Порошкообразные композиции униламеллярных липосом

 

Изобретение относится к области фармакологии и касается порошковых композиций стабилизированных униламеллярных липосом. Изобретение заключается в том, что содержит по меньшей мере одну внешнюю липидную фазу и внутреннее водное полярное ядро, желатинированное при комнатной температуре, способ их получения, а также их применение в качестве пищевых добавок и в фармацевтических композициях, предназначенных для перорального введения (действие на липемию). Названные композиции состоят главным образом из униламеллярных липосом, содержащих внешнюю липидную фазу, состоящую в основном из липидов класса 4 (фосфолипидов) и внутреннего водного ядра, состоящего преимущественно из смеси М по меньшей мере двух различных неполимеризующихся гелеобразующих агентов G1 и G2, характеризующихся точкой фазового перехода гель-золь, выше или равной 37^oС, при условии, что G1 представляет собой гелеобразующий агент, выбираемый из желатина и каррагенанов, а G2 выбирают из каррагенанов, при этом липосомы имеют диаметр от 20 нм до 1 μм, преимущественно от 50 до 500 нм, и представлены в форме частиц со средним диаметром от 10 до 1000 μм, образованных из одной или нескольких названных выше липосом, покрытых оболочкой, выбранной из группы, в которую входят обезвоженный термообратимый водный гель, идентичный водному гелю внутреннего ядра, декстрины или смесь декстринов. Изобретение обеспечивает получение стабильной порошковой композиции на основе липосом. 7 с. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл.

Настоящее изобретение относится к стабилизированным порошковым композициям униламеллярных липосом, содержащих по меньшей мере одну внешнюю липидную фазу и внутреннее водное полярное ядро, желатинированное при комнатной температуре, к способу их получения, а также к их применению в качестве пищевых добавок и в фармацевтических композициях (действие на липемию).

Липосомы с внутренним желатинированным ядром в суспензии в водной среде, содержащие в малых концентрациях желатинирующие вещества, были описаны J.C. Hauton, который дал им название "липогелосомы"®. Он, в частности, разработал способ получения таких липосом, или липогелосом (Европейский патент 0393049), которые отличаются от классических липосом тем, что инкапсулированная водная фаза находится не в жидкой, а в полутвердой гелевой форме, что препятствует слиянию липосом при их столкновениях. Такие липогелосомы получают исключительно на основе природных веществ, что минимизирует вероятность их непереносимости. В частности, в Европейском патенте 0393049 описаны липогелосомы, состоящие из межфазного бислоя в случае униламеллярных липогелосом или из нескольких концентрически расположенных межфазных бислоев в случае мультиламеллярных липогелосом и инкапсулированной внутренней желатинированной полярной водной фазы, в которой полимеризуемое или неполимеризуемое желатинированное вещество выбирают из полисахаридов, полипептидов или полиакриламидов; например, неполимеризуемое желатинируемое вещество может быть выбрано из желатина, агарозы, каррагенанов, а желатинируемое полимеризуемое вещество выбирают из полиакриламидных гелей. Названные липогелосомы обладают значительно более высокой стабильностью по сравнению с обычными липосомами, в частности, в отношении слияния при столкновении частиц.

Однако липогелосомы обладают тем недостатком, что они находятся в жидкой форме, не пригодной для приготовления твердых составов, удобных при хранении и фармацевтическом применении.

Заявитель в настоящей работе обнаружил, что, выбирая липиды внешней липидной фазы, с одной стороны, и гелеобразователи, с другой стороны, можно получить стабилизированные порошкообразные липогелосомы, обладающие особо привлекательными свойствами в качестве пищевых добавок и в качестве лекарственных средств, предназначенных для перорального введения с целью профилактики гиперлипемий (гиперхолестеринемий или гипертриглицеридемий), такие стабилизированные порошкообразные липогелосомы могут либо вводиться непосредственно пероральным путем, либо могут быть легко растворены в водной фазе непосредственно перед применением.

Сердечно-сосудистые заболевания являются главной причиной смертности и заболеваемости как во Франции, так и во всех индустриальных странах и представляют собой настоящее финансовое бремя (30 миллиардов франков в 1992 г.). Эти цифры настораживают: 36,4% всех смертей обусловлены сердечно-сосудистыми болезнями, из которых 20% возникают из-за патологий сердца и 12% из-за несчастных случаев церебрально-сосудистого происхождения. С целью сравнения укажем, что далее следует смертность, обусловленная различными формами рака, и насильственные смерти (случайные или умышленные), доли которых составляют соответственно 24,2 и 9,4%. Подобная частота кардио-церебрально-сосудистых случаев в странах Запада делает атеросклероз главным социально-экономическим бичом в сфере здравоохранения.

Из сказанного выше следует, что необходима долгосрочная профилактика. Снижения холестеринемии можно достичь соблюдением гиполипидной диеты с использованием, или без использования фармакологических продуктов. Наиболее широко используемым лицами из группы риска (страдающими очень сильной холестеринемией) средством является связывание в кишечнике солей желчных кислот с помощью холестирамина, а продолжительное лечение этой синтетической смолой, как показали исследования, снижает частоту сердечных осложнений (B.M. Rifkind, Atherosclerosis reviews, 1987, 18, 59-70). Однако планирование долгосрочной систематической профилактики с применением этого продукта представляется затруднительным по причине трудностей в обращении с продуктом и из-за малоприемлемого для больных побочного действия.

Строгая гиполипидная диета представляется наиболее эффективным средством для лечения конститутивного атеросклероза, но опыт показывает, что такое лечение чаще всего невозможно, так как принесение в жертву гастрономического удовольствия затрагивает качество жизни и при этом затруднительно в исполнении в контексте повседневной жизни общества в развитых странах.

Используются и другие воздействующие на внутреннюю среду гиполипемианты, такие как ингибиторы HMG СоА-редуктазы, которые тормозят синтез эндогенного холестерина и увеличивают количество гепатических рецепторов атерогенных липопротеинов, уменьшая тем самым их концентрацию в плазме (M.S. Brown et al., Atherosclerosis reviews. 1987, 18, 85-93).

Однако применение медикаментозных профилактических мер для внешне здоровых лиц, у которых липидограмма крови находится в пределах, которые считаются "нормальными", является спорным по причине побочных эффектов.

Долгосрочная профилактика атеросклероза при применении ее в масштабах всего населения требует продуктов, длительно сохраняющих свою активность, легких в обращении и проявляющих минимум нежелательных побочных эффектов.

Необходимо, таким образом, дополнить разумную диетотерапию воздействием на кишечник с целью уменьшения липолиза триглицеридов в свободные жирные кислоты и моноглицериды и понижения продуцирования мицеллярной фазы, из которой происходит всасывание продуктов липолиза, а также холестерина.

Пищевые триглицериды, гидролиз которых начинается в желудке (с помощью подъязычной и желудочной липаз) и продолжается в двенадцатиперстной кишке (с помощью панкреатической липазы), организуются в проксимальном участке кишечника в форме эмульсии, в однослойную пограничную фазу которой, образованную преимущественно пищевыми и желчными фосфолипидами (G.Naibone et at., Lipids, 1974, 9, 765-770), встраиваются продукты липолиза (моноглицериды, свободные жирные кислоты), а также часть солей желчных кислот. Пограничная кишечная фаза не может диссоциировать на мицеллы, поскольку концентрация молекул детергентов в этой фазе (соли желчных кислот, ионизованные жирные кислоты, лизофосфолипиды) не достигает необходимого порога (критической концентрации мицеллообразования).

С целью значительного ингибирования внутрикишечного липолиза триглицеридов и уменьшения или даже подавления образования мицеллярной фазы, из которой осуществляется всасывание продуктов липолиза, J.C.Hauton (Cah. Nutr. Diet., 1990, 25, 2, 87-91) обнаружил, что необходимо: - перевести часть пищеварительных липаз из пограничной фазы частиц липидной эмульсии в конкурирующую пограничную фазу, и - перевести значительное количество желчных кислот в названную конкурирующую пограничную фазу, чтобы снизить их концентрацию ниже определенного порога с целью воспрепятствовать продуцированию мицеллярной фазы.

Проблема, которую необходимо разрешить, состоит таким образом в том, чтобы ввести в проксимальный отдел кишечника в процессе пищеварения нетоксичную конкурирующую пограничную фазу, обладающую максимумом поверхности при как можно меньшем объеме. Наиболее пригодной для этой цели структурой является структура мелких униламеллярных липосом. С точки зрения промышленного производства и по причинам, связанным с обращением и хранением, такие липосомы должны быть устойчивыми. Порошковые композиции стабилизированных липосом по изобретению позволяют эффективно решить эту проблему, с одной стороны, благодаря наличию желатинированного внутреннего ядра и, с другой стороны, благодаря тому, что липосомы имеют форму порошка, который может либо вводиться непосредственно внутрь, либо легко растворяться в водной фазе непосредственно перед применением.

С учетом сказаного выше заявитель поставил своей целью получить стабильную порошковую композицию на основе липосом, которая в лучшей степени, чем существующие композиции, отвечает практическим требованиям, благодаря тому, что, кроме значительно улучшенной стабильности, композиция по изобретению является также эффективной в отношении как профилактики, так и лечения гиперлипемий.

