Способ определения следов крови по реакции окисления 3,3`, 5,5`-тетраметилбензидина
Способ определения относится к области медицины. Определение следов крови проводят в водно-этанольной среде (5-20% объемных этанола) при концентрации (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) ТМБ (4-8)·10-4 М, H2O2 - 0,1-0,4 М, в присутствии 10-4-10-2 М этилендиаминтетраацетата. При наличии следов крови раствор приобретает сине-зеленую окраску. Мешающие определению крови ионы железа маскируются этилендиаминтетраацетатом. Исходный раствор ТМБ готовят в этаноле, благодаря чему эти растворы устойчивы при хранении более месяца, сохраняя чувствительность к определению крови. Раствор для проведения реакции готовят непосредственно перед анализом, смешивая 5-20 объемных частей этанольного раствора ТМБ с 95-80 объемными частями водного раствора Н2О2 и этилендиаминтетраацетата. Этим достигается устойчивость растворов ТМБ. Способ прост, безопасен и имеет избирательную способность определения следов крови в присутствии ионов железа. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области химических методов обнаружения следов крови и может быть использовано в медицине, в том числе для контроля качества предстерилизационной очистки инструментов.
Известен способ определения следов крови с применением тетраметилбензидина (ТМБ), основанный на проведении определения в цитратном буферном растворе (Liem H.H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388). Исходный раствор ТМБ готовят в 10% уксусной кислоте. Недостатком метода является относительная сложность приготовления многокомпонентной системы растворов и неустойчивость растворов ТМБ в 10% уксусной кислоте растворы приобретают синюю окраску уже через день и становятся непригодными для анализа.
Известен способ определения следов крови с применением ТМБ в ацетатном или цитратном буферном растворе с применением в качестве стабилизатора ТМБ 40% раствора метанола (Eur. Pat. Appl. EP 279614 С1, С 12Q 1/28, 24 Aug. 1988). Данный способ мало пригоден для широкого применения из-за токсичности метанола и сложности приготовления многокомпонентной системы растворов.
Описан способ определения крови, в котором для стабилизации растворов ТМБ добавляют 5-20% N-метилпиразолона (РСТ Int. Appl. Wo 8505688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985). Это приводит к усложнению композиции, удорожанию анализа. Между тем, для применения в лечебно-профилактических учреждениях необходимо применение максимально простых средств, растворов с минимальным числом компонентов.
Известен способ определения следов крови с применением ТМБ, основанный на приготовлении исходного раствора ТМБ в ледяной уксусной кислоте и проведении реакции окисления субстрата также в ледяной уксусной кислоте. Это техническое решение является наиболее близким к заявляемому по технической сущности, поскольку предназначено для экспрессного обнаружения следов крови с применением только одного органического растворителя. Однако метод имеет существенный недостаток, так как растворы ТМБ при хранении спонтанно окисляются и синеют, при этом чувствительность обнаружения крови снижается в 10 раз за 24 часа (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816). Кроме того, уксусная кислота проявляет коррелирующее действие на металлические инструменты и поэтому непригодна для медицинской практики.
Целью изобретения является упрощение состава растворов и процедуры анализа, достижение стабильности растворов ТМБ и избирательности обнаружения следов крови в присутствии ионов железа.
Указанная цель достигается предложенным способом определения следов крови, заключающимся в том, что реакция проводится в среде этанол-вода при концентрации этанола 5-20% (объемных), исходный раствор ТМБ готовится в этаноле, реакция проводится в присутствии 10-4-10-2 М и двунатриевой соли ЭДТА.
Сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами и графиками (фиг.1, фиг.2).
Пример 1. В пробирку вместимостью 15-20 мл приливают 0,5 мл 8·10-3 М (1,92 мг/мл) раствора ТМБ в этаноле и 9,5 мл 0,1 М (0,36%) раствора пероксида водорода, содержащего 10-4 М ЭДТА. Концентрации в рабочем растворе составляют: ТМБ - 4·10-4 М (0,096 мг/мл), этанола 5% (объемных), Н2О2 0,1 М (0,34%), ЭДТА 10-4 М. В полученный раствор прибавляют 0,1 мл раствора крови (1:1000). Через 1-2 минуты наблюдают появление окраски. Содержание крови можно определять количественно, фотометрируя растворы при длине волны 650 нм.
Пример 2. В пробирку вместимостью 15-20 мл приливают 2 мл 5·10-3 М (1,2 мг/мл) раствора ТМБ в этаноле, приливают 8 мл 0,5 М (1,7%) раствора Н2О2, содержащего 1,25·10-2 М ЭДТА. В полученном рабочем растворе концентрация ТМБ составляет 1·10-3 М (0,24 мг/мл, Н2О2 - 0,4 М (1,36%), ЭДТА - 1·10-2 М.
