренний слой клеточной стенки.

Суспензию центрифугируют при 9800 g в течение 15 минут, осадок несколько раз промывают 0,1 н. фосфатным буфером и деионизированной водой, а затем высушивают.

Готовый продукт содержал 87% бета-1,3-глюкана с выходом 11% от веса исходной дрожжевой биомассы.

ПРИМЕР 3. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенные на среде, содержащей раствор минеральных солей и сахарозу, отмывают от остатков питательной среды. 100 г дрожжевой биомассы, суспендированной в фосфатном буфере помещают в мельницу с бусами баллотини и подвергают разрушению в течение 1,5 минут. Разрушенные дрожжевые клетки, содержащие фрагменты клеточных стенок, центрифугируют при 5000 g, осадок промывают фосфатным буфером и деионизированной водой и готовят суспензию промытых клеточных стенок с концентрацией 5%. Суспензию клеточных стенок дрожжей объемом 500 мл помещают в стеклянный сосуд емкостью 1 л и подвергают воздействию ультразвука с частотой 29 кГц/с и мощностью 100 Bт в течение 35 мин.

Озвученную суспензию доводят до значения рН 5,5, вносят 0,1 г грибного ферментного препарата маннаназы и в течение 3 часов осуществляют ферментативный гидролиз полисахаридов, формирующих внешний слой клеточной стенки.

Суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин, осадок несколько раз промывают 0,1 н. фосфатным буфером и деионизированной водой, а затем высушивают.

Готовый продукт содержал 75% суммы бета-1,6-глюкана и бета-1,3-глюкана с выходом 10% от веса исходной дрожжевой биомассы.

Возможность физического отделения внешнего слоя клеточной стенки дрожжей, образованного маннанами, от внутреннего слоя клеточной стенки дрожжей, образованного бета-глюканами, под воздействием ультразвука с частотой 18-30 кГц/с, предпочтительно 18-22 кГц/с показана заявителем впервые.

Заявитель полагает, что предложенный способ соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

Формула изобретения

Способ получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей, характеризующийся тем, что клетки дрожжей разрушают механическим методом, суспензию отмытых клеточных стенок обрабатывают ультразвуком с частотой 18-30 кГц, предпочтительно 18-22 кГц, сопутствующие полисахариды разрушают обработкой щелочью или ферментом и осаждением выделяют целевой продукт.