Быстрый способ для свч-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа
Изобретение относится к биотехнологии и касается быстрого способа для СВЧ-опосредованного твердофазного анализа. Сущность способа заключается в проведении ELISA, при осуществлении которого проводится СВЧ-опосредованная иммобилизация антигена или антитела на активированной подложке, при этом воздействие микроволновым излучением с частотой, находящейся в пределах от 2300 и 2500 МГц. осуществляется на каждом этапе от 5 до 200 сек. Устройство для осуществления способа содержит загрузочную камеру, реакционную камеру, состоящую из магнетрона, вытяжного вентилятора и устройства фокусирования света, камеру для промывки и сушки планшета или модуля, камеру для детектирования, платформу для переноса планшетов и компьютерные средства. Преимущества изобретения заключаются в сокращении времени осуществления способа от нескольких часов до 10 минут. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 табл.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к быстрому способу для осуществления СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA). Более конкретно настоящее изобретение относится к быстрому и эффективному способу для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), где все главные этапы ELISA могут быть осуществлены под воздействием микроволнового излучения через короткий период времени. Этот способ предназначен для использования в клинической диагностике, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, защиты в окружающей среды и тому подобное.
Способ ELISA согласно настоящему изобретению является простым, сберегающим время и исключает требующую большого времени трудоемкую процедуру. Этот способ имеет потенциальную возможность для автоматизации.
Этот способ имеет преимущество перед существующими способами для ELISA, которые требуют большого времени, как правило, находящегося в пределах от нескольких часов до 2 дней, в то время как способ согласно настоящему изобретению занимает менее чем 10 минут. Он является предпочтительным для использования при диагностике заболеваний, где требуются быстрые результаты.
Уровень техники
Иммуносорбентный твердофазный анализ (ELISA) представляет собой очень чувствительный способ, используемый для полуколичественного или количественного определения концентрации определенных антигенов и антител. Анализ (ELISA) стал полезным инструментом при диагностике заболеваний как у животных, так и у растений. Кроме этого, его другие применения включают в себя скрининг моноклональных антител в ходе их продуцирования (Douillard, J.Y. and Hoffman, T., 1983), детектирование остатков пестицидов в урожае зерновых (Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V., 1992) и в образцах, взятых из окружающей среды, подобных почве и воде (Linde, D.G. and Goh, K.S., 1995), детектирование апоптоза в культуре тканей и тому подобное (Salgame, P. et al, 1996). Для осуществления ELISA повсеместно используется полистироловый планшет для микротитрования, поскольку он является прозрачным, дешевым, легко доступным, может быть сформован в любой желаемой форме и обладает свойством связывания белков путем адсорбции. Обычные способы ELISA основываются на иммобилизации антигена или антитела на поверхности лунок полистиролового планшета для микротитрования путем адсорбции. Это приписывается нековалентному взаимодействию между биологической молекулой и полистирольной поверхностью.
Однако адсорбция обычно представляет собой слишком неэффективный процесс для получения хороших выходов и не всегда осуществляется в зависимости от дозы. Для преодоления неэффективности обычных способов многими осуществляется ковалентная иммобилизация биологических молекул на планшете для микротитрования (Satoh, A. et al, 1999). Также сообщалось о ковалентном связывании иммуногенов на привитых пластиковых поверхностях (Larsson, P.M. et al, 1987). Несмотря на это, обычный способ ELISA требует для завершения очень длительного периода времени, изменяющегося от нескольких часов до 2 дней. Это является главным недостатком различных способов ELISA, основанных либо на адсорбции, либо на ковалентном связывании. В случае необходимости оказания срочной медицинской помощи, теряется ценное время при осуществлении диагностики перед введением пациенту лекарственных средств. В сельском хозяйстве ELISA используется для детектирования остатков пестицидов в собранном урожае и в образцах, взятых из окружающей среды. Экспорт и маркетинг собранного урожая могут замедляться вследствие этой задержки при использовании способа ELISA, что приводит к потере валютных средств.
Авторы разработали новый и уникальный способ, при котором ELISA может осуществляться быстро, с помощью использования микроволнового (СВЧ) излучения. Микроволновое излучение известно как ускоряющее иммуногистохимию в течение примерно десятка лет (Boon. M.E and Kok, L.P., 1992; Boon, M.E. et al, 1989; Boon, M.E. et al, PCT заявка на патент WO 89703038; Chiu, K.Y. and Chan, K.W., 1987; Hjerpe, A. et al, 1988).
О ковалентной иммобилизации антигена или антитела на полистирольной поверхности под воздействием микроволнового излучения до сих пор не сообщалось. И в самом деле, осуществление всех главных этапов способа ELISA под воздействием микроволнового излучения, за короткое время, для детектирования малых количеств антигена или антитела, с помощью измерения оптической плотности не были известны из уровня техники.
Однако известны попытки осуществления одного из этапов ELISA под воздействием микроволнового излучения (Hjerpe, A. et al, 1988), где полистироловые планшеты для ELISA сначала покрывают антиканцероэмбрионным антигеном кролика, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием антигена (CEA). На следующем этапе, то есть после добавления связанных с ферментом антител, авторы изучали воздействие микроволнового излучения на реакции антиген-антитело.
В другом эксперименте тех же авторов планшеты для ELISA сначала покрывались сывороткой нормальных мышей, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием в течение ночи вместе с немеченным Ig кролика антимышь. на следующем этапе они добавляли комплексы PAP (пероксидаза-антипероксидаза) мыши и определяли воздействие микроволнового излучения на временные константы реакций на этом последнем этапе.
В третьем эксперименте Hjerpe, A. et.al сначала покрывали планшеты неспецифичной сывороткой мышей, с последующим инкубированием вместе с биотинилированным IgG лошади антимышь. Затем планшеты использовались для исследования воздействия микроволнового излучения при последующем связывании биотинавидиновых комплексов.
Во всех указанных выше экспериментах выходы реакций были меньшими у образцов, подвергавшихся воздействию микроволнового излучения, при сравнении с теми, которые обрабатывались без стимуляции с помощью микроволнового излучения. Эксперименты продемонстрировали, что микроволновое излучение вызывает главные потери реакционной способности, и общие выходы составляли приблизительно от 10 до 15%, если сравнивать с теми, которые обычно получались без использования микроволновой печи. Согласно авторам при микроволновой методике уменьшение значений может быть вызвано слишком высокими температурами в лунках, несмотря на тот факт, что в качестве меры компенсации использовались загрузка воды (пробирка с водой, чтобы поглощать избыток СВЧ-энергий) и охлаждаемый нижний планшет.
В дальнейшем эксперименте ELISA авторы (Koh и Boon, 1992) использовали оптоволоконный термометр для ограничения температуры в пределах ниже 40°C. Здесь также использовалась загрузка воды, составляющая 200 мл водопроводной воды. Наряду с этим жидкость в лунках перемешивалась путем медленной продувки воздуха через раствор с помощью тонких пластиковых наконечников, которые были вставлены в лунки. В эксперименте авторов осуществляются только два этапа, а именно этап связывания антитела и конъюгата под воздействием микроволнового излучения, в течение 6 минут, при 150 ватт, каждая.