Целью настоящего изобретения является порошковая композиция для перорального введения, отличающаяся тем, что - она в основном состоит из униламеллярных липосом, содержащих внешнюю липидную фазу, состоящую в основном из липидов класса 4 (фосфолипидов) за исключением веществ класса 3 (холестерин, неионизованные высшие жирные кислоты) и веществ класса 5 (соли желчных кислот, производные фузидовой кислоты), и внутреннего водного ядра, образующего термообратимый водный гель, простирающийся до внешней липидной фазы, причем это внутреннее водное ядро состоит преимущественно из смеси М по меньшей мере двух различных неполимеризующихся гелеобразующих агентов G1 и G2, а точка фазового перехода гель-золь ядра выше или равна 37^oС, при этом G1 представляет собой гелеобразующий агент, выбираемый из желатина и каррагенанов, таких как каппа-каррагенаны, а G2 выбирают из каррагенанов, отличающихся по своим свойствам от каррагенанов, выбираемых для G1, таких как иота-каррагенаны и целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, причем диаметр липосом составляет от 20 нм до 1 μм, преимущественно от 50 до 500 нм; и - она имеет форму частиц со средним диаметром от 10 до 1000 μм, образованных из одной или нескольких названных выше липосом, покрытых оболочкой, выбранной из группы, в которую входят обезвоженный термообратимый водный гель, идентичный водному гелю внутреннего ядра, декстрины или смесь декстринов, таким образом, что композиция содержит в среднем от 10¹⁶ до 10¹⁸ липосом на 1 г порошка.

Применение таких порошковых композиций липосом для профилактики и терапии атеросклероза и ожирения может оказаться весьма выгодным, делая менее жесткими и, следовательно, более приемлемыми гиполипидические диеты, предписываемые больным, проходящим лечение от названных выше заболеваний.

Такие порошковые композиции удивительным образом сохраняют целостность содержащихся в них липогелосом, остающихся устойчивыми как в порошковой форме, так и будучи переведенными в суспензию благодаря сохранению целостности составляющих их липидов (отсутствие продуктов распада) и сохранению постоянства характеристик гелеобразующих агентов, в частности, смеси G1 и G2 (вязкость, прочность геля и разрывное усилие, молекулярные массы). Композиции, таким образом, содержат стабилизированные порошковые липогелосомы.

Гелеобразующие агенты G1 и G2 различаются, в частности, по вязкости, молекулярной массе и точке перехода гель-золь (т.е. температуре плавления). У гелеобразующих агентов G1 эта температура ниже или равна 45^oС, в то время как у гелеобразующих агентов G2 она выше или равна 45^oС.

Смесь М по меньшей мере двух определенных выше гелеобразующих агентов G1 и G2 обладает текстурометрическими характеристиками (прочность геля и разрывное усилие), особенно привлекательными с точки зрения устойчивости полученных липосом. В частности, целесообразно, чтобы смесь М по меньшей мере двух гелеобразующих агентов G1 и G2 обладала при 5^oС характеристиками релаксации от 70 до 100 и предпочтительно от 81 до 89% и усилием разрыва от 1000 до 1600 и предпочтительно от 1109 до 1503 г.

В соответствии с предпочтительным вариантом названной композиции, названное выше внутреннее водное ядро липосом содержит также по меньшей мере один стабилизирующий агент олигосахаридной природы и/или по меньшей мере один агент, регулирующий осмолярность среды, и по меньшей мере один поверхностно-активный агент.

Порошковая композиция предпочтительно содержит 25-75 мас. % липидов класса 4, 5-45 мас.% гелеобразующих агентов, от 0 до 70 мас.% стабилизирующего агента олигосахаридной природы, от 0 до 15 мас.% агента, регулирующего осмолярность среды, от 0 до 20 мас.% поверхностно-активных агентов и от 0 до 15 и более предпочтительно 8-12 мас.% декстрина (главным образом мальтодекстрина или циклодекстрина).

В соответствии с изобретением, часть гелеобразующего агента включена во внутреннюю водную фазу названных выше липогелосом, в то время как другая часть гелеобразующего агента образует оболочку вокруг внешнего липидного слоя этих липогелосом.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации порошковой композиции, последняя содержит 70-95% гелеобразующего агента G1 и 5-30% гелеобразующего агента G2.

Согласно еще одному предпочтительному варианту реализации порошковой композиции по изобретению, стабилизирующим агентом олигосахаридной природы может быть сахароза, трегалоза или другой защитный агент.

Согласно еще одному предпочтительному варианту реализации порошковой композиции по изобретению, липиды, образующие внешнюю липидную фазу липосом, преимущественно содержат 20-25% фосфатидилхолина, 10-18% фосфатидилэтаноламина и 9-15% фосфатидилинозита.

Названные фосфолипиды получают главным образом из лецитинов сои с повышенным содержанием фосфолипидов.

В качестве фосфолипидов могут быть использованы также очищенные фосфолипиды, индивидуально или в смеси, преимущественно в тех же количествах, что и названные выше фосфолипиды.

Предметом настоящего изобретения является также способ получения порошковой композиции по изобретению, в которой внешняя оболочка частиц содержит часть термообратимого водного геля, отличающаяся тем, что он включает следующие стадии: 1) Приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы) в водной фазе путем (а) приготовления раствора по меньшей мере одного подходящего гелеобразующего агента, в частности, смеси М гелеобразующих агентов G1 и G2, растворением названных гелеобразующих агентов при медленном перемешивании и при температуре, превышающей температуру фазового перехода гель-золь названных гелеобразующих агентов, в водном растворе, (b) введения липидов в полученный на стадии (а) раствор при медленном перемешивании смеси в течение менее 5 час, преимущественно в вакууме, с образованием эмульсии, и (с) получения дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы) в водной фазе, содержащей названные гелеобразующие агенты, при быстром перемешивании полученной на стадии (b) эмульсии, преимущественно в вакууме, и 2) получение порошкового продукта путем проведенной подходящим образом непосредственной сушки полученной дисперсии.

Согласно предпочтительному способу осуществления последней операции, сушку осуществляют распыливанием, коацервацией, сушкой в тонком слое или грануляцией.

Предметом настоящего изобретения является также способ получения порошковой композиции по изобретению, в которой внешняя оболочка частиц содержит часть термообратимого водного геля и/или декстрин, отличающаяся тем, что он включает следующие стадии: 1) приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы) в водной фазе путем (а) приготовления раствора по меньшей мере одного подходящего гелеобразующего агента, в частности, смеси М гелеобразующих агентов G1 и G2, растворением названных гелеобразующих агентов при медленном перемешивании и при температуре, превышающей температуру фазового перехода гель-золь названных гелеобразующих агентов, в водном растворе, (b) введения липидов в полученный на стадии (а) раствор при медленном перемешивании смеси в течение менее 5 ч, преимущественно в вакууме, с образованием эмульсии, и (с) получения дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы) в жидкой водной фазе, содержащей названные гелеобразующие агенты, при быстром перемешивании полученной на стадии (b) эмульсии, преимущественно в вакууме; 2) удаление по крайней мере части водной жидкой фазы, содержащей названные гелеобразующие агенты, в которой диспергированы названные выше липосомы; 3) добавление по меньшей мере одного подходящего декстрина;
4) получение порошкового продукта сушкой распыливанием полученного на стадии (3) продукта.

Согласно предпочтительному способу осуществления этого способа, стадию (2) удаления по крайней мере части водной жидкой фазы, содержащей названные гелеобразующие агенты, осуществляют разбавлением и/или фильтрацией.

В соответствии со способами получения согласно изобретению, водный раствор стадии (а) содержит дополнительно агент регуляции осмолярности среды (например, 0,9%-ный NaCl) и/или стабилизирующий агент олигосахаридной природы и/или поверхностно-активный агент.

Удивительным образом названные выше способы позволяют получить порошковую композицию устойчивых липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосом) всего лишь в одну стадию, включающую операцию созревания составляющих в водной фазе с малой скоростью и последующую операцию высокоскоростного диспергирования (образование липогелосом), включают стадию, в которой получают устойчивую, морфологически гомогенную дисперсию липогелосом в жидкой фазе, которая может быть подвергнута сушке; причем такая дисперсия липосом с желатинированным внутренним ядром характеризуется следующей морфологией:
везикулярная структура с диаметром от 20 нм до 1 μм, преимущественно от 70 до 200 нм,
микроскопические наблюдения в негативной окраске, при замораживании-скалывании с помощью криотрансмиссионной микроскопии и ядерной микроскопии: везикулы или везикулярные агрегаты с храктерным для фосфолипиднык бислоев видом; негативная окраска позволяет наблюдать более или менее выраженное наличие смеси М гелеобразующих агентов, обволакивающей внешний фосфолипидный слой, и
полидисперсность липосом с желатинированным внутренним ядром, составляющая от 10 до 55 и преимущественно от 30 до 50%.

Описанный способ обладает тем преимуществом, что он воспроизводим и прекрасно реализуется в промышленном масштабе.

Способ, кроме того, обладает тем преимуществом, что он менее трудоемок по сравнению с существующими способами, в которых необходимы стадии ультразвуковой обработки, экструзии или удаления детергентов, как описано в Европейском патенте 0393049.

