Фосфолипидные комплексы проантоцианидина а2 в качестве антиатеросклеротических агентов
Предложено: фосфолипидные комплексы проантоцианидина А2 и фармацевтические композиции на их основе в качестве антиатеросклеротических агентов, агентов для профилактики и лечения инфаркта миокарда и головного мозга. Фосфолипиды комплекса предпочтительно выбирают из лецитинов, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина. Изобретение обеспечивает средство для лечения перечисленных заболеваний путем уменьшения количества и тяжести атероматозных бляшек, уменьшения обструкции сонных артерий и уменьшения толщины сосудистых стенок. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 22 ил.
ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к фосфолипидным комплексам проантоцианидина А2 или экстрактам, обогащенным проантоцианидином А2, и к их применению для изготовления лекарственных средств для профилактики и лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга.
Проантоцианидин А2 или 8,14-метан-2Н,14Н-1-бензопиран-[7,8-d][1,3]бензодиоксоцин-3, 5, 11, 13, 15-пентол-2,8-бис-(3,4-дигидроксифенил) 3, 4-дигидро [2R-2α, 3α, 8β, 14β, 15R)] формулы (I)
был выделен из семян Aesculus hippocastanum (Tetrahedron Lett., 429, 1966). Терапевтическое применение проантоцианидина А2 в качестве рубцующего, цитозащитного, противоязвенного, венотонического, вазозащитного и антипероксидативного агента описано а ЕР-А-210785 (4 февраля 1987 г.).
В настоящее время неожиданно было установлено, что фосфолипидные комплексы проантоцианидина А2 обладают выраженной антиатеросклеротической активностью как у животных, так и у человека при системном введении, предпочтительно, пероральным путем.
Комплексы по настоящему изобретению могут состоять из натуральных синтетических фосфолипидов, таких как лецитины, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин. Соотношение проантоцианидина А2 и фосфолипидов изменяется от 2:1 до 1:2, и, предпочтительно, составляет около 1:1,5 масс/масс. Особенно предпочтительным комплексом является комплекс с фосфатидилхолином сои.
Комплексы по настоящему изобретению получают взаимодействием раствора фосфолипида и раствора проантоцианидина А2 в подходящих растворителях, таких как ацетон, этилацетат, этанол, с последующей концентрацией реакционной смеси при пониженном давлении, с получением густого остатка, который можно размалывать.
Комплексы по настоящему изобретению в зависимости от доз предотвращают или уменьшают образование атеросклеротических бляшек. Указанная активность наблюдалась на кроликах, которые получали гиперхолестеринемический рацион для того, чтобы вызвать образование атеросклеротических повреждений, подобных таким повреждениям у человека, на сосудистом уровне, особенно, в дуге аорты, брюшной аорте, сонных артериях и сосудах головного мозга. На указанной модели вышеупомянутые фосфолипидные комплексы изменяют состояние сосудов на макро- и микуровнях, уменьшая, по сравнению с нелеченными животными как количество, так и тяжесть атероматозных бляшек, с удивительно благоприятным действием на сосуды и ткани. На другой модели атеросклероза, с целью защиты головного мозга, когда просвет внутренней сонной артерии кролика уменьшали хирургическим путем, а животные получали гиперхолестеринемический рацион, богатый насыщенными жирами, наблюдалось уменьшение обструкции сонных артерий, уменьшение толщины сосудистых стенок и повышение выживаемости животных. У пациентов, страдающих атеросклерозом, после шести месяцев лечения наблюдалось уменьшение обструкции сонных артерий, вызванной атероматозными бляшками, и улучшение кровотока через сонные артерии, что оценивали с помощью допплеровского ультразвукового исследования.
Фосфолипидные комплексы проантоцианидина А2 можно применять в виде лекарственных форм, подходящих для перорального введения, таких как таблетки, мягкие и твердые желатиновые капсулы, в дозах, в интервале от 50 до 500 мг, два - три раза в день, в зависимости от тяжести заболевания. Изготовление препаративных фармацевтических форм можно осуществлять с использованием обычных технологий и наполнителей.
Следующие ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение более подробно.
Пример 1
Получение комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином
К раствору 1577 г фосфатидилхолина в 5 литрах этилацетата с температурой 70° добавляли раствор 1 кг проантоцианидината с температурой 70° добавляли раствор 1 кг проантоцианидина А2 в 5 литрах ацетона.