В другом эксперименте этапы связывания антитела, антигена и конъюгата осуществляются за 15, 30 и 30 минут, соответственно, используя 45-50% микроволновой мощности на каждом этапе.
Оставшиеся этапы в обоих экспериментах осуществляются с помощью обычной процедуры.
Но в указанных выше экспериментах значения ELISA, как обнаружено, являются гораздо меньшими, чем при традиционном способе.
Согласно авторам более длительное время экспонирования дает более высокое значение экстинкции (показатель ELISA), но преимущество во времени выглядит непривлекательно. В действительности, такое преимущество отсутствует при использовании времени экспонирования 30 минут или более. Слишком короткие периоды времена экспонирования приводят к значениям экстинкции, которые являются скорее низкими и не могут быть использованы.
Способы ELISA с экспонированием для микроволнового излучения, о которых сообщалось, имеют несколько недостатков, таких как (1) результаты (значения ELISA) являются гораздо меньшими, чем при обычной процедуре, (2) преимущество по времени не является привлекательным. Может быть возможным получение сравнимых результатов (значений ELISA) путем осуществления ELISA вне микроволновой печи за то же самое время, (3) процедура требует загрузки воды, (4) требуется система охлаждения или охлаждаемый нижний планшет, (5) требуется система перемешивания в лунках планшета для микротитрования, (6) не все этапы осуществляются с помощью энергии микроволнового излучения, и процедура ELISA, о которой сообщается, имеет очень низкий потенциал для автоматизации, если вообще имеет какой-либо.
Авторы настоящего изобретения устраняют все указанные выше недостатки. На самом деле, подобно тепловой энергии, микроволновое излучение также может активировать или инактивировать биологическую молекулу. При отсутствии соответствующих условий микроволновое излучение может вызвать частичное или полное разрушение биологической молекулы, приводя к низкому или нежелательному значению ELISA. В способе согласно настоящему изобретению используются соответствующие условия, большинство из которых представляет собой противоположность способу, известному из уровня техники, или неизвестно в данной области. В способе согласно настоящему изобретению все этапы, исключая проявление окраски, осуществляются при стимуляции под воздействием микроволнового излучения. Этап блокирования не осуществлялся под воздействием микроволнового излучения в известном из уровня технике способе, поскольку он дает неспецифическое связывание, в то время как авторы изобрели способ, где этап блокирования осуществляется в течение короткого времени под воздействием микроволнового излучения. Более длительное время экспонирования для микроволнового излучения в способе, известном из уровня техники, приводит к более высокому значению ELISA, в то время как при осуществлении способа согласно настоящему изобретению он приводит к разрушению материала или к неспецифическому связыванию. Это может происходить из-за того, что загрузка воды или система охлаждения, используемая в способе, известном из литературы, поглощает большую часть энергии микроволнового излучения, давая минимальное воздействие микроволнового излучения и значительное воздействие времени, в обычном способе. В противоположность этому способ согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды, системы охлаждения или системы перемешивания. Более того, в способе согласно настоящему изобретению для ELISA требуется время, примерно в 200 раз меньшее (исключая этап проявления окраски) чем для традиционного способа (который занимает примерно 18 часов), со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA. Кроме того, он также обладает хорошим потенциалом для автоматизации.
Известный из уровня техники ELISA осуществляется на планшете для микротитрования, который не связывает биологическую молекулу с помощью ковалентной связи. На самом деле, известно, что микроволновое излучение может легко воздействовать на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные связи и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.
Цели изобретения
Главной целью настоящего изобретения является создание быстрого и эффективного способа для иммуносорбентного твердофазного анализа, для спектрофотометрического детектирования малых количеств антигена или антитела с целью быстрой диагностики заболеваний.
Другой целью настоящего изобретения является создание способа, который является простым, воспроизводимым и не требует дополнительного опыта или дорогостоящего оборудования.
Другой целью настоящего изобретения является создание быстрой реализации способа, который имеет потенциал для автоматизации и который может свести к минимуму ошибку оператора, которая обычно изменяется от одного человека к другому.
Краткое описание изобретения
Имея в виду достижение целей и преодоление недостатков известного способа ELISA, предусматривается быстрый и эффективный способ для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), который включает в себя этапы: (i) ковалентную иммобилизацию антигена или антитела на активированной твердой поверхности с помощью воздействия микроволнового излучения, (ii) блокировки свободной поверхности с помощью блокирующего агента путем краткого воздействия микроволнового излучения, (iii) связывания антитела или антигена с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (iv) связывания конъюгата с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (v) добавления красителя и субстрата в лунки и (vi) измерения значения коэффициента поглощения.
Процедура СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) осуществляется на активированной поверхности за очень короткое время (около 10 минут) и с такой же эффективностью, как и у обычного ELISA, производимого при 37°C, за 16-18 час.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность автоматизации или полуавтоматизации способа ELISA.
Микроволновое излучение является известным как воздействующее на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные взаимодействия и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.
Для преодоления этой проблемы авторы активируют поверхность лунок планшетов для микротитрования перед использованием. Активированная поверхность иммобилизирует антиген с помощью ковалентной связи при кратком экспонировании для микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдерживать повторяющиеся, но краткие периоды экспонирования для микроволнового излучения, которые являются необходимыми для осуществления последующих этапов ELISA. Последующие этапы связывания биологической молекулы в процедуре ELISA осуществляются с помощью нековалентного связывания, которое является восприимчивым к энергии микроволнового излучения. Эти проблемы преодолеваются путем контроля времени и энергии микроволнового излучения, подводимого на каждом этапе.
Новизна настоящего изобретения заключается в том, что ELISA осуществляется на активированной поверхности, способной к формированию ковалентной связи с белковым лигандом.
СВЧ-опосредованная ковалентная иммобилизация биологической молекулы, более предпочтительно антигена или антитела, на активированной поверхности представляет собой другой новый существенный признак настоящего изобретения.
Контролируемое воздействие микроволнового излучения на каждом этапе процедуры ELISA представляет собой другой новый подход.
В способе согласно настоящему изобретению все этапы ELISA, такие как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и конъюгата, осуществляются под воздействием микроволнового излучения, и только взаимодействие фермент-субстрат осуществляется вне микроволновой печи при комнатной температуре. Способ ELISA согласно настоящему изобретению является очень быстрой, со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA, чем у традиционного способа.
Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды или системы перемешивания.
Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению может быть полностью или частично автоматизирован с использованием специально сконструированного устройства.
Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ согласно настоящему изобретению может быть использован в других иммунологических анализах, таких как радиоиммуннологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, имммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает новый подход к методике иммуносорбентного твердофазного анализа на активированном планшете для микротитрования, модуле или лунке, путем экспонирования для микроволнового излучения. Активированная поверхность иммобилизует антиген путем ковалентного связывания под воздействием микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдержать повторяющееся, но краткое экспонирование для микроволнового излучения, которое необходимо для осуществления следующих далее этапов ELISA. ELISA представляет собой многоэтапный и деликатный процесс, где несоответствующие условия на любом этапе могут повредить результатам в целом.
В способе согласно настоящему изобретению инертная твердая поверхность, такая как полистирол, активируется с помощью фотохимической реакции в сухом состоянии, с использованием фотоактивируемого соединения. Активирование твердой подложки осуществляется путем экспонирования подложки, покрытой фотоактивируемым соединением, для УФ-излучения или яркого солнечного света. Эта активированная подложка используется для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) и для контроля ELISA с целью детектирования антител, например, E.histolytica и Aspergillus fumigatus. При использовании необработанной подложки на ней не удается связать биологические молекулы под воздействием микроволнового излучения за такое короткое время.
Воздействие микроволнового излучения осуществляется внутри бытовой микроволновой печи (BPL-Sanyo, India), работающей на частоте примерно 2450 МГц.
Амёбный антиген получают из культуры E.histolytica согласно опубликованному способу (Sawhney, S., et al, 1980; Sharma, G.L. et al, 1984). Концентрация белков антигенов составляет 1,54 мг на мл, как определяется согласно способу Lowry et.al. (Lowry, O.H., et al, 1951). Антиген разбавляют перед осуществлением ELISA, и для нанесения на лунки используется концентрация 1,0 мкг на лунку.
Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M используется в качестве буфера для покрытия.
Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M, вместе с 0,1% Tween 20, используется в качестве буфера для промывки.
Блокирующий раствор изготавливается путем растворения 2% BSA в 0,01 M PBS, pH 7,2.
Раствор субстрата приготавливают с помощью добавления 0,067% o-фенилендиамина и 0,043% H2O2 в 0,1 M фосфатцитратный буфер, pH 4,5.
Гипериммунные сыворотки для E.histolytica выращивают в кроликах Newzealand White согласно способам Sawhney et al (Sawhney et. al, 1980). Титры антитела в сыворотках проверяются путем исследования с помощью диффузии в геле.
Антитело (+ve сыворотки) разбавляют перед осуществлением ELISA и для экспериментов используется разбавление 1:300 в PBS.
У кроликов берут кровь через ушную вену перед введением иммунизирующей дозы антигена E.histolytica с целью получения сывороток для отрицательного контроля (сыворотки -ve). Используется по 100 мкл разбавленных (1:300) сывороток -ve на каждую лунку.
IgG Антикролик, конъюгированный с пероксидазой хрена, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка.
После восстановления оптимальное разбавление, как обнаружено, составляет 1:4000, что определяется с помощью титрования в шахматном порядке, которое используется в экспериментах.
ELISA представляет собой способ из 5 этапов, а именно связывание антигена, блокировка, связывание антитела, связывание конъюгата и проявление окраски. Каждый этап MELISA оптимизируется путем осуществления следующих далее этапов, согласно обычному способу ELISA. Традиционный ELISA осуществляется путем выдерживания, в течение ночи, покрытых антигеном активированных лунок при 4°C, блокировки лунок через 2 час, при 37°C, с последующим связыванием антитела и конъюгата при 37°C, на 2 ч, каждое, и проявления окраски, то есть взаимодействия фермент-субстрат, при комнатной температуре, в течение 5 минут, с последующим измерением коэффициента поглощения.
В способе согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется путем ковалентной иммобилизации амёбного антигена на активированном полистироловом планшете с микролунками, под воздействием микроволнового излучения при 700 ватт, с различной длительностью по времени. Связывание, детектируемое уже через 10 секунд, увеличивается с увеличением времени воздействия излучения (таблица 1). Через 90 секунд связывание антигена становится более или менее таким же, как через 70 секунд воздействия микроволнового излучения. Следовательно, оптимальное время для иммобилизации антигена принимается равным 70 секунд. В контрольных экспериментах, осуществляемых в течение такого же времени, то есть 70 секунд, при 37°C, никакого связывания антигена с активированной полистирольной поверхностью не наблюдается.
На втором этапе MELISA осуществляется блокировка с помощью 2% BSA через 10 секунд, в микроволновой печи, при мощности 700 ватт, для блокировки свободной поверхности активированной поверхности. Дальнейшее увеличение времени воздействия микроволнового излучения демонстрирует неспецифическое связывание (таблица 2).
На третьем этапе MELISA связывание антитела с иммобилизованным антигеном осуществляется при 155 ватт, в течение 100 секунд. Этот этап является критичным, где неправильные условия, такие как слишком большое время или повышенная выходная мощность, приводят к неспецифическому связыванию, как показано в таблице 3. При 155 ватт через 50 секунд и 100 секунд никакого неспецифического связывания не наблюдается. Хотя через 50 секунд наблюдаемое значение OD является очень низким, 100 секунд, как обнаружено, является превосходным временем, давая высокое отношение сывороток -ve к +ve. Увеличение времени до 150 секунд увеличивает неспецифическое связывание (таблица 4).
На четвертом этапе MELISA осуществляется связывание конъюгата с помощью воздействия микроволнового излучения, при 155 ватт, в течение различных периодов времени. Превосходный результат получается через 100 секунд (таблица 6). Неправильные условия, такие как слишком большое время или более высокая энергия, например 700 ватт, приводят к неспецифическому связыванию (таблица 5).
На каждом этапе осуществляется контрольный эксперимент путем проведения такого же эксперимента вне микроволновой печи, в течение такого же периода времени. Во всех этих экспериментах получают пренебрежимо малый или нежелательный показатель ELISA (неспецифическое связывание).
После оптимизации каждого этапа MELISA авторы осуществляют все этапы при оптимизированных условиях воздействия микроволнового излучения без повреждения биологических молекул. Для достижения указанной оптимизации авторы получают иммобилизованный антиген на активированной лунке через 70 секунд, блокировку через 10 секунд, связывание антитела через 100 секунд и связывание конъюгата через 100 секунд воздействия микроволнового излучения. Общее время, требуемое для всех этих этапов, составляет 280 секунд, только с помощью способа согласно настоящему изобретению, в то время как обычный ELISA осуществляется примерно через 18 часов.
MELISA и ELISA для детектирования антител E.histolytica повторяют при сходных экспериментальных условиях несколько раз, и результаты, как обнаружено, являются в высшей степени воспроизводимыми, как показано в таблице 7.
Способ MELISA дополнительно проверяется путем детектирования антитела Aspergillus fumigatus из сывороток пациентов. Антиген A.fumigatus получают из статической культуры согласно опубликованному способу (Banerjee, B., et al, 1990).
Концентрация белков антигена, как обнаружено, составляет 12,5 мг на мл, как определено с помощью способа Lowry et al. (Lowry et al, 1951). Иммуннореакционная способность антигена проверяется путем использования гипериммунной сыворотки, выращенной в кроликах Newzealand White.