Согласно преимущественному варианту осуществления названных выше способов, стадию (b) проводят преимущественно при скорости среза ниже 200 с^-1; в общем случае скорость среза дается в виде следующего отношения: скорость перемешивающего модуля, деленная на расстояние между внутренней стенкой реактора и дистальным концом перемешивающей лопатки (называемое также воздушным зазором).

Предметом настоящего изобретения является также пищевая добавка, способная регулировать холестеринемию и триглицеридемию, отличающаяся тем, что она содержит определенную порошковую композицию, которая может быть объединена с каким-либо подходящим эксципиентом.

Предметом настоящего изобретения являются также предназначенные для перорального введения фармацевтические композиции, содержащие порошковую композицию по изобретению и по меньшей мере один подходящий носитель; такие композиции особенно пригодны для ослабления холестеринемии и триглицеридемии или в качестве добавки при лечении с использованием одного или нескольких активных начал, стимулирующих повышение уровня трансаминаз или какого-либо другого токсичного маркера; так, совершенно неожиданным образом, порошковые композиции стабилизированных липосом по изобретению в значительной степени препятствуют повышению уровня гепатических глутамат-оксалацетат-трансаминазы и глутамат-пируват-трансаминазы.

Как пищевая добавка, так и фармацевтические композиции могут находиться как в твердом виде (желатинозная капсула, таблетка, водорастворимый порошок), так и в жидком виде (порошковая композиция по изобретению, повторно растворенная в водном растворе). Такие формы пригодны для перорального введения.

Как пищевая добавка, так и фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно предназначены для применения в разовой дозе, соответствующей разовой дозе фосфолипидов, входящих в состав липогелосом по изобретению, составляющей от 0,01 до 0,07 г/кг, т.е. суточной дозе от 0,03 до 0,2 г фосфолипидов липогелосом на 1 кг тела при двух- или трехразовом приеме.

Кроме изложенных выше положений, изобретение содержит и другие положения, которые будут выявлены из следующего ниже изложения, которое иллюстрируется примерами осуществления способа, являющегося предметом изобретения, а также фиг. 1-7, в которых:
- фиг. 1 иллюстрирует процентное распределение классов радиомеченых липидов (AG - жирные кислоты; MG - моноглицериды; DG - диглицериды; TG - триглицериды), присутствующих в содержимом желудка крыс, забитых через 2 ч после приема пищи;
- фиг. 2 иллюстрирует процентное распределение радиомеченных липидов в просвете кишечника по отношению к количеству (в рвм) липидов, извлеченных из желудка крыс, забитых через 2 ч после приема пищи (seg. int. - кишечный сегмент);
фиг. 3 показывает процентное распределение классов липидов (жирные кислоты; моноглицериды; диглицериды; триглицериды) с радиоактивной меткой, присутствующие в просвете кишечника крыс, забитых через 2 ч после кормления (seg. intestinal-кишечный сегмент);
- фиг.4 показывает процентное содержание липидов с радиоактивной меткой, обнаруженных в слизистой кишечника, по отношению к количеству (в рвм) липидов, прошедших через желудок крыс, забитых через 2 ч после кормления (seg. muq. - сегмент слизистой);
- фиг.5 показывает процентное содержание липидов с радиоактивной меткой, обнаруженных в плазме, по отношению к количеству (в рвм) липидов, прошедших через желудок крыс, забитых через 2 ч после кормления;
- фиг.6 показывает процентное содержание липидов с радиоактивной меткой, обнаруженных в печени, по отношению к количеству (в рвм) липидов, прошедших через желудок крыс, забитых через 2 ч после кормления;
- фиг. 7 показывает количество липидов с радиоактивной меткой (в рвм), обнаруженных в слепой кишке и в экскрементах крыс, забитых через 24 ч после кормления.

Само собой разумеется, эти примеры приведены для наглядной иллюстрации объекта изобретения и ни в коем случае не ограничивают его объем.

ПРИМЕР 1: Текстурометрические измерения смеси гелеобразующих агентов G1 и G2
а) Материалы и методы
Измерения проводят с помощью аппарата ТА-ХТ2i компании Rheo. Это исследование относится к поведению гелей, состоящих из смеси желатина, йота- и каппа-каррагенанов в тесте на разрыв и релаксацию.

Концентрация образцов:
Смесь желатин/йота-каррагенаны/каппа-каррагенаны (80/17,5/2,5) - 7,5% (маc./об) в среде 5 мМ Na₂HPO₄ и 0,9 или 2% NaCl.

Приготовление раствора гелеобразующих агентов:
Хлорид натрия растворяют в смесителе, оборудованном турбиной и планетарной мешалкой и содержащем очищенную воду (15 мин при 10 об/мин), поднимают температуру в смесителе до 75^oС (перемешивание при 10 об/мин в течение 45 мин), добавляют в смеситель при 75^oС гелеобразующие агенты (желатин, йота- и каппа-каррагенаны), запускают в действие турбину при скорости перемешивания 1500 об/мин; продолжительность стадии растворения составляет приблизительно 30 мин; растворение заканчивается, когда раствор становится прозрачным и не содержит взвешенных частиц.

Приготовление образцов:
При проведении испытаний на релаксацию 45 мл геля разжижают при нагревании в плоскодонной чашке Петри с внешним диаметром 92±2 мм. При испытаниях на разрыв 30 мл геля разжижают при нагревании в плоскодонном кристаллизаторе с внешним диаметром 50±2 мм. Получают гель при охлаждении до температуры ниже или равной 37^oС. Время созревания гелей, которое соответствует максимальной гидратации гелей, составляет 2,5 суток в покое при температуре испытаний.

Условия проведения испытаний:
При испытаниях на релаксацию к гелю в течение определенного времени прилагается сдавливающая сила. Используемый для этого подвижный элемент представляет собой алюминиевый цилиндр диаметром 25 мм, характеризующийся скоростью предперемещения 1,0 мм/с, скоростью перемещения 0,5 мм/с и скоростью после-перемещения 10,0 мм/с. Элемент перемещается на 1,0 мм за 30 сек.

При испытаниях на разрыв используемый подвижный элемент представляет собой эбонитовый цилиндр диаметром 10 мм со скоростью пред-перемещения, перемещения и после-перемещения, равной 1,0 мм/с. Элемент перемещается на 12 мм.

b) Результаты испытаний при 5^oС с содержанием NaCl 0,9%
Релаксация (%)
минимальное значение: 81±2,2
максимальное значение: 89±0,8
Разрывная сила (г)
минимальное значение: 1109125
максимальное значение: 1503±35
c) Зависимость результатов от температуры и различной концентрации NaCl
Условия проведения испытаний те же, что и в п.(а), за исключением того, что касается перемещения подвижного элемента, используемого при испытаниях на релаксацию (перемещение на 20% общей толщины геля).

Релаксация (%)
при 5^oС
NaCl 0,9%: 89±0,8
NaCl 2%: 90±0,2
при 25^oС
NaCl 0,9%: 32±3,9
NaCl 2%: 38±4,4
при 37^oС
NaCl 0,9%: 36±3,7
NaCl 2%: 40±4,9
Разрывная сила (г)
при 5^oС
NaCl 0,9%: 1413±66
NaCl 2%: 1114±143
при 25^oС
NaCl 0,9%: 211±2,7
NaCl 2%: 173±1,5
при 37^oС
NaCl 0,9%: 25,7±2,4
NaCl 2%: 45,7±3,9
ПРИМЕР 2: Способ получения порошковой композиции по изобретению (ЛГС) (с оболочкой, состоящей из обезвоженных гелеобразующих агентов)
1) Приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы)
- Составляющие:
Лецитины сои 11,915 кг (7,943%)
Желатин В150 7,149 кг (4,766%)
Йота-каррагенаны 1,565 кг (1,043%)
Каппа-каррагенаны 0,222 кг (0,148%)
Сахароза 8,936 кг (5,957%)
Хлорид натрия 1,073 кг (0,715%)
Очищенная вода 119,15 кг (79,43%)
СУММАРНО веществ 150,01 кг (100%)
а) Приготовление раствора гелеобразующих агентов
Приготовление производится так же, как в примере 1. Характеристики раствора проверяются путем отбора проб, после чего добавляют стабилизирующий олигосахаридный агент (сахарозу).

b) Введение - фосфолипидов в полученный в п.(а) раствор
Лецитины сои помещают в смеситель, в котором планетарная мешалка вращается со скоростью 10 об/мин и турбина со скоростью 1500 об/мин в течение 5 ч в вакууме (до образования эмульсии).

- заключительное диспергирование при увеличении скорости перемешивания планетарной мешалкой (25 об/мин) и турбиной (2500 об/мин) в течение времени, достаточного для получения полидисперсности ниже 40%.

Получают дисперсию липогелосом в водной фазе.

Изучение отобранных в конце диспергирования образцов обнаруживает везикулярные структуры с диаметром 120±30 нм.

Микроскопические наблюдения в негативной окраске, при замораживании-скалывании, криотрансмиссионной микроскопии и ядерной микроскопии: везикулы или везикулярные агрегаты с характерным для фосфолипидных бислоев видом; негативная окраска позволяет наблюдать более или менее выраженное наличие внешнего гелеобразующего агента в зависимости от выбранного способа получения и/или отделения.

