Способ определения детергента в пробе
Владельцы патента RU 2247986:
Государственное образовательное учреждение Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения детергента в пробе основан на регистрации скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее. Для осуществления способа в изотонический водный раствор, содержащий стандартную взвесь эритроцитов, добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз. Детергент определяют по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы. Способ позволяет повысить чувствительность определения при низких концентрациях детергента в пробе. 2 табл.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в травматологии и стоматологии для оценки токсичности костного цемента и пластмасс по выходу из них мономеров, в биохимии для определения детергентов в биологических жидкостях и тканях, в области санитарии и гигиены для обнаружения детергентов в водных средах, в фармакологии для тестирования гемолитической активности лекарственных препаратов.
Токсичность детергентов, как поверхностно-активных веществ, заключается в их способности разрушать биологические мембраны путем дезорганизации липидного бислоя. Эту способность детергентов используют для их выявления и количественного определения в водных растворах.
Известен общепринятый способ определения детергента в пробе по регистрации скорости гемолиза в изотоническом водном растворе (Калер Г.В., Рачковский Л.И., Окунь И.М. Гемолиз эритроцитов детергентами - математическая модель и анализ концентрационных и кинетических кривых. // Цитология. - 1986. - Т.28. - № 9. - С.954).
Недостатком способа является его низкая чувствительность. Низкая чувствительность способа обусловлена тем, что зарегистрировать скорость гемолиза, индуцированного детергентом, возможно только при достижении определенной пороговой концентрации детергента в пробе.
Задачей изобретения является повышение чувствительности способа определения детергента в пробе при низких концентрациях детергента.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения детергента в пробе, включающем регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, согласно изобретению предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.
Заявляемый способ основан на впервые обнаруженном эффекте ускорения детергентом кислотного гемолиза. Для индукции кислотного гемолиза в изотонический водный раствор, содержащий стандартную взвесь эритроцитов, добавляют глициновый буфер со значением рН 2-2,5. Буфер используют с целью предотвращения возможного влияния пробы, содержащей детергент, на кислотность среды. Способ обладает большей чувствительностью по сравнению с прототипом, так как увеличение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента удается зарегистрировать при более низких концентрациях детергента в пробе по сравнению с прототипом, где в присутствии детергента регистрируют скорость детергентного гемолиза (см. табл.1).
Возможна количественная оценка содержания детергента в пробе по следующей формуле:
Х=К(V0-Vк), где
К - коэффициент пересчета, мкМ/dЕ 800/мин.
V0 - скорость гемолиза в присутствии пробы, dЕ 800/мин.
Vк - скорость кислотного гемолиза без пробы, dЕ 800/мин.
Способ может быть осуществлен, например, следующим образом.
Получают примерно 1 мл цитратной крови лабораторного кролика. Кровь трижды отмывают физиологическим раствором. Для этого ее центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об./мин, сливают плазму и к эритроцитам добавляют 10-15 мл физиологического раствора; после перемешивания взвесь центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин, сливают надосадок и процедуру повторяют еще два раза. К взвеси отмытых эритроцитов добавляют физиологический раствор до получения стандартной взвеси эритроцитов: оптическая плотность стандартной взвеси при длине волны 700-800 нм должна равняться 0,560±0,010 после ее разбавления в 8 раз физиологическим раствором. В термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят 0,6 мл физиологического раствора, прогревают кювету в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм. Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует контрольной скорости гемолиза (скорость гемолиза без пробы) - Vк (dE 800/мин). В другую термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят изотонический водный раствор детергента (пробу) до объема 0,6 мл. Кювету прогревают в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм.
Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует опытной скорости гемолиза (скорости гемолиза в присутствии пробы) - Vo (dE 800/мин).
Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.
Пример 1. Определение метилметакрилата (токсический компонент костного цемента и некоторых пластмасс). Для определения метилметакрилата по предлагаемому способу были использованы различные концентрации 1%-ного раствора метилметакрилата в физиологическом растворе (пробы). Результаты представлены в табл.1.
Таблица 1 Результаты определения метилметакрилата в пробе | |||
Концентрация метилметакрилата (мкМ) | Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ800/мин) | Скорость гемолиза по прототипу (dЕ800/мин) | |
Vк | Vo | ||
1,2 | 0,020 | 0,031 | 0 |
2,4 | 0,020 | 0,040 | 0 |
3.6 | 0,020 | 0,053 | 0 |
4.8 | 0,020 | 0,065 | 0 |
Из табл.1 видно, что по заявляемому способу во всех пробах при малых концентрациях метилметакрилата регистрируется повышение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента (Vo выше Vк). По способу - прототипу скорость гемолиза в присутствии пробы не регистрируется. Следовательно, чувствительность предлагаемого способа выше по сравнению с прототипом.
Возможно количественное определение метилметакрилата в пробе. Измельченный образец пластмассы - 0,5 г полиметилметакрилата инкубировали в течение трех часов в 2 мл физиологического раствора при постоянном перемешивании для извлечения несвязавшегося мономера в изотонический водный раствор. Количественное определение монометилметакрилата в пробе осуществляли путем регистрации Vo в присутствии надосадочной жидкости (пробы) и Vк без пробы. Получены следующие значения: Vo=0,031 dЕ 800/мин; Vк=0,020 dE 800/мин (см. табл.1). По экспериментальным данным, представленным в табл.1, коэффициент пересчета К=111 мкМ/dЕ 800/мин. В соответствии с расчетной формулой содержание метилметакрилата (Х) в пробе составляет:
Х=111(0,031-0,020)=1,2 (мкМ)
Пример 2. Определение сапонина в пробе.
Пороговая концентрация гемолитического действия сапонина фирмы “Merk” определена экспериментально и составляет 7 мкг/мл. Для исследования выбрана подпороговая концентрация сапонина - 3 мкг/мл. Результаты определения сапонина в пробе (0,125% изотонический раствор сапонина (“Merk”)) по заявляемому способу и по прототипу представлены в табл.2.
Таблица 2 Результаты определения сапонина в пробе | |||
Концентрация сапонина (мкг/мл) | Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ 800/мин) | Скорость гемолиза по прототипу (dЕ 800/мин) | |
Vк | Vo | ||
3 | 0,020 | 0,053 | 0 |
Из табл.2 видно, что при концентрации детергента (сапонина) меньше пороговой, в присутствии пробы регистрируется только повышение скорости кислотного гемолиза по заявляемому способу. Скорость детергентного гемолиза по способу - прототипу не регистрируется, то есть детергент не выявляется. Это еще раз подтверждает более высокую чувствительность заявляемого способа.
Заявляемый способ позволяет не только повысить чувствительность определения детергента в пробе, но и уменьшить трудозатраты для проведения анализа. Так в прототипе требуется длительная инкубация (1-6 часов) детергента с эритроцитами и по ходу инкубации отбор контрольной и опытной проб, их центрифугирование и определение оптической плотности. В предлагаемом способе регистрация динамики гемолиза может быть компьютеризирована и продолжается от 10 до 30 минут.
Способ определения детергента в пробе, включающий регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, отличающийся тем, что предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.