Образцы сывороток получают от 10 пациентов с аллергическим бронхопульмонарным аспергиллозом (ABPA). Все эти пациенты удовлетворяют клиническим критериям ABPA, как описано ранее (Rosenberg, M., et al, 1997).
Образцы сывороток для отрицательного контроля берут от 10 добровольцев, которые, очевидно, являются здоровыми и не имеют никакого респираторного или иного заболевания.
Собранные положительные и отрицательные сыворотки берутся в качестве контролей для ELISA, которые, как обнаружено, сравнимы как для MELISA, так и для обычного ELISA.
Пероксидазу хрена, коъюгированную с IgG анти-человек, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка. После восстановления оптимальное разбавление конъюгата, как обнаружено, составляет 1:4000, как определяется с помощью титрования в шахматном порядке.
Антитело A.fumigatus(присутствующее в сыворотках пациента), детектируемое с помощью способа по настоящему изобретению, совпадает с результатами обычной процедуры ELISA (таблица 8).
Результатам,
полученным в различных экспериментах, присваиваются сравнительные оценки:
Превосходно
Очень хорошо
Хорошо
Плохо
Нежелательные результаты или их отсутствие
-
Общее время, требуемое для MELISA, составляет менее чем 10 минут. Однако время, требуемое для каждого этапа, может изменяться в зависимости от вида биологических молекул, при этом превосходные результаты могут быть получены с помощью небольшой модификации условий реакции, то есть небольшого изменения в длительности и энергии воздействующего микроволнового излучения.
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает быстрый способ СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа, характеризующийся использованием активированной твердой подложки, где указанный способ включает в себя:
(a) создание активированной твердой подложки,
(b) загрузку биологической молекулы, выбранной из антигена или антитела, путем растворения указанной биологической молекулы в буфере, наносимом в активированную лунку указанной твердой подложки, и помещения указанной лунки внутри микроволновой печи, с последующим воздействием на указанную лунку микроволновым излучением с частотой, находящейся в пределах между 2300 и 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 900 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд, с последующей тщательной промывкой лунки с помощью соответствующего буфера для промывки,
(c) блокирование свободных центров связывания лунки с иммобилизованными биологическими молекулами, как она получена после этапа (b), выше, путем загрузки блокирующего раствора в указанную лунку и воздействия на нее, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 800 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд, и промывки указанной лунки соответствующим буфером для промывки,
(d) загрузку соответствующего антитела или антигена, растворенного в буфере, в лунку с иммобилизованным антигеном или антителом, как она получена после этапа (c), выше, с последующим воздействием на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,
(e) загрузку соответствующего конъюгата фермента, растворенного в соответствующем буфере, в указанную выше лунку, полученную после этапа (d), и воздействие на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,
(f) добавление субстрата-красителя буфера в указанную выше лунку, как она получена после этапа (e), выше, и выдерживание ее в течение периода времени, находящегося пределах от 4 до 10 минут, в темноте, с последующим добавлением стоп-раствора и измерением оптической плотности раствора с помощью спектрофотометра, на соответствующей длине волны.
В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению используемая твердая подложка выбирается из группы, состоящей из таких материалов, как полистирол, полипропилен, полиэтилен, стекло, целлюлоза, нитроцеллюлоза, силикагель, поливинилхлорид, полианилин и тому подобное.
В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предпочтительная используемая твердая подложка представляет собой полистирол.
Еще в одном варианте реализации, твердая подложка выбирается из любой конфигурации, формы и размера, такой как листы, пластины, из тест-частиц, таких как шарики и микросферы, пробирок, тест-палочки, тест-полоски, лунка, планшет ELISA, микролуночный планшет или модуль.
В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению твердая подложка, используемая для иммобилизации биологических молекул, выбирается из любых подложек, имеющих, по меньшей мере, одну активную функциональную группу, способную к связыванию молекул-лигандов посредством ковалентной связи.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа выбирается из галогенида, альдегида, ацетила, эпоксида, сукцинамида, изотиоцианата, ацилазида и тому подобное.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа может присутствовать в самой подложке или может быть введена с помощью обычных химических, или фотохимических, или иных способов, известных в данной области.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа вводится на твердую подложку с помощью фотохимической реакции в сухих условиях с использованием фотоактивируемого соединения, которое выбирается из 4-фтор-3-нитроазидобензола, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидобензоата, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидосалициловой кислоты и тому подобное.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению полистирольная поверхность активируется путем нанесения 1-фтор-2-нитро-азидобензола и экспонирования покрытой подложки в сухих условиях для УФ-излучения на 365 нм.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению источник света для фотохимической реакции выбирается из УФ-лампы, лазерного луча, яркого солнечного света или чего-либо подобного.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению время для фотохимического взаимодействия с целью активирования твердой подложки выбирается от 10 секунд до 10 час.
Еще в одном варианте реализации микроволновое излучение формируется в микроволновом устройстве, выбранном из бытовой микроволновой печи, специально сконструированной микроволновой печи или любого устройства или камеры, в котором генерируется микроволновое излучение, и тому подобное.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется с помощью ковалентного связывания антигена или антитела на активированном планшете под воздействием микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-900 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению второй этап ELISA, то есть этап блокировки осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-800 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению третий этап ELISA, то есть связывание соответствующего антитела или антигена, осуществляется путем воздействия микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению четвертый этап ELISA, то есть связывание фермент-конъюгат, осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению общее время для связывания антигена, блокировки, связывания антитела и связывания конъюгата находится в пределах от 195 до 470 секунд, при этом общее время для обычного способа, как правило, находится в пределах от 10 час до 24 час.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению антиген может быть растворен в буфере для нанесения соответствующей композиции, имеющем pH, в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, совместимым с антигеном, таком как карбонатный буфер, фосфатный буфер и тому подобное.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению используемый буфер для промывки представляет собой смесь фосфатного буфера, имеющего pH, находящийся в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, и Tween 20, в пределах между 0,05 и 3%.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению блокирующий реагент выбирается из бычьего сывороточного альбумина, порошкообразного снятого молока, желатина и тому подобное.
Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению биологическая молекула выбирается из антигена или антитела. Антиген может быть любой биологической молекулой, микроорганизмом, веществом и тому подобное, которое вызывает или может, в принципе, вызывать иммунную реакцию.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению антитело выбирается из любой биологической молекулы, которая продуцируется хозяином в ответ на инокуляцию конкретным антигеном и имеет способность к специфическому связыванию антигена.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению конъюгат представляет собой конкретную биологическую молекулу, содержащую антитело или антиген, конъюгированный с ферментом, выбранным из пероксидазы или щелочной фосфатазы.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению фермент может быть заменен меткой, выбранной из хромофора, флуорофора, и тому подобное, которая облегчает его анализ.
Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению способ согласно настоящему изобретению может быть использован для других иммунологических анализов, таких как радиоиммунологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, иммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.
Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает устройство для СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA), содержащее (а) загрузочную камеру, для автоматической загрузки образцов или реагентов из указанной емкости, из тонкой трубки, с помощью соответствующего насоса, на активированный полистироловый планшет/модуль; (b) реакционную камеру, состоящую из магнетрона, вытяжного вентилятора, и тому подобное, для осуществления всех этапов, таких как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и связывание конъюгата антитело-фермент, под воздействием микроволнового излучения, и взаимодействия фермента и субстрата без СВЧ-стимуляции, при температуре окружающей среды, в течение предварительно заданного времени; (с) камеру для промывки и сушки, предназначенную для автоматической промывки и сушки указанного планшета или модуля ELISA, по запрограммированной команде, после каждого этапа способа MELISA; (d) камеру для детектирования, предназначенную для колориметрического детектирования с помощью спектрофотометра; (е) движущуюся платформу, используемую для перемещения планшета/модулей ELISA из одной камеры в другую камеру; (f) компьютерные средства на основе микропроцессора для управления способом MELISA с помощью соответствующего аппаратного и программного обеспечения.
Настоящее изобретение далее объясняется с помощью следующих далее примеров, и они не должны рассматриваться в качестве ограничивающих рамки настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
Активирование твердой подложки
В лунки модуля (12-луночный полистироловый модуль, Dynatech, USA) загружают 1,82 мг 1-фтор-2-нитро-азидобензола (FNAB), растворенного в 100 мкл метанола, на одну лунку, и сушат соответствующим образом, в темноте. затем лунки, покрытые FNAB, облучают в течение 10 мин УФ-светом на 365 нм в UV Stratalinker 2400 (Stratagene®, LISA) или выдерживают на ярком солнечном свету в течение 1 час. Затем лунки промывают несколько раз метанолом для удаления несвязанного линкера и сушат при комнатной температуре. Эти активированные лунки модуля используются для иммобилизации антигенов или антител в процедуре по настоящему изобретению.
ПРИМЕР 2
Иммобилизация антигена Entanweba histolytica под воздействием микроволнового излучения
Антиген E. histolytica (1 мкг), разбавленный в 100 мкл PBS, загружают в активированную лунку модуля и подвергают воздействию микроволнового излучения в течение 10 секунд, внутри бытовой микроволновой печи (BPL-Sanyo, India), работающей на частоте примерно 2450 МГц, с максимальной выходной мощностью примерно 700 ватт. Воздействие микроволнового излучения осуществляют в микроволновой печи, настроенной на максимальную мощность, на цифре 10, то есть с рабочим циклом магнетрона 100% от выходной мощности 700 ватт.
Лунку тщательно промывают буфером для промывки с тем, чтобы удалить несвязанный антиген. Последующие этапы осуществляются согласно традиционному способу. Так, блокирование с помощью блокирующего раствора (200 мкл), связывание антитела (100 мкл) и связывание конъюгата IgG лошади антикролик и пероксидазы хрена (100 мкл) осуществляется путем инкубирования при 37°C, в течение 2 часов, каждое. После каждого этапа лунку тщательно промывают с помощью буфера для промывки. Проявление окраски производится с использованием 100 мкл раствора субстрата. Лунка считывается на 490 нм, в ELISA Reader (Spectramax 190 микроплашетный спектрофотометр, Molecular Devices Corporation, California 94089), и измеряются значения коэффициента поглощения. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках каждый. Подобные же эксперименты проводятся и с сыворотками -ve.
Контрольный эксперимент с использованием микроволнового излучения осуществляется подобным же способом, с использованием необработанных лунок. Другой контрольный эксперимент осуществляется с использованием активированных лунок, путем инкубирования антигена при 37°C, в течение такого же периода времени, как это делается под воздействием микроволнового излучения. В обеих контрольных реакциях иммобилизации антигена не происходит.
Весь эксперимент повторяют отдельно, варьируя время для связывания антигена по 30, 50, 70, и 90 секунд, каждый раз.
Результаты оптимизации времени связывания антигена для воздействия микроволнового излучения приведены в таблице 1.
ПРИМЕР 3
Блокирование свободной поверхности с помощью блокирующего агента под воздействием микроволнового излучения
Антиген E.histolytica иммобилизуется под воздействием микроволнового излучения в активированной лунке модуля через 70 секунд, как указано выше. После тщательной промывки с помощью буфера для промывки в лунку добавляют 200 мкл блокирующего раствора и воздействуют на него микроволновым излучением при 700 ватт, в течение 10 секунд. Последующие стадии связывания антитела и конъюгата производят вне микроволновой печи, как описано в примере 2. Проявление окраски и измерение коэффициента поглощения также проделывают таким же образом, как и в примере 2.
Подобные эксперименты проделывают и с сыворотками -ve.
Чтобы проверить оптимальность времени для блокировки, два различных эксперимента осуществляют сходным образом, за исключением того, что время экспонирования для микроволнового излучения увеличивается до 40 и 60 секунд. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.
Результаты оптимизации времени блокировки под воздействием микроволнового излучения приведены в таблице 2.
ПРИМЕР 4
Связывание антитела под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии
Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке модуля под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 70 секунд, с последующей блокировкой свободной поверхности с помощью блокирующего агента под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, как в примере 3. Антиамебное антитело (100 мкл) загружают в лунку, затем лунка экспонируется для микроволнового излучения в течение 10 секунд, при 700 ватт. После соответствующей промывки лунок с помощью буфера для промывки связывание конъюгата и следующее затем проявление окраски осуществляют, как в примере 3. Подобные же эксперименты осуществляют и с сыворотками -ve. Эксперимент повторяют с варьированием времени экспонирования для микроволнового излучения, при 30, 50, 70 и 90 секунд, каждое, для связывания антител, выдерживая все остальные условия сходными. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.
Результаты связывания антител под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии представлены в таблице 3.
ПРИМЕР 5
Связывание антител под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии.
Здесь производятся эксперименты по связыванию антител в условиях, сходных с теми, которые описаны в примере 4, за исключением того, что этап связывания антител осуществляется при низком уровне энергии, то есть при 155 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения составляет 10, 50, 100 и 150 секунд, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов.
Результаты по связыванию антител под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии показаны в таблице 4.
ПРИМЕР 6
Связывание конъюгата под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии.
Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, через 70 секунд, с последующим блокированием под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, и связыванием антител, при 155 ватт, в течение 100 секунд, как в примере 5.
100 мкл Конъюгата IgG-лошади антикролик и пероксидазы загружают в лунку и подвергают воздействию микроволнового излучения при 700 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения составляет 5, 10, 15 и 20 секунд, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов, где все остальные условия поддерживаются сходными с теми, что в примере 5. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.
Результаты по связыванию конъюгата под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии показаны в таблице 5.
ПРИМЕР 7
Связывание конъюгата под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии.