2) Сушка полученной дисперсии
Полученную дисперсию липогелосом в водной фазе переливают в сушилку под вакуумом (50-100 мбар) в течение приблизительно 4 ч. Получают достаточно гомогенный, очень светлый соломенно-желтый порошок, содержащий зерна с диаметром от 0,1 мкм до 1 мм. Могут быть использованы и другие способы сушки.

При наблюдениях в электронном микроскопе наблюдается уменьшение размеров липидных везикул, обусловленное их обезвоживанием. Наряду с этим обнаруживают, что липогелосомы в жидком состоянии часто агрегированы внутри гомогенной желатинированной оболочки, находясь в окружении множества изолированных везикулярных структур. Стадия сушки превращает эту гелеобразную оболочку в сухие нити гелеобразующего материала на поверхности как агрегатов, так и изолированных везикулярных структур. Заявитель полагает, что эта морфологическая разница является вероятной причиной различного поведения сухих структур и влажной формы липогелосом в отношении метаболизма липидов.

Возможен вариант сушки, в котором дисперсию липогелосом в водной фазе распределяют непосредственно на сушилке с вращающимися барабанами (температура барабанов 120-150^oС, скорость вращения 3-6 об/мин). Полученные "чешуйки" после этого размалывают и рассеивают на подходящем сите. Получают порошок липогелосом (называемых далее ЛГС) с указанными выше характеристиками.

ПРИМЕР 3: Способ получения порошковой композиции по изобретению (ЛГС) (с оболочкой, содержащей мальтодекстрины)
1) Приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром (липогелосомы):
- Составляющие:
Лецитины сои 11,915 кг (7,943%)
Желатин В150 7,149 кг (4,766%);
Йота-каррагенаны 1,565 кг (1,043%)
Каппа-каррагенаны - 0,222 кг (0,148%)
Сахароза 8,936 кг (5,957%)
Хлорид натрия 1,073 кг (0,715%)
Очищенная вода 119,15 кг (79,43%)
СУММАРНО веществ 150,01 кг (100%)
a) Приготовление раствора гелеобразующих агентов
Приготовление производится так же, как в примере 2.

b) Введение фосфолипидов в полученный в п.(а) раствор
Лецитины сои помещают в смеситель, в котором планетарная мешалка вращается со скоростью 10 об/мин и турбина со скоростью 1500 об/мин в течение 5 ч в вакууме (до образования эмульсии).

- заключительное диспергирование при увеличении скорости перемешивания планетарной мешалкой (25 об/мин) и турбиной (2500 об/мин) в течение времени, достаточного для получения полидисперсности ниже 40%.

Получают дисперсию липогелосом в водной фазе.

Изучение отобранных в конце диспергирования образцов обнаруживает везикулярные структуры с диаметром 120±30 нм.

Микроскопические наблюдения в негативной окраске при замораживании-скалывании криотрансмиссионной микроскопии и ядерной микроскопии: везикулы или везикулярные агрегаты с характерным для фосфолипидных бислоев видом; негативная окраска позволяет наблюдать более или менее выраженное наличие внешнего гелеобразующего агента в зависимости от выбранного способа получения и/или отделения.

2) Дисперсию ЛГС во внешней гелеобразующей среде разбавляют в отношении 1/10 0,9%-ным раствором NaCl, затем фильтруют на фильтре 300 или 500 кДа (тангенциальная фильтрационная система "Open Channel", PAL FILTRON) при 37^oС. После концентрирования ЛГС получают дисперсию, в которой содержание сухих веществ составляет от 37 до 50% (маc./об). Добавляют эквивалентное количество (4-6 мас. %) мальтодекстрина. После растворения и гомогенизации смесь распыливают (например, с помощью распылителя направленного действия NIRO). Получают частицы, в которых внешняя оболочка содержит мальтодекстрины и состав которых примерно следующий:
ЛГС, концентрированные до 44,6% сухого материала 1500 г
Мальтодекотрин 80 г
Общий теоретический атомизат ЛГС 830 г
Полученное количество (выход 84%) 760 г
Распыление проводят в следующих условиях:
Температура воздуха на входе: 180-200^oС
Температура воздуха на выходе: 80-95^oС
Давление в головке турбины: приблизительно 4 бар
Температура распыляемого раствора на выходе: 20-45^oС.

ПРИМЕР 4: Влияние порошковой композиции из примера 2 на всасывание из кишечника пищевых липидов у крыс в период после кормления
Это исследование проводится на крысе с нормальным липидемическим статусом в период после кормления. Нормальный липидемический статус позволяет изучение реальных эффектов липогелосом, не искаженных метаболическими нарушениями, порождаемыми патологическим состоянием. Период после кормления делает возможным изучение механизмов путем "фотографирования" эффектов липогелосом в конкретный момент пищеварения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и диеты
*Животные
Соблюдаются официальные французские нормы (n^o 87-848 от 19 октября 1987 г. ) и европейские нормы (n^o 86-609 от 24 ноября 1986 г.) по уходу и использованию лабораторных животных.

В качестве животных использованы крысы-самцы Wistar (Iffa-Credo, I'Arbresle, Франция) весом 300 г. Во время 10-дневного адаптационного периода крысы помещались в клетки в климатизированном помещении (температура 21^oС, влажность 50%) с циклом свет-темнота 12 на 12 ч; воду и корм давали ad libitum за 48 ч до эксперимента. Крыс помещали в клетки-контейнеры с глюкозной диетой 50 г/л. За 24 ч до эксперимента крыс переводили на диету, включающую только воду ad iibitum, с целью недопущения копрофагии.

Таким образом, желудки крыс перед интубацией тест-корма освобождены от посторонних материалов.

Шесть групп мышей составлены произвольным образом: две группы контрольные (К), две группы "липогелосомные" (ЛГС) и две группы "ингредиентные" (И), животных из которых забивают через 2 или 24 ч после приема пищи. Число крыс в группах зависит от предъявляемых для каждой группы экспериментальных требований.

*Тест-корм
Каждый тест-корм содержит липидную эмульсию, к которой непосредственно перед применением добавляют липогелосомы (группа ЛГС), ингредиенты липогелосом (группа И) или хлорид натрия (группа К).

- Липидная эмульсия:
522,5 мг смеси, содержащей триолеин, холестерин и лецитины сои (таблица 1), добавляют к водному раствору хлорида натрия, сахарозы и альбумина. Препарат эмульгируют с помощью перемешивания магнитной мешалкой и действия ультразвуком. Каждую неделю препарат обновляют. Диаметр частиц эмульсии контролируется каждый день с помощью гранулометра (Сара 700, Horiba, Kyoto, Япония). Не наблюдалось никаких отклонений от среднего диаметра 2,97 мкм в различные дни.

В каждом тест-корме величины удельной радиоактивности триолеина-¹⁴С и холестерина-³H составляли соответственно 68,45 и 4,27 кБк/ммоль.

- Липогелосомы:
Порошковую композицию из примера 2 растворяют в воде до получения концентрации фосфолипидов 39,47 мг/мл; диаметр суспендированных липогелосом, контролируемый гранулометрически и с помощью электронного микроскопа, постоянен и составляет 164,9 нм (средняя величина).

- Ингредиенты липогелосом:
Используются составляющие липогелосомы сырьевые материалы, указанные в примере 2. Фосфолипиды и гелеобразующую смесь приготовляют отдельно.

- Введение тест-корма:
Непосредственно перед применением 2,2 мл препарата липогелосом или ингредиентов смешивают в шприце с 1,5 мл липидной эмульсии для групп ЛГС и И. Эквивалентное количество хлорида натрия добавляют к липидной эмульсии для групп К.

Отношение триглицериды/пищевые фосфолипиды во всем поглощенном корме составляет величину 40 для всех групп и соответствует отношению, наблюдаемому в пище человека. Однако с учетом этой величины тест-корма для животных, получающих ЛГС или И, содержат пониженное количество пищевых липидов.

Крыс интубируют с помощью желудочного зонда с полиэтиленовыми катетерами. Перед интубацией эмульсии отбирают две пробы для точного измерения радиоактивности поглощаемых крысами веществ.

Отборы проб:
Кровь
Через 2 или 24 ч после приема пищи крыс анестезируют смесью кетамин/ксиламин (60 мг/кг/7,5 мг/кг) и забивают путем обескровливания. Кровь забирают пункцией абдоминальной аорты, собирая приблизительно 10 мл крови в пробирки, содержащие ЭДТА с целью предотвращения коагуляции.

В приведенной ниже таблице II указаны условия различных производимых отборов проб.

Для проб, взятых через 2 ч после кормления, результаты прямого измерения радиоактивности выражены в процентах радиоактивности, обнаруженной ниже привратника желудка с целью снижения влияния опорожнения желудка, который непостоянен в одной и той же группе.

Такое условие не является необходимым для крыс, забиваемых через 24 ч после кормления, поскольку в этом случае у всех крыс степень опорожнения желудка составляет 99,9%. Результаты в этом случае выражаются в рвм (распадах в минуту).