Смесь кипятили с обратным холодильником при перемешивании и выпаривали до сухости в вакууме. Остаток высушивали в вакууме при температуре 50°С в течение 24 ч, затем размалывали до получения частиц желаемого размера.
Пример 2
32 новозеландских кролика разделяли на 4 группы по 8 животных в каждой и обрабатывали следующим образом:
Группа 1): контроль, нормальный рацион
Группа 2): гиперхолестеринемический рацион (0,2 мас.% холестерина)
Группа 3): гиперхолестеринемический рацион + фосфолипидный комплекс проантоцианидина А2, экстракт (0,2 мас.% холестерина +2 мас.% комплекса примера 1).
Группа 4): гиперхолестеринемический рацион + экстракт проантоцианидина А2 (0,2 мас.% холестерина + проантоцианидин А2 в количестве, эквивалентном тому, которое имеется в 2 мас.% комплекса примера 1).
Спустя 8 недель лечения, в ходе которого измеряли уровни холестерина, ЛПНП/ЛПОНП, ЛПВП и триглицеридов, животных умерщвляли.
Оценивали количество, размер и распределение атеросклеротических повреждений в грудной и брюшной аорте.
Полоски аорты фиксировали и окрашивали Суданом IV для визуализации повреждений и оценки сосудистого холестерина и содержания окисленного холестерина с помощью газовой хроматографии.
Результаты, представленные в следующей таблице, доказывают, что лечение фосфолипидными комплексами проантоцианидина А2 заболеваний статистически достоверным образом уменьшает атеросклеротические повреждения, индуцированные гиперхолестеринемическим рационом.
| Таблица | |
| Лечение | Процент площади повреждения |
| Группа 1 | 0,5% |
| Группа 2 | 34% |
| Группа 3 | 7,5%* |
| Группа 4 | 30% |
*р<0,01 по сравнению с группой 2.
Пример 3
Капсулы, содержащие 500 мг фосфолипидного комплекса проантоцианидина А2.
Состав:
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 150 мг
Лактоза 57 мг
Модифицированный крахмал 40 мг
Стеарат магния 3,0 мг
Пример 4
Энтеросолюбильные таблетки
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 200 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 118 мг
Осажденный диоксид кремния 3 мг
Стеарат магния 4 мг
Анионный полимер метакриловой кислоты
и его сложные эфиры 12 мг
Тальк 8 мг
Карбонат магния 8 мг
Кукурузный крахмал 5 мг
Аравийская камедь 159 мг
Пример 5
Мягкие желатиновые капсулы
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 216 мг
Арахисовое масло 209 мг
Частично гидрогенизированные растительные масла 100 мг
Лецитин сои 5 мг
Пример 6
Данные физико-химических исследований комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином при массовом соотношении 1:1,5 (масс/масс)
Обозначения
Проантоцианидин А2 представляет собой димер эпикатецина типа А, а именно эпикатецин-(2β→7, 2β→7)-эпикатецин, в котором две единицы эпикатецина связаны через С-4 - С-8 и С-2 - О-7 связи.
Фосфатидилхолин (торговое наименование (Phospholipon® 90G) представляет собой очищенный фосфатидилхолин, полученный из лецитина сои.
Ниже представленные данные растворимости, термогравиметрического/дифференциального термического анализа (профиль ТГ/ДТА), ИК-спектроскопии, 1Н-ЯМР и 13С ЯМР спектроскопии для комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином при массовом соотношении 1:1,5 (масс/масс) индивидуальных соединений проантоцианидина А2 и фосфатидилхолина, а также для физической смеси фосфатидилхолином в том же весовом соотношении.
1. Профиль растворимости
Растворимость комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином в сравнении со смесью проантоцианидин А2/фосфатидилхолин испытывали в соответствии с методикой, описанной в Eur.Ph., III Ed.
| Полученные результаты представлены в таблице. | |||
| толуол | хлороформ | вода | |
| проантоцианидин А2 | нерастворим | нерастворим | нерастворим |
| фосфатидилхолин | легкорастворим | легкорастворим | нерастворим |
| комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином | нерастворим | легкорастворим | нерастворим |
| смесь проантоцианидин А2/ фосфатидилхолин | слаборастворима | нерастворима | нерастворима |
2.Термический анализ
Методика и оборудование
Установка для термогравиметрического/дифференциального термического анализа (ТГ/ДТА) Seiko 6200 с программой EXTAR 6000 ver. 5.7, с использованием открытого алюминиевого тигля (⊘ 6 мм). Поток тепла регистрировали от 25°С до 300°С с линейной скоростью нагрева 5°С/мин под током азота 200 мл/мин. ТГ/ДТА нормализовали на основе массы.