Здесь осуществляются эксперименты для второго связывания конъюгата-антитела в условиях, подобных тем, которые описаны в примере 6, за исключением того, что второй этап связывания конъюгата-антитела осуществляется при низком уровне энергии, то есть при 155 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения выдерживается равным 50, 100 и 120 секундам, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов.
Результаты связывания конъюгата под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии показаны в таблице 6.
ПРИМЕР 8
Детектирование антител E. histolytica с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA)
Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 70 секунд, блокируют с помощью блокирующего раствора, под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, связывание антител происходит при 155 ватт, через 100 секунд, а затем - связывание конъюгата с антителом, при 155 ватт, через 100 секунд, как описано выше в примерах. Подобные же эксперименты производят с сыворотками -ve. Все эксперименты осуществляют в сдвоенных лунках и повторяют 5 раз. После каждого этапа осуществляют тщательную промывку с помощью буфера для промывки.
Обычный ELISA осуществляют с теми же реагентами, субстратом и буфером, за исключением того, что все этапы осуществляют без стимуляции микроволновым излучением. Таким образом, ELISA осуществляют путем нанесения на активированные лунки антигена в течение ночи при 4°C, с последующим блокированием, связыванием антитела и конъюгата при 37°C в течение 2 ч, каждое. Проявление окраски является одним и тем же для процедуры по настоящему изобретению и для обычной процедуры.
Результаты детектирования антитела E.histolytica с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA), представлены в таблице 7.
ПРИМЕР 9
Детектирование антител A.fumigatus с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA)
Детектирование антител A.fumigatus в сыворотках пациентов осуществляют с помощью способа СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA) в условиях, подобных тем, которые описаны в примере 8, за исключением того, что антиген представляет собой A.fumigatus, антитело собирают из сывороток 10 различных пациентов, контрольные сыворотки, не содержащие специфического антитела, собирают от здоровых добровольцев, и конъюгат представляет собой IgG античеловек - пероксидазу. Все эксперименты осуществляют в сдвоенных лунках.
Результаты детектирования антител A.fumigatus с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA) представлены в таблице 8.
Таблица 1:Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первого этапа согласно способу MELISA, а оставшихся этапов согласно способу ELISA.
MELISA: Этап-1. Иммобилизация антигена под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, на активированных лунках в течение различных периодов времени, согласно таблице, контроль: 37°С, 70 секунд
ELISA: (Этап - 2-5) Традиционный способ
| Время (в сек) | + ve сыворотки | - ve сыворотки | Примечания | ||||
| 10 | 0.188 | 0.196 | 0.191 | 0.002 | 0.004 | 0.003 | + + |
| 30 | 0.208 | 0.193 | 0.198 | 0.005 | 0 001 | 0.002 | + + |
| 50 | 0.226 | 0.211 | 0.214 | 0.006 | 0.002 | 0.004 | + + + |
| 70 | 0.363 | 0.355 | 0.358 | 0.005 | 0.001 | 0.003 | + + + + |
| 90 | 0.370 | 0.360 | 0.367 | 0.001 | 0.003 | 0.004 | + + + + |
| Контроль | 0.003 | 0.001 | 0.004 | 0.006 | 0.004 | 0.002 | - |
Таблица 2: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых двух этапов согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - изменяемое время, согласно таблице, 700 ватт.
ELISA: (Этап – 3-5) Традиционный способ.
Таблица 3: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых трех этапов, согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - изменяемое время - согласно таблице, 700 ватт. ELISA: (Этап-4 и 5) Традиционный способ.
| Время (в сек) | Сыворотки +ve | сыворотки - ve | Примечания | ||||
| 10 | 0.216 | 0.203 | 0.211 | 0.087 | 0.123 | 0.098 | + |
| 30 | 0.392 | 0.353 | 0.388 | 0.100 | 0.137 | 0.114 | - |
| 50 | 1.413 | 1.177 | 1.213 | 0.194 | 0.180 | 0.194 | + + |
| 70 | 1.313 | 1.253 | 1.276 | 1.263 | 1.279 | 1.275 | - |
| 90 | 1.287 | 1.239 | 1.238 | 1.288 | 1.248 | 1.234 | - |
Таблица 4: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых трех этапов, согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - изменяемое время - согласно таблице, 155 ватт. ELISA (Этап-4 - 5): Традиционный способ.
Таблица 5: Детектирование антител E. histolytica путем осуществления первых четырех этапов, согласно способу MELISA, а последнего этапа - согласно традиционному способу.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - изменяемое время - согласно таблице, 700 ватт. Этап-5. проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.
| Время (в сек) | сыворотки +ve | сыворотки -ve | Примечания | ||||
| 5 | 0.147 | 0.136 | 0.138 | 0.032 | 0.020 | 0.23 | + + |
| 10 | 0.166 | 0.166 | 0.168 | 0.087 | 0.093 | 0.85 | + |
| 15 | 0.192 | 0.171 | 0.183 | 0.110 | 0.119 | 0.116 | - |
| 20 | 0.388 | 0.503 | 0.446 | 0.312 | 0.288 | 0.293 | - |
Таблица 6: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых четырех этапов, согласно способу MELISA, а последнему этапу - согласно традиционному способу.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - изменяемое время - согласно таблице, 155 ватт. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.
| Время (в сек) | сыворотки +ve | сыворотки -ve | Примечания | ||||
| 50 | 0.205 | 0.189 | 0.192 | 0.021 | 0.018 | 0.022 | + + |
| 100 | 0.558 | 0.532 | 0.543 | 0.036 | 0.031 | 0.032 | + + + + |
| 120 | 0.145 | 0.193 | 0.157 | 0.023 | 0.014 | 0.023 | + |
Таблица 7: Детектирование антител E.histolytica: Сравнение способов MELISA и ELISA.
MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - 100 секунд, 155 ватт. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.
ELISA: Этап-1. Cвязывание Ag - в течение ночи, при 4°C. Этап-2. Блокировка - 2 ч, при 37°C. Этап-3. Связывание антитела - 2 ч, при 37°C. Этап-4. Связывание конъюгата - 2 ч, при 37°C. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.
| Серийн. № | сыворотки +ve | сыворотки -ve | ||||||
| MELISA | ELISA | MELISA | ELISA | |||||
| 1 | 0.567 | 0.556 | 0.539 | 0.560 | 0.036 | 0.070 | 0.046 | 0.040 |
| 2 | 0.531 | 0.556 | 0.538 | 0.534 | 0.096 | 0.056 | 0.064 | 0.070 |
| 3 | 0.541 | 0.563 | 0.549 | 0.547 | 0.098 | 0.053 | 0.064 | 0.050 |
| 4 | 0.558 | 0.545 | 0.574 | 0.544 | 0.052 | 0.080 | 0.074 | 0.110 |
| 5 | 0.557 | 0.564 | 0.558 | 0.540 | 0.049 | 0.079 | 0.056 | 0.090 |
| Примечания | Воспроизводимый | Воспроизводимый | Воспроизводимый | Воспроизводимый |
Таблица 8: Детектирование антител Aspergillus fumigatus
Сравнение способов MELISA и ELISA. Следуют тем же способам, которые описаны в таблице 7.