Результаты
1) Влияние липогелосом на липолиз липидов в желудке
Как наблюдали ранее на животных, так же как и на человеке, пищевые липиды в желудках крыс частично гидролизованы. После двух часов переваривания содержимое желудков крыс трех групп: К, И и ЛГС, существенно не различается, несмотря на то, что у крыс группы ЛГС оно несколько меньше (таблица III). Эти результаты соответствуют близким значениям степени опорожнения желудка к тем, которые ранее были определены у крыс после съедания тест-корма (Gallahler D. Et al., Am.J.Physiol, 1985, 249, 184-191).

Никакой разницы не было отмечено в количестве липидов-¹⁴С и холестерина-³H в желудках крыс в трех группах после 2-часового переваривания. В отличие от этого разница была обнаружена в отношении количества липидов-¹⁴С, гидролизованных в разных группах в большей или меньшей степени.

Фиг. 1 показывает процентные содержания триглицеридов (TG), диглицеридов (DG), моноглицеридов (MG) и жирных кислот (AG), обнаруженных в содержимом желудков спустя 2 ч после интубации тест-корма, содержащего триглицериды. Содержание триглицеридов остается значительно более высоким в присутствии ингредиентов (на 21,6% по сравнению с группой К) и липогелосом (на 31,3%) в тест-корме в отличие от диглицеридов и жирных кислот, содержание которых в присутствии ингредиентов значительно ниже. Содержание моноглицеридов в
трех группах отличается незначительно, однако оно значительно понижается в содержимом желудков крыс группы ЛГС (на 48% по сравнению с группой К).

Содержание классов липидов в содержимом желудков крыс группы ингредиентов во всех случаях являются промежуточными по сравнению с контрольной группой и группой ЛГС.

Содержание не подвергающегося никаким превращениям в желудке холестерина остается постоянным.

На фиг.1 каждая гистограмма представляет собой среднее (± среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера. Символ * указывает на значительную разницу (р<0,05) по сравнению с контрольной группой в тесте Шеффе.

2) Влияние липогелосом в отделе кишечника
Так же, как и содержимое желудка, содержимое кишечника у крыс, забитых после 2-часового переваривания, не обнаруживает существенной разницы между контрольной группой, группой ингредиентов и группой ЛГС в отношении количества липидов-¹⁴С. Фиг.2 показывает, что распределение этих липидов по трем сегментам кишечника одно и то же для контрольной группы и группы ЛГС, при снижении количества липидов-¹⁴С от верхней части кишечника к его нижней части. Значительно меньшее (но не пренебрежимо малое) количество липидов-¹⁴С обнаружено в содержимом верхнего сегмента кишечника и в целом в кишечнике крыс контрольной группы. Каждая гистограмма на фиг.2 представляет собой среднее (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера. Символ * указывает на значительную разницу (р<0,05) по сравнению с контрольной группой в тесте Шеффе.

Содержание липидов разных классов, обнаруженное в содержимом сегментов кишечника, меняется в зависимости от интубированного тест-корма (фиг.3). Уровень диглицеридов был значительно выше в нижнем сегменте кишечника крыс контрольной группы и группы ЛГС. Уровень жирных кислот в том же сегменте был значительно понижен ингредиентами и липогелосомами. По причине достаточно больших внутригрупповых различий ингредиенты и липогелосомы не выявили значительной разницы в содержимом верхнего и среднего сегментов кишечника. Каждая гистограмма на фиг.3 представляет собой среднее (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера. Символ * указывает на значительную разницу (р<0,05) по сравнению с контрольной группой в тесте Шеффе.

Как это видно на фиг.2, ингредиенты и липогелосомы модифицируют распределение холестерина по ходу кишечника. Ингредиенты значительно понижают уровень холестерина в содержимом верхнего сегмента кишечника (на 57,3% по сравнению с контрольной группой). Липогелосомы значительно повышают холестерин в содержимом нижнего сегмента кишечника, а также в содержимом кишечника в целом (соответственно на 104,5 и 34,4% по сравнению с контрольной группой).

Результаты, полученные на крысах, забитых после 24-часового переваривания, не выявили разницы между тремя группами. Поскольку кишечник к этому времени переваривания был почти пуст, значения измеренной радиоактивности были очень низки.

3) Влияние липогелосом на всасывание триглицеридов и пищевого холестерина
Содержимое слизистой кишечника отбирали и анализировали только после 2 ч переваривания: подобный анализ после 24 ч переваривания не представлял никакого интереса с учетом малого времени транспорта липидов в энтероцитах.

Содержание триглицеридов в клетках слизистых тканей кишечника не выявило значительной разницы между контрольной группой (Т) и группами И (I) и ЛГС (LGS) (фиг.4).

Всасывание пищевого холестерина существенно зависит от присутствия в тест-корме липогелосом и в меньшей степени от присутствия ингредиентов (фиг. 4). Всасывание холестерина значительно понижается ингредиентами в верхнем сегменте слизистой кишечника. Липогелосомы привели к значительному снижению всасывания холестерина в верхнем и нижнем сегментах слизистой так же, как и во всей слизистой кишечника в целом (соответственно на 32,9, 47 и 16,8% по сравнению с контрольной группой). Каждая гистограмма на фиг.4 представляет собой (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера. Символ * указывает на значительную разницу (р<0,05) по сравнению с контрольной группой в тесте Шеффе.

4) Влияние липогелосом на содержание липидов в плазме
Количества триглицеридов-¹⁴С и холестерина-¹³H в плазме крыс, забитых после 2 ч переваривания, представлены на фиг.5.

Ингредиенты и липогелосомы обладают тенденцией понижать уровень плазматических триглицеридов, однако обнаруженные изменения не являются значительными.

Уровень холестерина плазмы значительно понижается липогелосомами (на 42,6% по сравнению с контрольной группой). Ингредиенты проявляют похожий эффект, но не значительный по отношению к холестерину плазмы крыс контрольной группы.

Каждая гистограмма на фиг.5 представляет собой среднее (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера. Символ * указывает на значительную разницу (р<0,05) по сравнению с контрольной группой в тесте Шеффе.

После 24-часового переваривания никакой разницы между тремя группами отмечено не было.

5) Влияние липогелосом на липидный метаболизм в печени
Ингредиенты и липогелосомы не проявляют выраженного влияния на депонирование липидов-¹⁴С в печени после 2 ч переваривания (фиг.6).

С другой стороны, они приводят к понижению (не значительному из-за сильных внутригрупповых различий) количества накопленного в печени холестерина, которое уменьшается соответственно на 35 и 33% по сравнению с контрольной группой.

Каждая гистограмма на фиг.6 представляет собой среднее (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Никаких существенных различий в тесте Фишера (р<0,05) не наблюдали.

После 24 ч переваривания присутствующие в печени крыс радиомеченые липиды не выявляли разницы между тремя группами.

6) Липиды и пищевой холестерин в слепой кишке и экскременте
Слепая кишка животных, забитых после 2-часового переваривания, не содержала или содержала незначительные дозы радиоактивности как по ¹⁴С, так и по ³H. Наряду с этим отсутствовали экскременты.

После 24-часового переваривания (фиг.7) количества липидов-¹⁴С, обнаруженных в слепой кишке и экскременте, значительно увеличены у крыс, получивших тест-корм, содержащий липогелосомы (на 229,5% по сравнению с контрольной группой).

Еще более выражено влияние на количество пищевого холестерина, которое значительно выше как для групп И, так и для групп ЛГС (соответственно на 133,3 и 229,4% по сравнению с контрольной группой). Возрастание количеств холестерина, не всасанного слизистой кишечника, в значительной степени слабее в группе И по сравнению с группой ЛГС.

Каждая гистограмма на фиг.7 представляет собой среднее (±среднее отклонение) индивидуальных значений для каждой группы (Т - контрольная, I - ингредиенты, L - липогелосомы). Различные буквы указывают на значительные различия (р<0,05) между группами в тесте Фишера и в тесте Шеффе.

Настоящее исследование показывает, что переваривание липогелосом вместе с пищевым рационом приводит к сильному понижению всасывания пищевых липидов (триглицеридов и холестерина). Наиболее правдоподобная гипотеза на основании результатов, полученных в отношении действия липогелосом, предполагает уменьшение липолиза триглицеридов в просвете кишечника, что приводит к менее значительному продуцированию моноглицеридов и свободных жирных кислот. Предполагается, что такое снижение липолиза имеет в основном два следствия: уменьшение всасывания моноглицеридов и свободных жирных кислот и уменьшение растворения холестерина в мицеллярной фазе, приводящее к уменьшению всасывания холестерина.

Влияние липогелосом на уменьшение всасывания холестерина слизистой кишечника более существенно, чем влияние липогелосом на моноглицериды и жирные кислоты. Это может быть обусловлено тем фактом, что степень всасывания холестерина значительно слабее, чем степень всасывания триглицеридов (соответственно 80-100 и 40-60%).

Таким образом, даже при "нормальных" условиях переваривания всасывание холестерина ограничено. Изменение одного параметра (снижение концентрации моноглицеридов и свободных жирных кислот) приводит в этом случае к значительному изменению всасывания холестерина.

Наряду с этим возможно, что липогелосомы захватывают часть солей желчных кислот. Такой эффект должен приводить к уменьшению растворения холестерина в мицеллярной фазе и вследствие этого к уменьшению его всасывания.