Проантоцианидин А2
ТГ/ДТА профиль (термогравиметрический/дифференциальный термический анализ) показывает высвобождение растворителя кристаллизации при 96°С с соответствующей потерей массы 7,2%, что согласуется с бигидратом. Процесс разложения наблюдают после 240°С с пиком ДТА при 241,7° (Фиг.1).
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином
Профиль не показывает эндотермического пика из-за потери растворителя кристаллизации. Потеря при сушке, составляющая 2,57%, может быть отнесена за счет потери несвязанного растворителя. Процесс разложения начинается при примерно 200°С с переходом при 258,3°С. Твердое состояние проантоцианидина А2 в фитосоме отличается от чистого вещества (Фиг.2).
Смесь проантоцианидин А2/фосфатидилхолин
Хотя термический профиль показывает поведение, подобное наблюдаемому для проантоцианидина А2, наблюдали потерю растворителя кристаллизации (8,15%) с переходом при 108,7°С с последующей дополнительной потерей растворителя (например, воды в липидах). Общая потеря массы составила 9,66%. Твердое состояние отличается, и никакого перехода не происходит при температуре выше 240°С (Фиг.3).
3. Инфракрасный спектр
Методика и оборудование
ИК-спектры записывали на спектрометре Маgnа 550 Series II с Фурье преобразованием. Спектры проантоцианидина А2 и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином получали с использованием пластины КВг (степень чистоты для спектроскопии), спектры фосфатидилхолина и смеси проантоцианидин А2/ фосфатидилхолин - в ячейке NaCl. Оборудование было снабжено оптической скамьей, стандартным детектором DTGS, расщепителем КВr и программой OMNIC ver. 5.1. Спектр получали как результат сбора и преобразования совокупности 32 сканов в области спектра 4000-400 см-1, при разрешении 4 см-1.
Фосфатидилхолин
Инфракрасный спектр (Фиг.4, 5) показывает симметричные и асимметричные вытянутые полосы для групп СН2 при 2852 и 2924 см-1, глубокую полосу поглощения группы СН2 при 1466 см-1, и вытянутую полосу для С=О при 1736 см-1, симметричные и асимметричные вытянутые полосы поглощения фосфатной группы при 1088 и 1236 см-1. При 968 см-1 присутствует также полоса, показывающая внеплоскостной изгиб ("извивы") С-Н на трансдвойной связи. Это согласуется с составом ацильных остатков (олеиновой кислоты 10±3%, линолевой кислоты 66±5%, линоленовой кислоты 5±3%), известным для данного продукта.
Проантоцианидин А2
Основные полосы поглощения представляют сильное искривление для Н-О-Н при 1630-1610 см-1 (это согласуется с бигидратом), глубокую полосу поглощения СН2 при около 1470 см-1, вытянутые полосы поглощения фенольной и спиртовой группы С-ОН при 1247 и 1112 см-1, соответственно (Фиг.6, 7).
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином
Инфракрасный спектр показывает вытянутую полосу поглощения группы С=О при 1735 см-1, изгиб Н-О-Н при 1618 см-1. Две сильные полосы поглощения наблюдали при 1076 и 1203-1179 см-1. Эти полосы приписывают сдвигу к более низким волновым числам симметрической и антисимметрической вытянутых полос поглощения фосфатной группы. Также присутствует полоса поглощения ненасыщенного ацильного остатка при 969 см-1 (Фиг.8, 9).
Смесь проантоцианидин А2/ фосфатидилхолин
Инфракрасный спектр показывает широкие полосы поглощения в области 1300-900 см-1, без присутствия двух полос при 1076 и 1203-1179 см-1. Кроме того, полосы поглощения при 1088 и 968 перекрываются полосами поглощения фосфатидилхолина (Фиг.10, 11).
ИК-спектры четырех рассматриваемых продуктов представлены на Фиг.12, 13.