| № образца | сыворотки +ve | сыворотки -ve | ||||||
| MELISA | ELISA | MELISA | ELISA | |||||
| 1 | 0.334 | 0.356 | 0.339 | 0.320 | 0.036 | 0.070 | 0.116 | 0.130 |
| 9 | 0.331 | 0.356 | 0.438 | 0.380 | 0.096 | 0.056 | 0.094 | 0.110 |
| 3 | 0.351 | 0.380 | 0.379 | 0.410 | 0.098 | 0.053 | 0.164 | 0.150 |
| 4 | 0.498 | 0.525 | 0.574 | 0.520 | 0.052 | 0.080 | 0.174 | 0.170 |
| 5 | 0.685 | 0.664 | 0.658 | 0.641 | 0.049 | 0.079 | 0.056 | 0.080 |
| 6 | 0.367 | 0.375 | 0.372 | 0.390 | 0.063 | 0.047 | 0.093 | 0.110 |
| 7 | 0.430 | 0.449 | 0.412 | 0.400 | 0.114 | 0.131 | 0.110 | 0.150 |
| 8 | 0.550 | 0.560 | 0.527 | 0.510 | 0.090 | 0.077 | 0.098 | 0.100 |
| 9 | 2.204 | 2.081 | 1.984 | 2.300 | 0.058 | 0.061 | 0.073 | 0.120 |
| 10 | 0.346 | 0.341 | 0.327 | 0.310 | 0.039 | 0.037 | 0.142 | 0.160 |
| Примечания | Сравнимый | Меньшее неспецифическое связывание в MELISA |
Устройство для MELISA
Устройство для MELISA может быть сконструировано с помощью следующих компонентов:
(a) Загрузочная камера: она представляет собой камеру для автоматической загрузки образцов или реагентов из заданной емкости через тонкую трубку и с помощью соответствующего насоса на активированный полистироловый планшет/модуль.
(b) Реакционная камера: Реакционная камера состоит из магнетрона, вытяжного вентилятора и устройства фокусировки света, для осуществления этапов связывания антигена, блокировки, связывания антитела и связывания конъюгата антитела и фермента под воздействием микроволнового излучения и реакции фермента и субстрата при температуре окружающей среды через предварительно заданное время, как описывается в п.1 формулы изобретения.
(c) Камера для промывки и сушки: в этой камере промывка и сушка планшета или модуля ELISA осуществляются автоматически согласно команде программы после каждого этапа способа MELISA.
(d) Камера для детектирования: эта камера используется для колориметрического детектирования с помощью спектрофотометра.
(e) Перемещаемая платформа: она используется для переноса планшетов/модулей Elisa из одной камеры в другую камеру.
(f) Контрольный узел: он содержит компьютерные средства на основе микропроцессора для контроля способа MELISA, как описано в п.1 формулы изобретения, с помощью соответствующего аппаратного и программного обеспечения.
Преимущества изобретения
Традиционные способы ELISA, как правило, занимают от нескольких часов до 2 дней, для завершения, что является главным недостатком способа, используемого во всем мире в различных областях, кроме клинической диагностики. В случае срочной необходимости в медицинской помощи ценное время теряется при диагностике, перед тем, как пациент сможет получить необходимое лечение. По этой причине быстрое осуществление способа ELISA согласно настоящему изобретению (MELISA) будет иметь преимущество и будет полезной для диагностики заболеваний, для биомедицинских исследований и для других родственных областей. Главные преимущества способа ELISA согласно настоящему изобретению заключаются в следующем:
1. Способ согласно настоящему изобретению является гораздо более быстрым, чем существующие способы ELISA.
2. Общее время, требуемое в способе согласно настоящему изобретению, составляет менее чем 10 минут. Таким образом, он делает ненужной требующую большого времени, трудоемкую процедуру.
3. Способ согласно настоящему изобретению является очень чувствительным и требует очень малых количеств ценного антигена или антитела.
4. Способ согласно настоящему изобретению является очень точным, поскольку взаимодействие фермент-субстрат осуществляется в растворе и количественно характеризуется спектрофотометрически.
5. Способ является простым и не требует никакого дополнительного опыта или реагента для его осуществления.
6. Способ согласно настоящему изобретению является экономически эффективным и не требует никакого дополнительного оборудования, за исключением бытовой микроволновой печи, которую можно найти в большинстве лабораторий.
7. Способ согласно настоящему изобретению является воспроизводимым, что представляет собой важный критерий для ELISA.
8. Способ обеспечивает минимальное или пренебрежимо малое неспецифическое связывание.
9. Способ имеет потенциал для автоматизации, которая может свести к минимуму ошибку оператора, которая обычно изменяется от одного человека к другому.
10. Способ согласно настоящему изобретению имеет потенциал для применения в других иммунологических анализах, таких как радиоиммунологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, имммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.
Таким образом, способ ELISA согласно настоящему изобретению является быстрым, экономичным, воспроизводимым, простым и имеет потенциал для автоматизации. Он будет иметь преимущества для лечения людей, благодаря его возрастающей важности в клинической диагностике, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, пищевой технологии, в науке об окружающей среде, в биомедицинских исследованиях и в других родственных областях.
Литература
1. Douillard, J.Y. and Hoffman, T. (1983) Methods in Enzymology 92, 168-174.
2. Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V. (1992) Analytical Chemistry, 64. 79A-88A.
3. Linde, D.G. and Goh, K.S.(1995) Pesticide Outlook, 18-23.
4. Salgame, P., Varadhachary, A.S, Primiano, L.L., Finke; IE., Muller, S. and Monestier. M. (1996) Nucleic Acids Res.25, 680-681.
5. Satoh, A., Fukui, S., Yoshino, S. Shinoda, M.Kozima, K. and Matsumoto, I. (1999) Analytical Biochemistry 275, 231-235.
6. Larsson, P.M., Johansson, S.G.O., Huh, A. and Gothe, S. (1987) Journal of Immimological Methods 98, 129-135.
7. Boon, M.E and Kok, L.K. (1992) Microwave irradiation in immunostaining, p.256-285. In Microwave Cookbook of Pathology: The Art of Microscopic Visualisation. 3rd. Ed. Columbia press Leyden, Leiden.
8. Boon, M.E., Kok, L.K., Moorlag, H.E. and Suurmeijer (1989). Am.J.Clin. Pathol. 92:137-143.
9. Chiu, K.Y. and K.W. Chan. 1987. J.Clin.Pathol. 40:689-692.
10. Hjerpe, A., Boon, M.E. and Kok, L.P. (1988). Histochem.J. 20:388-396.
11. Koh, L.P. and Boon, M.E. (1992) Microwave Cookbook for Microscopists: Art and Science of Visualization, Third Edition. Coulomb Press Leyden: The Netherlands.