В ячейки планшета из прозрачного полистирола для иммунологических исследований (объем ячеек 0,3-0,4 мл) приливают по 0,1-0,2 мл полученного рабочего раствора и добавляют соответственно 0,005; 0,01; 0,02; 0,03 и 0,05 мл раствора крови с концентрацией 100 мкг/мл. Растворы перемешивают пластмассовой палочкой и через 1 минуту наблюдают изменение окраски на белом фоне. Сине-зеленая окраска хорошо заметна глазу при содержании крови 0,5-1 мкг.
Пример 3. В медицинский шприц набирают 0,3-0,4 мл раствора с концентрациями: этанола 20%, ТМБ 8·10-4 М, Н2О2 - 0,3 М, ЭДТА 1·10-2 М, обмывают стенки шприца раствором и вытесняют раствор в ячейку из прозрачного полистирола. При содержании крови менее 0,5 мкг через 1-2 минуты раствор остается бесцветным. При содержании крови 0,5-1,0 мкг через 1 минуту наблюдается хорошо заметная сине-зеленая окраска раствора в ячейке.
В таблице 1 приведена сравнительная характеристика предлагаемого способа и прототипа (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) по чувствительности и устойчивости растворов ТМБ в уксусной кислоте (прототип) и этаноле (предлагаемый способ).
| Таблица 1. | |||
| Влияние времени хранения растворов ТМБ в уксусной кислоте (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) и этаноле на чувствительность обнаружения крови | |||
| Прототип /4/ | Предлагаемый метод | ||
| время, сутки | чувствительность | время, сутки | чувствительность, М |
| 1 | 1·10-6 | 1 | 1·10-6 |
| 2 | 1·10-5 | 2 | 1·10-6 |
| 5 | 1·10-5 | 5 | 1·10-6 |
| 8 | 1·10-4 | 8 | 1·10-6 |
| 30 | 1·10-6 |
Из таблицы видно, что устойчивость растворов ТМБ в этаноле более 1 месяца. В уксусной кислоте чувствительность ТМБ снижается в 100 раз уже через 8 дней.
Изучено влияние концентрации этанола, ТМБ и пероксида водорода на увеличение оптической плотности растворов в ходе реакции. Оптическую плотность растворов измеряли на фотоколориметре КФК-2 в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см со светофильтром, имеющим максимум пропускания в области 670 нм. Объем раствора 5 мл. Предварительно было установлено, что продукты окисления ТМБ имеют максимум в области 650 нм, что совпадает с данными (Антитела. Методы. Кн. 2, ред. Д.Кэтти. М., Мир, 1991, с.156).
Зависимость оптической плотности растворов через 1 минуту после начала реакции от концентрации этанола, ТМБ и Н2О2 показана на фиг.1 и 2. В интервале концентраций этанола 5-20% достигается максимальное значение А670 и соответственно чувствительность определения крови.
Увеличение концентрации ТМБ в интервале (4-10)·10-4 М и Н2О2 в интервале 0,1-0,4 М лишь незначительно увеличивает оптическую плотность растворов. Эти условия являются оптимальными для определения следов крови.
Влияние концентрации ЭДТА на определение крови в присутствии ионов железа (II, III) показано в таблице 2. Видно, что в присутствии 10-4-10-2 М ЭДТА мешающее влияние ионов железа устраняется.
| Таблица 2 | |||
| Маскирующее действие ЭДТА при определении крови. Концентрации ТМБ - 4·10-4 М, Н2O2 - 0,3 М, объем раствора 5 мл. | |||
| Введено Fe (III), мкг | Введено крови, мкг/мл | Введено ЭДТА М | Найдено крови, мкг/мл |
| - | 5 | 1·10-4 | 5,3±0,4 |
| - | 10 | 1·10-2 | 10,1±0,5 |
| 1 | - | - | 200 |
| 1 | 5 | 1·10-4 | 5,6±0,5 |
| 2 | - | 1·10-4 | 0,0±0,1 |
| 2 | 5 | 1·10-4 | 5,2±0,3 |
| 2 | 5 | 1·10-3 | 5,1±0,2 |
| 2 | 10 | 1·10-2 | 11,1±0,5 |
| 1 | 5 | 1·10-2 | 5,2±0,4 |
ЛИТЕРАТУРА
1. Liem H.H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388.
2. Eur. Pat. Appl. EP 279614 C1, С 12 Q 1/28, 24 Aug. 1988.
3. PCT Int. Appl. Wo 85 05.688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985.
4. Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816.
5. Антитела. Методы. Кн. 2, ред. Д.Кэтти. М.: Мир, 1991, с.156.
1. Способ определения следов крови, отличающийся тем, что определение проводят раствором, содержащим 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (4-8)·10-4 М, пероксид водорода - 0,1-0,4 М, этилендиаминтетраацетат 1·10-4 - 1·10-2 М, этанол 5-20% и по изменению цвета раствора на сине-зеленый определяют наличие следов крови.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор для определения готовят непосредственно перед анализом путем смешивания 5-20 объемов спиртового раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с 95-80 объемами водного раствора пероксида водорода, содержащего этилендиаминтетраацетат.