4. Спектры 1Н-ЯМР
Методика и оборудование
Спектры ЯМР получали в CDCl3 или ДМСО-d6 (чистота для анализа ЯМР) при 300 МГц (1Н) на установке VARIAN INOVA 300 МГц с программой VNMRTM ver. 6.1.b, снабженной 5 мм переключаемым широкополосным датчиком. Использовали трубку Wilmad 528-PP (7"×5 мм). Температура 30°С.
Мультиплетность атомов углерода устанавливали с использованием эксперимента DEPT (неискажаемое усиление при переносе поляризации).
Химические сдвиги соотносили с тетраметилсиланом (чистота для анализа ЯМР) при 0 м.д. в качестве внешнего стандарта.
Спектры фосфатидилхолина и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином можно получать в CDCl3, тогда как спектр проантоцианидина A2 получают в ДМСO-d6, в соответствии с профилем растворимости.
Фосфатидилхолин (Спектр 1H-ЯМР на Фиг.14)
- концевая метильная группа при 0,93 м.д.
- СН2 на основной длинной цепи при 1,32, 1,64, 2,09, 2,34 и 2,81 м.д.
- NMe
| + |
| 3 |
- протоны на двойных связях и сложноэфирной группе при около 5,3-5,4 м.д.
- мультиплеты при 4,16-4,42 м.д.: СН и СН2 на глицериновой части.
Проантоцианидин А2 (Спектр 1H-ЯМР на Фиг.15)
Протонный спектр, полученный в ДМСО-d6, показывает следующие сигналы:
| Н | М.д. | J (Гц) |
| 3 | 3,87 | т (3,8) |
| 3-ОН | 5,22 | Д (4,4) |
| 4 | 4,33 | д(3,5) |
| 6 | 5,89 | Д (2,2) |
| 8 | 5,94 | Д(2,2) |
| 2' | 4,83 | С |
| 3' | 4,14 | М |
| 3'ОН | 4,65 | Д(4,4) |
| 6' | 6,01 | с |
| 4'-На | 2,81 | Дд (18,0; 4,6) |
| 4'-Hb | 2,59 | Дд (18,0; 1,8) |
| 12, 12', 15,15',16' | 6,75 | Д (8,0) |
| 6,76 | Д (8,2) | |
| 6,87 | Дд (8,3 2,3) | |
| 7,01 | Дд (8,8, 1,9) | |
| 7,03 | Д (2,1) | |
| 7,09 | Д (1,9) | |
| ОН (фенольная) | 8,10 8,69, 8,79, | с (ушир.) |
| 8,90, 9,07, 9,29 |
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином (Спектр 1H-ЯМР на Фиг.16)
Спектр показывает очень широкие сигналы с отсутствием разрешения, что согласуется с сильным изменением времени релаксации протонов. Сигнал, соответсвующий полярной головной группе NMе
| + |
| 3 |
Спектр комплекса, полученный после добавления ДМСО-d6 (Фиг.17), показывает резонанс и фосфатидилхолина и проантоцианидина A2. Добавление полярного растворителя влияет на взаимодействие между двумя молекулами с получением спектра с узкими пиками, соответствующими смеси двух веществ без взаимодействия.
Спектрограммы представлены на Фиг.18.
5. Спектры 13С ЯМР
Методика и оборудование
Спектры ЯМР получали в СDСl3 или ДМСО-d6 (чистота для анализа ЯМР) при 75 МГц (13С) на установке VARIAN INOVA 300 МГц с программой VNMRTM ver. 6.1.b, снабженной 5 мм переключаемым широкополостным датчиком. Использовали трубку Wilmad 528-PP (7"×5 мм). Температура 30°С.
Мультиплетность атомов углерода устанавливали с использованием эксперимента DEPT (неискажаемое усиление при переносе поляризации).
Химические сдвиги соотносили с тетраметилсиланом (чистота для анализа ЯМР) при 0 м.д. в качестве внешнего стандарта.
Спектры фосфатидилхолина и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином можно получать в СDСl3, тогда как спектр проантоцианидина А2 получают в ДМСО-d6, в соответствии с профилем растворимости.
Фосфатидилхолин (Спектр 13С-ЯМР на Фиг.19)
- карбоксильные группы при 173,8, 173,7 и 173,4 м.д.
- олефиновые углерода (основной длинной цепи) при 128,1, 128,3, 129,9, 130,2 и 130,4 м.д.