12. Sawhney, S. Chakravarti, R.X. Jain. P. and Vinayak, V.K. 1980. Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg. 74: 26-29.
13. Sharma, G.L, Naik, S.R. and Vinayak, Y.K. 1984. Aust.J.Exp.Biol.Med.Sc. 62: 117-133.
14. Lowry, O.K., Rosebrough, N.J., Fair. A.L. and Randall. R.J. 195L J.Biol.Chem. 193: 265.
15. Voller A., Bidwell D, Bartett A. Microplate ELISA and its application. In Imraunoenzymatic Analysis Techniques. Malvano R. ed. The Hague Martinus Nijhoff Publ. 1980, p104-115.
16. Banerjee, B., Chetty, A., Joshi, A.P., and Sarma, P.U., 1990, Asian Pacific J Allergy Immunol. 8:13-18).
17. Rosenberg, M., Patterson, R., Mintzer, R., Cooper, B.J., Roberts, M. and Harris, K.E., Ann Intern Med 1997, 86:405-414).
Другие ссылки
Патентные документы
Apr., 1989 Boon et al PCT заявка на патент WO 897 03038.
1. Быстрый способ для СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа с использованием активированной твердой подложки, при этом указанный способ включает в себя следующие стадии:
(a) активирование поверхности лунок твердой подложки,
(b) загрузку биологической молекулы, выбранной из антигена или антитела, путем растворения указанной биологической молекулы в буфере, наносимом в активированную лунку указанной твердой подложки, и помещения указанной лунки внутри микроволновой печи, с последующим воздействием на указанную лунку микроволновым излучением с частотой, находящейся в пределах между 2300 и 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 900 В, в течение периода времени, находящегося в пределах 50-100 с, с последующей тщательной промывкой лунки с помощью соответствующего буфера для промывки,
(c) блокирование свободных центров связывания в лунке с иммобилизованными биологическими молекулами, как она получена на этапе (b), изложенном выше, путем загрузки блокирующего раствора в указанную лунку и воздействия на нее внутри микроволновой печи микроволновым излучением с частотой 2300-2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 800 В, в течение периода времени, находящегося в пределах 5-20 с, и промывки указанной лунки соответствующим буфером для промывки,
(d) загрузку соответствующего антитела или антигена, растворенного в буфере, в лунку с иммобилизованным антигеном или антителом, как она получена на этапе (с), изложенном выше, с последующим воздействием на указанную лунку внутри микроволновой печи микроволновым излучением с частотой 2300-2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах 50-200 В, в течение периода времени, находящегося в пределах 90-200 с, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,
(e) загрузку соответствующего конъюгата фермента, растворенного в соответствующем буфере, в указанную выше лунку, полученную на этапе (d), изложенном выше, при этом используемый конъюгат выбирается из биологической молекулы, содержащей антитело или антиген, конъюгированный с ферментом, выбранным из пероксидазы или щелочной фосфатазы, и воздействие на указанную лунку внутри микроволновой печи микроволнового излучения с частотой 2300-2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах 100-300 В в течение периода времени, находящегося в пределах 50-150 с, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,
(f) добавление забуференного субстрат-красителя в указанную выше лунку, как она получена на этапе (е), изложенном выше, и выдерживание ее в течение периода времени, находящегося в пределах 4-10 мин, в темноте, с последующим добавлением стоп-раствора и измерением оптической плотности раствора с помощью спектрофотометра, на соответствующей длине волны.
2. Способ по п.1, в котором используемая твердая подложка выбирается из группы, состоящей из полистирола, полипропилена, полиэтилена, стекла, целлюлозы, нитроцеллюлозы, силикагеля, поливинилхлорида, полианилина и тому подобного.
3. Способ по п.1, в котором предпочтительная используемая твердая подложка представляет собой полистирол.
4. Способ по п.1, в котором твердая подложка выбирается любой конфигурации, формы и размера, такой, как листы, пластины, тест-частицы, такие, как шарики и микросферы, пробирок, тест-палочки, тест-полоски, лунка, планшет ELISA, микролуночный планшет или модуль.
5. Способ по п.1, в котором твердая подложка, используемая для иммобилизации биологических молекул, выбирается из любых подложек, имеющих, по меньшей мере, одну активную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из галогенида, альдегида, ацетила, эпоксида, сукцинамида, изотиоцианата, ацилазида и тому подобного.
6. Способ по п.1, в котором функциональная группа может присутствовать в самой подложке или может вводиться с помощью обычных химических или фотохимических способов и тому подобных.
7. Способ по п.1, в котором антиген либо вызывает иммунную реакцию, либо может, в принципе, ее вызывать.
8. Способ по п.1, в котором воздействие микроволнового излучения осуществляется в устройстве или камере, где может генерироваться микроволновое излучение, и которая выбирается из бытовой микроволновой печи, заданной сконструированной микроволновой печи или любого устройства или камеры, в которой генерируется микроволновое излучение.
9. Способ по п.1, в котором общее время для связывания антигена, блокирования, связывания антитела и связывания конъюгата находится в пределах 195-470 с.
10. Способ по п.1, в котором блокирующий агент выбирается из группы, состоящей из бычьего сывороточного альбумина, порошкообразного снятого молока и желатина.
11. Способ по п.1, в котором буфер для покрытия выбирается из карбонатного буфера, фосфатного буфера, имеющего значение рН в пределах 6,5-11, с молярностью в пределах 0,005-0,1 М.
12. Способ по п.1, в котором используемый буфер для промывки представляет собой смесь солевого фосфатного буфера, имеющего значение рН в пределах 6,5-11, с молярностью в пределах 0,005-0,1 М, и Tween 20, в пределах между 0,05%-3%.
13. Способ по п.1, который предназначен для использования при осуществлении анализа, выбираемого из группы с различными типами ELISA, такими, как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич- ELISA, и тому подобное.
14. Устройство для СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA), содержащее
(a) загрузочную камеру для автоматической загрузки образцов или реагентов из заданной емкости через тонкую трубку и с помощью соответствующего насоса на активированный полистироловый планшет/модуль,
(b) реакционную камеру, состоящую из магнетрона, вытяжного вентилятора и устройства фокусирования света, для осуществления этапов связывания антигена или антитела, блокировки, последующего связывания антитела или антигена, связывания конъюгата антигена или антитела и фермента под воздействием микроволнового излучения и реакции фермента и субстрата при температуре окружающей среды через предварительно заданное время, по п.1,
(c) камеру для автоматической промывки и сушки указанного планшета или модуля ELISA согласно команде программы после каждого этапа способа MELISA;
(d) камеру для детектирования, для колориметрического детектирования с помощью спектрофотометра;
(e) перемещаемую платформу, используемую для переноса планшетов/модулей ELISA из одной камеры в другую камеру;
(f) компьютерные средства на основе микропроцессора для контроля способа MELISA по п.1 с помощью соответствующего аппаратного и программного обеспечения.