Эти результаты подтверждаются результатами, полученными при изучении влияния длительного приема с пищей липогелосом на липидный метаболизм (приведенный ниже пример 5).

ПРИМЕР 5: Влияние длительного приема с пищей различных количеств ЛГС на метаболизм липидов у крыс
ЖИВОТНЫЕ И ДИЕТЫ
Составлены произвольным образом 8 групп по 10 крыс Вистар (IFFA CREDO, L'Arbresie, Франция) в возрасте 14 недель.

Животных помещают в клетку в помещении с искусственным микроклиматом (температура 21^oС, влажность 50%) с циклом свет-темнота 12 на 12 ч. Пищу и воду предлагают ad libitum.

Обеспечивают вручную 8 диет. Липогелосомы, а также первичные составляюще ЛГС (И - ингредиенты) такие же, как в примере 2. Детализированный состав каждой диеты показан в таблице IV. Содержания различных пищевых компонентов диет рассчитаны с учетом содержащихся в них липидов липогелосом или ингредиентов.

Испытаны 8 диет:
БедЛ - диета, обедненная липидами (4% триглицеридов)
БогЛ - диета, обогащенная липидами (25% триглицеридов + 1,2% холестерина)
ЛГС-1 - диета, обогащенная липидами, из которых 1,25% ЛГС
ЛГС-2 - диета, обогащенная липидами, из которых 2,5% ЛГС
ЛГС-3 - диета, обогащенная липидами, из которых 3,75% ЛГС
И-1 - диета, обогащенная липидами, из которых 1,25% ингредиенты ЛГС
И-1 - диета, обогащенная липидами, из которых 2,5% ингредиенты ЛГС
И-1 - диета, обогащенная липидами, из которых 3,75% ингредиенты ЛГС
Чтобы не разрушить ЛГС, диеты ЛГС-1, 2 и 3 были приготовлены непосредственно перед применением. Другие диеты хранились замороженными при -20^oС.

Проведение исследования
В начале и в конце исследований измеряется вес крыс.

После 2 недель исследований и в конце их измеряется количество потребленного корма (по трем дням).

Взятие крови производится в начале исследований и после 3 недель диеты в группах БогЛ и ЛГС-3.

Экскремент собирают (в течение 4 дней) в течение предпоследней недели, взвешивают и замораживают при -20^oС.

Измерение коэффициента всасывания холестерина производится на собранном экскременте в начале последней недели.

После 6 недель диеты животных забивают при анестезировании после одного дня голодания: забирают печень (взвешивание с последующим замораживанием при -20^oС) и приблизительно 10 мл крови (пункция абдоминальной аорты). Сыворотку получают путем центрифугирования цельной крови.

Для всех анализов на сыворотке крови используют свежую сыворотку.

Анализы
- Триглицериды (G.Buccolo et at., Clin.Chem., 1973, 19, 476-482), фосфолипиды (M.Takayama et al., Clin.Chem.Acta, 1977, 79, 93-98), общий холестерин (J.Siedel et al., Clin.Chem., 1983, 29, 1075-1080) и свободный холестерин (F. Stahler et al. , Med.Lag., 1973, 30, 29-37) определяли у 20 крыс (группы БогЛ и ЛГС-3) в начальный период и через 3 недели диеты с использованием ферментативно-колориметрических методов.

- Триглицериды, фосфолипиды, общий холестерин и свободный холестерин сыворотки определяют у каждой крысы после 6 недель диеты с использованием тех же методов.

- Липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеины (ЛНП) низкой плотности и липопротеины высокой плотности (ЛВП) выделяли из сыворотки каждой крысы (T. Brousseau et at., Clin.Chem., 1993, 39, 960-964) в конце исследований с помощью последовательного ультрацентрифугирования (ЛОНП: 436000 g, 2,5 ч при 10^oС; ЛВП: 436000 g, 2,5 ч при 10^oС) на ультрацентрифуге Beckman Optima TLX с ротором TL-100.2. Триглицериды, фосфолипиды, общий и свободный холестерин определяли на различных классах липопротеинов с использованием названных выше ферментативно-колориметрических методов.

Токсилогическую ферментативную активность γ-глутамилтранспептидазы (J.P. Presijn et al., J.Clin.Chem.Biochem., 1976, 14, 421-427), глутамат-оксалацетат-трансаминазы (G. Kessler et al., 9^th Int.Congr.Clin.Chem., Toronto, 1975), глутамат-пируват-трансаминазы (G.Kessler et al., 9^th Int.Congr.Clin. Chem. , Toronto, 1975) и щелочной фосфатазы (S.Morgenstern et at., Clin. Chem., 1965, 11, 876-881) определяли на сыворотке крыс из групп БогЛ и ЛГС-3 после 6 недель диеты.

- Приблизительно 1 г печени каждой крысы размалывали в этаноле. Триглицериды (G.Buccolo et al., Clin.Chem., 1973, 19, 476-482) и фоофолипиды (J. Amic et at. Clin.Chem.Acta, 1972, 40, 107-114) определяли после экстрагирования по методу Folch (J.Folch et al., J. Biol.Chem., 1957, 226, 498-509). Общий холестерин (J.Siedel et al., Clin.Chem., 1983, 29, 1075-1080) определяли после омыления, экстрагирования петролейным эфиром, промывки водным этанолом, упаривания и растворения в изопропиловом спирте (L.Cara et al., Nutr.Res., 1991, 11, 907-916).

- Аликвоты (специфические препараты) печени от каждой крысы были приготовлены с целью сохранения образцов путем замораживания при -80^oС для возможного проведения анализов (HMGCoA red., АСАТ, 7а-гидролаза).

РЕЗУЛЬТАТЫ
ЭВОЛЮЦИЯ ВЕСА И ПОГЛОЩЕННОЙ ПИЩИ
В начале исследований средние величины весов в каждой группе крыс значительно не различались (от 325±2 г до 330±2 г). После 6 недель диеты вес крыс из групп И-1 (419±7 г) и И-3 (414±9 г) был значительно ниже веса крыс из группы ЛГС-3 (444±7 г).

Напротив, никакой существенной разницы не возникло между группами ЛГС, И и контрольной группой БогЛ (425±8 г). Такие же значительные различия проявились и в отношении прироста веса (БогЛ: 95±9 г, ЛГС-3: 116±9 г, И-1: 92±7 г, И-3: 89±9 г).

Величины поглощенной пищи в группе БедЛ после 2 недель (41,2±1,5 г) и 5 недель (38,9±0,9 г) значительно превышали величины поглощенной пищи в других группах (от 25,3±1,0 до 31,7+1,0 г). Поскольку диета БедЛ содержала меньше калорий на 1 г корма, крысы из этой группы увеличивали вес принятой пищи.

Поглощение ЛГС (в порошке) было следующим: ЛГС-1: 0,51 г/сут, ЛГС-2: 1,04 г/сут, ЛГС-3: 1,67 г/сут, что соответствует следующим количествам фосфолипидов: ЛГС-1: 0,28 г/сут, ЛГС-2: 0,57 г/сут, ЛГС-3: 0,92 г/сут.

Варьирование параметров сывороточных липидов
Таблица V представляет значения параметров сыворотки крыс после 6 недель диеты.

Поглощение обогащенных липидами диет приводит к значительному уменьшению уровня сывороточных триглицеридов крыс по сравнению с диетой, обедненной пищевыми липидами (таблица VI). Этот результат был получен и в других исследованиях (JL. Vigne et at., Br.J.Nutr., 1987, 58, 405-413; F.Chanussot et al. , Ann. Nutr.Metab, 1988, 32, 271-281; G.Nalbone et al., J. Nutr., 1988, 118, 809-817; G. NALBONE et al., Lipids, 1989, 24, 179-186), но амплитуда вариаций зависит от состава диет, от линии крыс и длительности приема диет. Диета И-2 приводит к значительному повышению уровня сывороточных триглицеридов по сравнению с диетами БогЛ, ЛГС-1, И-1 и И-3.

Анализ липидов различных классов липопротеинов (таблица VI) показывает, что возрастание триглицеридемии с диетой БедЛ было обусловлено главным образом значительным повышением уровня триглицеридов ЛОНП и отчасти значительным повышением уровня триглицеридов ЛНП и ЛВП. Повышение, полученное с диетой И-2, обусловлено главным образом повышением уровня триглицеридов ЛОНП. По сравнению с диетой БогЛ диета ЛГС-3 приводит к значительному повышению уровня триглицеридов ЛНП, в то время как диеты ЛГС-2, И-2 и И-3 вызвали значительное повышение уровня триглицеридов ЛВП. Увеличение поглощения в ЛГС и И приводит лишь к слабым вариациям триглицеридов в разных классах липопротеинов: скорее всего этот параметр не зависит от дозы.