- метиновая группа глицерина, дублет (связывание с фосфором) при 70,8 и 70,7 м.д. (Jc-p=7,4 Гц)
- метиленовая группа глицерина, дублеты (связывание с фосфором) при 66,6 и 66,5 м.д. (Jc-p=7,5 Гц) и при 63,7 и 63,6 м.д. (Jc-p=5,5 Гц)
- метилен на карбоксильной группе (RO-CH2-CHOR-CH2-OP) при 63,2 м.д., без связывания С-Р
- метилен, содержащий группу азота при 59,6 м.д. (как С-Р связанный дублет, Jc-p=4,8 Гц)
- группа тетраметиламмония при 54,6 м.д.
- метиленовые группы на основной длинной цепи в области 34,5-22,8 м.д.
- концевые метильные группы на длинноцепочечной основной цепи при 14,3 м.д.
Проантоцианидин А2 (Спектр 13С-ЯМР на Фиг.20)
Спектр, полученный в ДМСO-d6, показывает следующие сигналы
| С | м.д. | мультиплетность | C | м.д. | Мультиплетность |
| 2 | 106,3g | С | 2' | 80,0 | Д |
| 3 | 66,8 | Д | 3' | 65,2 | Д |
| 4 | 28,4 | Д | 4' | 30,0 | Т |
| 5 | 155,6a | С | 5' | 153,5 | с |
| 6 | 97,2 | Д | 6' | 95,3 | Д |
| 7 | 156,8a | с | 7' | 151,1a | с |
| 8 | 93,5 | Д | 8' | 101,8g | С |
| 9 | 157,2a | С | 9' | 151,8a | С |
| 10 | 103,4g | С | 10' | 99,2 | С |
| 11 | 131,6c | С | 11' | 130,7c | С |
| 12 | 115,4e | Д | 12' | 115,4e | Д |
| 13 | 146,1b | С | 13' | 145,2d | С |
| 14 | 145,4b | С | 14' | 145,0b | С |
| 15 | 115,6e | Д | 15' | 115,9e | Д |
| 16 | 118,6d | Д | 16' | 119,5d | Д |
Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином (Спектр 13С-ЯМР на Фиг.21)
Спектр показывает широкие сигналы с отсутствием разрешения, что согласуется с сильным изменением времени релаксации атомов углерода. Резкий сигнал, соответствующий полярной головной группе NHMe
| + |
| 3 |
Как уже описывалось в §4, добавление ДМСО-d6 (Фиг.22) обеспечивает распад комплекса, образованного двумя молекулами, с получением спектра, в котором эти два вещества легкораспознаваемы.
ВЫВОДЫ
Представленные данные свидетельствуют о том, что комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином представляет собой продукт, в котором полярная головная группа липидной фракции вступает в сильное взаимодействие с молекулой проантоцианидина А2. Ацильные группы длинной цепи фосфатидилхолина не вовлечены в комплексообразование. Характерной особенностью комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином является повышенная липофильность, как продемонстрировано профилем растворимости, что обеспечивает быстрое растворение проантоцианидина А2 в неполярных растворителях, таких как хлороформ и толуол. Комплекс может быть разрушен добавлением полярного растворителя, который изменяет процесс взаимодействия между двумя веществами. Экспериментальные данные с очевидностью показывают различие между комплексом и смесью проантоцианидина А2/ фосфатидилхолин.
1. Комплексы фосфолипидов и проантоцианидина А2.
2. Комплексы по п.1, в которых фосфолипиды выбирают из лецитинов, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина.
3. Комплексы по п.2, в которых фосфолипид представляет собой фосфатидилхолин.
4. Комплексы по любому из пп.1-3, в которых массовое соотношение проантоцианидина А2 и фосфолипида находится в интервале от 2:1 до 1:2.
5. Комплексы по любому из пп.1-4 в качестве активного агента для профилактики или терапевтического лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга.
6. Фармацевтическая композиция для профилактики и терапевтического лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга, включающая в качестве активного ингредиента комплекс по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Фармацевтическая композиция по п.6 в виде стандартной дозы, включающей от 50 до 500 мг активного ингредиента.
8. Фармацевтическая композиция по п.6 или 7 для перорального введения.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-8 в форме мягких или твердых желатиновых капсул или таблеток.
