Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины для сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов. Используют штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) вируса бешенства, который вносят в культуральный сосуд (0.1-0.01 МЛД₅₀/клетку) одновременно с катками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток (0.5-0.6 млн. кл/мл) и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании и поддержании рН 7.2-7.4. Полученное вирусное сырье с инфекционной 6.5-6.8 lg МЛД₅₀/мл и антигенной активностью 1:90-270 инактивируют 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом 0.01% при 37°С 3 суток. Готовый вакцинный препарат соответствует требованием стандарта для ветеринарных препаратов и обладает активностью 1.5-2.0 ME. 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов и может быть использовано в ветеринарии для профилактики бешенства среди животных.

В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный [R.Barth, V.Franke, M.A.Selimov Vnukovo-32 primary hamster kidney cell vaccines for humans. //Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, Geneva 1996, C.310-313; Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства//Ветеринария. – 1998 - №1 С.22-24; Патент 2077338 от 20.4.97. г. Никишин И.В., Вишняков И.Ф., Горшкова Т.Ф., Стрельцов Л.Ф., Жестерев В.И.; Иванов B.C. Бешенство животных: эксперементально-теоретическое обоснование разработки, производства, применения культуральных инактивированных вакцин и новые подходы к проблеме экстренной защиты ЦНС от возбудителя заболевания: Автореф. дис. д-ра вет. наук: М. 2001-20 с; Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.].

Известные способы получения вирусного сырья для изготовления инактивированных антирабических вакцин являются весьма трудоемкими, экономически не эффективными и не позволяют получать без дополнительных технологических приемов профилактические препараты требуемой биологической активности (низкое накопление инфекционной и антигенной активности).

Наиболее близким аналогом является способ получения инактивированной антирабической вакцины из штамма (РВ-97) в суспензии клеток ВНК-21 с использованием инактиванта димерэтиленимина (Гочмурадов М.Г., Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.).

Однако существующий способ приготовления вакцинного препарата технологически объемный и не позволяет получать на первичных этапах сырье требуемой биологической активности (инфекционная активность 6,0-6.5 lg ЛД₅₀/мл, антигенная активность <1МЕ).

Первоначально проводят подращивание клеток ВНК-21 до 1.2-1.8 млн. кл/мл; затем заражение их вирусом бешенства. Полученное вирусное сырье концентрируют в 2-3 раза до получения необходимой антигенной активности и инактивируют димерэтиленимином.

В процессе выполняемых технологических этапов проводят 1-2 раза смену дорогостоящих питательных сред (Игла-МЕМ), вводят дополнительные этапы обработки - сепарирование, концентрирование и используют инактиванты, которые требуют особых условий работы с ними, поскольку высоко токсичны и сильные мутагены для работающего персонала (димерэтиленимин).

Целью изобретения является разработка и усовершенствование технологичного способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства для животных без снижения ее иммунобиологических характеристик.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, при этом в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0.1-0.01 МВД₅₀/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0.25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0.01% 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6%-го ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.

Штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) получен из исходного “овечий” ВГНКИ - 80 пассаж в мозге овец и адаптирован к культуре клеток почки кролика и культуре клеток куриных фибробластов. Инфекционная активность штамма 4,5-5,5 lg МДД₅₀/мл. Вирус вызывает образование антител у домашних и диких животных при оральном и парантеральном введении. Патогенен для лабораторных животных мышей и кроликов при внутримозговом заражении (Ковалев Н.А и др. Авторское свидетельство №1091393 от 08.01.1984 г.). Вирус вносят в культуральный сосуд одновременно с клетками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии.

Культивирование проводят в суспензионной среде 0,25% ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании содержимого. Полученное вирусное сырье имеет инфекционную (6.5-6.8 lg МЛД₅₀/мл) и антигенную активность (1.5-2.0 ME), достаточную для использования его в вакцине без дополнительных технологических приемов (сепарирование, концентрирование).

Инактивацию вируса проводят безопасным и устойчивым препаратом 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодекан - (А-24) в концентрации 0.01-0.1% при 37°С в течение 3 суток.

В качестве адъюванта добавляют 10-20% 6% ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.

Пример конкретного выполнения.

Выращивание вируса бешенства штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) проводят в культуре ВНК-21 с концентрацией 0.5-0.6 млн. кл/мл с одновременным внесением вируса в дозе 0.1-0.01 МЛД₅₀/кл в суспензионной среде 0,25% ФГМ в ферментерах реакторного типа при температуре 37°С и постоянном перемешивании содержимого, и автоматическом поддержанием рН среды в пределах 7.2-7.6. В течение первых трех суток наблюдается повышение концентрации инфицированных клеток до 1.5-2.5 млн. кл/мл, затем постепенная их гибель. Культивирование прекращают, когда жизнеспособных клеток во взвеси остается 18-20%. Время культивирования - 6 суток. Инфекционная активность вируса бешенства штамма РБ-71 к этому времени составляет 6.5-6.8 lg МДЦ₅₀/мл. Антигенная активность вирусного сырья из штамма РБ-71 составляет 1:90-1:270 в реакции ИФА. Полученное вирусное сырье инактивировали А-24 в концентрации 0.01-0.1% в течение 3 суток при 37°С, затем добавляли 6% 10-20% гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0.6% (таблица №1).

Таблица №1
Сравнительная характеристика способов изготовления инактивированной вакцины против бешенства
Этапы работы	Предлагаемый способ	Прототип
Штамм вируса	РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ)	РВ-97
Культура клеток	ВНК-21/13	ВНК-21/2
Посадочная концентрация клеток	0.5 млн.кл/мл	0.5 млн.кл/мл
Подращивание культуры:
время		1-2 суток
концентрация		1.8-20 млн. кл/мл
Заражение вирусом: доза	0.1-0.01 МЛД50/кл	0.5-1.0 ЛД50/кл
Время культивирования	5-6 суток	5 суток
Инфекционная активность (lg МЛД50/мл)	6.5-6.8	6.0-6.5
Инактивант	А-24 (0.01, 37°С, 3 суток)	Димерэтиленимин (0.1-0.3, 37°С, 24 часа)
Стабилизатор	-	Феракрил
Адъювант	ГОА	-

Использование предлагаемой технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества.

1. Сокращает время получения вирусного сырья на 1-2 суток за счет одновременного внесения клеток и вируса в реактор.

2. Уменьшает расход дорогостоящей питательной среды в 2 раза за счет исключения этапа смены среды.

3. Снижает расход вирусного сырья в 5-10 раз и повышает накопление антигенной активности в вирусном сырье, достаточной для использования его для изготовления эффективного инактивированного препарата.

4. Исключает использование дополнительных технологических приемов - осаждение клеток, сепарирование, концентрирование без снижения характеристик получаемой вакцины.

5. Позволяет заменить импортную среду Игла MEM на не менее эффективную отечественную питательную среду из ферментативного гидролизата мышц (ФГМ).

Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины, включающий культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, отличающийся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0,1-0,01 МЛД₅₀/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0,5-0,6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0,25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0,01%-ным 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6% гидроокиси алюминия до конечной концентрации сухого остатка 0,6-0,9%.