Пояснения к таблице VI: числа обозначают среднее (± среднее отклонение) значение по 10 крысам. Различные буквы в каждом столбце указывают на значительные различия. ЛОНД - липопротеины очень низкой плотности; ЛНД - липопротеины низкой плотности; ЛВД - липопротеины высокой плотности; БедЛ - диета, обедненная липидами (3%); БогЛ - диета, обогащенная липидами (25%); ЛГС-1 - диета, содержащая 25% липидов, из которых 1,25% фосфолипиды в форме липогелосом; ЛГС-2 - диета, содержащая 25% липидов, из которых 2,5% фосфолипиды в форме липогелосом; ЛГС-3 - диета, содержащая 25% липидов, из которых 3,75% фосфолипиды в форме липогелосом; И-1 - диета, содержащая 25% липидов, из которых 1,25% фосфолипиды; И-2 -диета, содержащая 25% липидов, из которых 2,5% фосфолипиды; И-3 - диета, содержащая 25% липидов, из которых 3,75% фосфолипиды.

Что касается сывороточных фосфолипидов (таблица V), обедненная липидами диета также приводит к значительному повышению их уровня при сравнении с диетами, обогащенными липидами. Только диета И-2 повышает уровень сывороточных фосфолипидов при сравнении с диетой БогЛ.

После отделения различных классов липопротеинов (таблица VI) было установлено, что повышение уровня фосфолипидов в группе БедЛ было в значительной степени обусловлено количественным увеличением фосфолипидов ЛВП. Поскольку этот класс липопротеинов содержит наибольшее количество фосфолипидов, вполне естественно, что повышение их уровня обусловлено именно этим классом липопротеинов. Что же касается эффекта ЛГС и ингредиентов, было установлено значительное повышение уровня фосфолипидов ЛВП с диетами ЛГС-1, ЛГС-2, И-2 и И-3 по сравнению с группой БогЛ.

Диета БогЛ приводит к небольшому увеличению общего сывороточного холестерина по сравнению с диетой БедЛ (таблица V). При сравнении с диетой БогЛ отмечается значительное (на 22,3%) уменьшение общего сывороточного холестерина с диетой ЛГС-3. Менее значительное уменьшение (на 10,9%) было получено с диетой И-3.

Таблица VI показывает, что уменьшение общего холестерина, полученное с диетой ЛГС-3, обусловлено значительным уменьшением общего холестерина ЛОНП и отчасти тенденцией к уменьшению общего холестерина ЛНП. При сравнении с диетой БогЛ уменьшение общего холестерина ЛОНП+ЛНП в результате поглощения диеты ЛГС-3 составило 36,4%. Напротив, при поглощении диеты ЛГС-3 никаких изменений общего холестерина ЛВД отмечено не было.

Влияние пищевых фосфолипидов у животного зависит также от применяемой методологии. Если сравнивать влияние диет ЛГС-3 и И-3, важно отметить, что диета ЛГС-3 приводит к вдвое большему уменьшению холестеринемии. С другой стороны, влияние ЛГС на холестеринемию зависит от поглощенной дозы.

Увеличение поглощения пищевых липидов не приводит к значительному изменению (кроме случая диеты ЛГС-3) уровня свободного сывороточного холестерина (таблица V).

Только диета ЛГС-3 приводит к значительному (39%) понижению уровня свободного сывороточного холестерина в сравнении с диетой БогЛ.

Напротив, результаты, полученные с липидами различных классов липопротеинов (таблица VI), показывают, что распределение свободного холестерина меняется в зависимости от поглощенной диеты.

Понижение уровня свободного сывороточного холестерина при диете ЛГС-3 в сравнении с диетой БогЛ обусловлено значительным уменьшением свободного холестерина ЛОНП и ЛНП. Нужно также отметить, что по отношению к диете БогЛ диета И-3 приводит к значительному увеличению свободного холестерина ЛВП.

Что касается вариаций уровня этерифицированного сывороточного холестерина (таблица V), наблюдалось значительное (20%) понижение его уровня при поглощении диеты ЛГС-3 в сравнении с диетой БогЛ. Диеты ЛГС-2, И-2 и И-3 имеют тенденцию к уменьшению этого параметра, но не в значительной степени.

Уменьшение названного параметра с диетой ЛГС-3 по сравнению с диетой БогЛ обусловлено значительным уменьшением этерифицированного холестерина в ЛОНП и тенденцией к его уменьшению в ЛНП и ЛВП (таблица VI). В сравнении все с той же диетой БогЛ не наблюдалось значительных вариаций этерифицированного холестерина в ЛНП и ЛВП при диетах, содержащих ЛГС или ингредиенты.

Таблица V (продолжение) представляет результаты токсикологических параметров сыворотки после 6 недель диеты. При диете БедЛ добавление к диете липидов не ведет к повышению уровня щелочной фосфатазы. В то же время диета И-1 дает значительное понижение этого параметра по сравнению с диетами БогЛ, ЛГС-1 и И-2.

Диета БогЛ значительно повысила активность глутамат-оксалацетат-трансаминазы в сравнении с диетой БедЛ.

Другие диеты не модифицировали в значительной степени активность этой трансаминазы в сравнении с диетой БедЛ. В то же время отмечается ее сильное уменьшение (47%) с диетой ЛГС-3 в сравнении с диетой БедЛ. Значительное (30%) ее уменьшение было также получено с диетой И-3.

В сравнении с диетой БедЛ диета БогЛ приводит к увеличению активности глутамат-пируват-трансаминазы.

Диеты, содержание ЛГС или ингредиенты незначительно модифицируют активность трансаминазы в сравнении с диетами БедЛ и БогЛ. При этом наиболее низкие значения были получены при поглощении диет ЛГС-3 и И-3.

Что касается активности γ-глутамилтранспептидазы, чувствительность метода определения не позволила измерить эту ферментативную активность: получаемые значения были слишком низкими. Активности этого фермента не было обнаружено ни с одной из поглощаемых диет.

Результаты токсикологических измерений показывают, что поглощаемые крысой ЛГС в указанных дозах не являются токсичными. Напротив, они даже имеют тенденцию к проявлению защитного эффекта в отношении печени.

Варьирование липидных параметров печени
Добавление пищевых липидов к диетам приводит к значительному увеличению веса печени, в то время как увеличение количества ЛГС имеет тенденцию уменьшать вес печени. Подобного рода изменение веса печени в еще большей степени выражено при увеличении количества ингредиентов (группа И). Следует напомнить, что вес крыс из групп И был ниже. Поэтому вполне естественно, что вес печени в этих группах был также ниже.

В отношении общего холестерина печени введение в пищевые диеты липидов приводит к значительному повышению концентрации (мг/г печени) и общего количества (мг/печень) общего холестерина печени (таблица VI). По сравнению с диетой БогЛ, концентрация общего холестерина заметно выше при диетах ЛГС-3 и всех трех диетах И. Напротив, общее количество холестерина в печени оказывается незначительным при диете И-3, тогда как для остальных групп сохраняются существенные отличия от диеты БогЛ.

Увеличение количества пищевых липидов привело к существенному повышению концентрации и общего количества триглицеридов печени (таблица VI). По сравнению с диетой БогЛ, добавление ЛГС или И приводит к повышению концентрации (мг/г печени) триглицеридов печени. Напротив, учитывая различный вес печени у животных из разных групп, не было выявлено значительных расхождений в количестве (мг/печень) триглицеридов печени между группами И-1 и И-3.

Эффект, оказываемый различными количествами ЛГС или И на липидные параметры печени, не коррелируют с количеством поглощенной пищи.

В этом опыте поглощение ЛГС не оказало существенного влияния на изменение массы печени.

Однако полученные результаты показывают, что эффект липогелосом отличается от эффекта ингредиентов.

Заключение
Этот опыт дал несколько важных результатов:
- Использованные количества ЛГС (от 1,25 до 3,75% в диетах) являются нетоксичными.

- Влияние на метаболизм у крысы показано для 3,75% фосфолипидов в форме ЛГС в диетах (отношение триглицеридов к пищевым фосфолипидам: ТГ/ФЛ=5,7). Доза 2,5% оказывает менее выраженный эффект (ТГ/ФЛ=9).

Учитывая то, что крысы обладают хорошо регулируемым липидным метаболизмом, существует вероятность того, что у человека эффект можно наблюдать с дозы 2,5%. Если принять в расчет, что человек ежедневно поглощает приблизительно 100 г триглицеридов, он должен поглотить приблизительно 11 г фосфолипидов в форме ЛГС для проявления эффекта (иными словами, 20 г ЛГС, если ЛГС содержат 55% фосфолипидов).

- Эффекты ЛГС обнаруживаются главным образом на холестерине плазмы и зависят от поглощенной дозы (общий холестерин: коэффициент корреляции R= 0,91; свободный холестерин: R=0,98; этерифицированный холестерин: R=0,88). Понижение касается главным образом ЛОНП и ЛНП.

- Часть эффектов, оказываемых ЛГС на метаболизм липидов, могут быть сравнены с эффектами холестирамина.

Приведенная ниже таблица VIII иллюстрирует эффекты ЛГС на соли желчных кислот и стеролы.

Обобщенные результаты настоящего исследования неожиданным образом показали, что ЛГС обладают следующими свойствами:
- Влияние на метаболизм липидов:
Уменьшение общего холестерина (таблица V) при переходе от контрольной дозы (БогЛ) к дозе, наиболее обогащенной ЛГС (ЛГС-3).

Если говорить точнее, диеты ЛГС-3 приводят к значительному уменьшению общего холестерина плазмы (порядка 22%) и этерифицированного холестерина (порядка 20%). В обоих случаях это уменьшение зависит от дозы. Кроме того, ЛГС-3 приводят к уменьшению общего холестерина в ЛОНП (порядка 44%) и общего холестерина в ЛНП (порядка 36%).

ЛГС вызывают благоприятное распределение липидов различных классов липопротеинов (таблица VI).

- Отсутствие токсичности, гипотоксический эффект:
- Понижение уровня глутамат-оксалацетат-трансаминазы с ЛГС-3 (таблица V) в сравнении с контролем (БогЛ) и тенденция к уменьшению глутамат-пируват-трансаминазы.

- Эффективная пероральная доза:
от 2,5 до 3,75% фосфолипидов в диете.

Уменьшение отношений первичные соли желчных кислот/вторичные соли желчных кислот и первичные нейтральные стеролы/вторичные нейтральные стеролы (таблица VIII); эти результаты указывают на изменение количества и/или качества кишечных бактерий в присутствии ЛГС.

- При применении ЛГС-3 наблюдается увеличение (порядка 36%) выделения с экскрементами нейтральных стеролов и одновременное уменьшение (порядка 17%) выделения желчных кислот.

ПРИМЕР 6: Качественное и количественное сравнение дисперсии липогелосом в водной фазе, полученной на стадии 1 способа примера 1, по отношению к водному раствору, воспроизведенному из порошковой композиции, полученной на стадии 2 в примере 2
Как следует из сказанного, изобретение ни в коей случае не ограничивается способами его осуществления и применения, которые были описаны с большей детализацией. Напротив, изобретение охватывает все варианты, которые могут прийти на ум специалисту в данной области, не выходя при этом за рамки настоящего изобретения.

Формула изобретения

1. Порошковая композиция для перорального введения, отличающаяся тем, что она в основном состоит из униламеллярных липосом, содержащих внешнюю липидную фазу, состоящую в основном из липидов класса 4 (фосфолипидов) за исключением веществ класса 3 (холестерин, неионизованные высшие жирные кислоты) и веществ класса 5 (соли желчных кислот, производные фузидовой кислоты), и внутреннее водное ядро, образующее термообратимый водный гель, простирающийся до внешней липидной фазы, причем это внутреннее водное ядро состоит преимущественно из смеси М по меньшей мере двух различных неполимеризующихся гелеобразующих агентов G1 и G2, точка фазового перехода гель-золь которых выше или равна 37^oС при условии, что G1 представляет собой гелеобразующий агент, выбираемый из желатина и каррагенанов, а G2 выбирают из каррагенанов, отличающихся по своим свойствам от каррагенанов, выбираемых для G1, и целлюлоз, причем диаметр липосом составляет от 20 нм до 1 μм, преимущественно от 50 до 500 нм, и она имеет форму частиц со средним диаметром от 10 до 1000 μм, образованных из одной или нескольких названных выше липосом, покрытых оболочкой, выбранной из группы, в которую входят обезвоженный термообратимый водный гель, идентичный водному гелю внутреннего ядра, декстрины или смесь декстринов таким образом, что композиция содержит в среднем от 10¹⁶ до 10¹⁸ липосом на 1 г порошка.

2. Порошковая композиция по п.1, отличающаяся тем, что названное внутреннее водное ядро дополнительно содержит по меньшей мере один стабилизирующий агент олигосахаридной природы, и/или агент, регулирующий осмолярность среды, и/или поверхностно-активный агент.

3. Порошковая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит 25-75 мас.% липидов класса 4, 5-45 мас.% гелеобразующих агентов, от 0 до 70 мас. % стабилизирующего агента олигосахаридной природы, от 0 до 15 мас.% агента, регулирующего осмолярность среды, от 0 до 20 мас.% поверхностно-активных агентов и от 0 до 15 мас.% декстринов.

4. Порошковая композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что она содержит 70-95% гелеобразующего агента G1 и 5-30% гелеобразующего агента G2.

5. Порошковая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что стабилизирующий агент олигосахаридной природы представляет собой сахарозу, трегалозу или любой другой защитный агент.

6. Порошковая композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что липиды, составляющие внешнюю липидную фазу названных липосом, содержат преимущественно 20-25% фосфатидилхолина, 10-18% фосфатидилэтаноламина и 9-15% фосфатидилинозита.

7. Порошковая композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что липиды, составляющие внешнюю липидную фазу названных липосом, содержат очищенные фосфолипиды, индивидуально или в смеси, преимущественно в тех же количествах, которые указаны в п.6.

8. Порошковая композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что ее применяют для получения лекарственного средства, предназначенного для перорального введения с целью лечения гиперхолестеринемий и/или гипертриглицеридемий.

9. Порошковая композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что ее используют для приготовления добавки для лечения с использованием одного или нескольких активных начал, стимулирующих повышение уровня трансаминаз или какого-либо другого токсичного маркера.

10. Способ получения порошковой композиции по любому из пп.1-7, в которой внешняя оболочка частиц содержит фракцию обезвоженного термообратимого водного геля, отличающийся тем, что он включает следующие стадии: 1) приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром в водной фазе путем (а) приготовления раствора по меньшей мере одного подходящего гелеобразующего агента, в частности, смеси М гелеобразующих агентов G1 и G2, растворением названных гелеобразующих агентов при медленном перемешивании и при температуре, превышающей температуру фазового перехода гель-золь названных гелеобразующих агентов, в водном растворе, (b) введения липидов в полученный на стадии (а) раствор при медленном перемешивании смеси в течение менее 5 ч, преимущественно в вакууме, с образованием эмульсии, и (с) получения дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром в водной фазе, содержащей названные гелеобразующие агенты, при быстром перемешивании полученной на стадии (b) эмульсии, преимущественно в вакууме, 2) получение порошкового продукта путем проведенной подходящим образом непосредственной сушки полученной дисперсии.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию (2) сушки осуществляют распылением, коацервацией, сушкой в тонком слое или грануляцией.

12. Способ по любому из пп.10 и 11, отличающийся тем, что водный раствор со стадии (а) содержит агент регуляции осмолярности среды (например, 0,9%-ный NaCl) и/или стабилизирующий агент олигосахаридной природы.

13. Способ по любому из пп. 10-12, отличающийся тем, что стадию (b) проводят преимущественно при скорости среза ниже 200 с^-1.

14. Способ получения порошковой композиции по любому из пп.1-7, в которой внешняя оболочка частиц содержит фракцию термообратимого водного геля и/или декстрин, отличающийся тем, что он включает следующие стадии: 1) приготовление дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром в водной фазе путем (а) приготовления раствора по меньшей мере одного подходящего гелеобразующего агента, в частности, смеси М гелеобразующих агентов G1 и G2, растворением названных гелеобразующих агентов при медленном перемешивании и при температуре, превышающей температуру фазового перехода гель-золь названных гелеобразующих агентов, в водном растворе, (b) введения липидов в полученный на стадии (а) раствор при медленном перемешивании смеси в течение менее 5 ч, преимущественно в вакууме, с образованием эмульсии, и (с) получения дисперсии липосом с желатинированным внутренним ядром в жидкой водной фазе, содержащей названные гелеобразующие агенты, при быстром перемешивании полученной на стадии (b) эмульсии, преимущественно в вакууме, 2) удаление по меньшей мере части жидкой водной фазы, содержащей указанные гелеобразующие агенты и в которой диспергированы указанные липосомы, 3) добавление по меньшей мере одного подходящего декстрина, 4) получение порошкового продукта сушкой распылением полученного в (3) продукта.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что стадию (2) удаления по меньшей мере части жидкой водной фазы, содержащей названные гелеобразующие агенты, осуществляют путем разбавления и/или фильтрации.

16. Способ по любому из пп.14 и 15, отличающийся тем, что водный раствор со стадии (а) содержит агент регуляции осмолярности среды (например, 0,9%-ный NaCl) и/или стабилизирующий агент олигосахаридной природы.

17. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что стадию (b) проводят преимущественно при скорости среза ниже 200 с^-1.

18. Пищевая добавка, способная регулировать холестеринемию и триглицеридемию, отличающаяся тем, что она содержит порошковую композицию по любому из пп. 1-7, которая может быть объединена с каким-либо подходящим эксципиентом.

19. Пищевая добавка по п.18, отличающаяся тем, что она находится либо в твердом виде (желатинозная капсула, таблетка, водорастворимый порошок), либо в жидком виде путем растворения композиций по любому из пп.1-7 в водном растворе.

20. Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, содержащая порошковую композицию по любому из пп.1-7 и по меньшей мере один подходящий носитель.

21. Фармацевтическая композиция для перорального введения при лечении гиперхолестеринемии и/или гипертриглицеридемии, содержащая порошковую композицию по любому из пп.1-7 и по меньшей мере один подходящий носитель, находящийся либо в твердой форме, либо в жидком виде, полученном при растворении упомянутой порошковой композиции в водном растворе.

22. Дисперсия липосом с желатинированными внутренними ядрами в водном растворе, содержащем смесь определенных в п.1 гелеобразующих агентов, в которой названные липосомы характеризуются следующей морфологией: везикулярная структура с диаметром от 20 нм до 1 μм и полидисперсность липосом с желатинированной внутренней фазой составляет величину от 10 до 55% и преимущественно от 30 до 50%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18