Иммуноферментная тест-система для идентификации спектра антител к вич 1 и 2 выявления антигена вич 1 (p24) "дс-ифа-анти-вич 1 и 2, вич 1 группы о-спектр+аг p24 вич 1"
Владельцы патента RU 2283497:
Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" (ООО НПО "Диагностические системы") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Иммуноферментная тест-система для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24 включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 p24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, и для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности, упрощение, исключение субъективности оценки результатов. 1 з.п. ф-лы, 10 табл., 1 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Использование: дифференцированное выявление всех классов специфических антител к белкам вируса иммунодефицита человека 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антигена р24 ВИЧ 1.
Сущность: получение иммуноферментной тест-системы для идентификации спектра антител всех классов к отдельным белкам и ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антигена р24 ВИЧ 1 в сыворотке (плазме) крови, иммуноглобулинах и препаратах крови человека с целью идентификации спектра антител к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О, выявления антигена р24 ВИЧ 1 и подтверждения положительных или сомнительных результатов скрининга на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции базируется на трех направлениях: а) индикация ВИЧ и его компонентов; б) выявление антител к ВИЧ; в) определение изменений в иммунной системе. Среди существующих методов лабораторной диагностики наиболее распространены серологические - выявление антител к антигенам вируса.
Для выявления антител при ВИЧ-инфекции в основном используют иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ). В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, с которыми связываются антитела больного, а комплекс антиген-антитело выявляется с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител мыши к иммуноглобулинам G и М человека. Метод довольно специфичен и чувствителен и позволяет выявлять вирусспецифические антитела у 95% больных. Остальные 5% случаев приходятся на ранние этапы инфицирования, когда антител в сыворотке крови еще мало или на терминальные фазы болезни, когда организм уже не в состоянии синтезировать антитела в силу резкого истощения иммунной системы. Возможны также ложноположительные результаты ИФА, в основном у больных аутоиммунными и онкологическими заболеваниями, а также при инфекции, вызванной вирусом Эшптейна-Барр. При этом происходит перекрестная реакция антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейна-Барр или к антигенным детерминантам, похожим на белки главного комплекса гистосовместимости 1 и 2 класса (HLA-4 и DQW3) и обладающим способностью связываться с антигенами ВИЧ. Ложноположительные результаты часто наблюдаются у беременных женщин и пожилых людей. Гемолиз, липемия, бактериальное загрязнение сывороток также могут являться причиной недостоверных результатов.
В связи с этим предложен и используется ряд методов для проверки специфичности результатов обнаружения антител. Из этих методов наиболее часто применяют реакцию "иммунный блотинг" в модификации "Western Blot". Суть метода заключается в следующем: на первом этапе производят разделение белков ВИЧ по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. Перенесенные таким образом антигены выявляются на мембране с помощью непрямого анализа: мембрана инкубируется с исследуемым материалом; содержащиеся антитела связываются с антигенами ВИЧ, перенесенными на нитроцеллюлозную мембрану, далее полоски мембраны инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген - антитело - конъюгат. На чертеже представлены примеры положительного, слабоположительного и отрицательного результатов иммуноблота.
В сыворотке лиц, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2, обнаруживают антитела к следующим белкам (р) и гликопротеидам (gp): таблица А.
| Таблица А Белки и гликопротеиды ВИЧ 1 и 2 | ||
| Группа белков | ВИЧ-1 | ВИЧ-2 |
| Белки оболочки вируса (env) | gp160 кД, gp120 кД, gp41 кД | gp140 кД, gp105 кД, gp36 кД |
| Белки ядра (gag) | р17 кД, р24 кД, р55 кД | р16 кД, р25 кД, р56 кД |
| Ферменты вируса (pol) | р66 кД, р51 кД, р31 кД | р68 кД |
В таблице В представлены критерии оценки результатов иммунного блотинга, рекомендуемые ВОЗ и Российским центром по профилактике и борьбе со СПИДом.
| Таблица В Рекомендуемые критерии оценки результатов иммунного блотинга (ВИЧ-1) | |||
| Название центров | Положительный результат | Сомнительный результат | Отрицательный результат |
| ВОЗ | Антитела к gp41 и gp120, или к gp41 и gp160, или к gp120 и gp160 | Антитела к другим белкам ВИЧ | Отсутствие антител |
| Федеральный научно-методический центр МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом. | Антитела хотя бы к одному из гликопротеидов - gp41, gp120, gp160, в сочетании с антителами к другим белкам или без них | Антитела к другим белкам ВИЧ | Отсутствие антител |
Исходя из критериев ВОЗ, положительными считают сыворотки, в которых методом ИБ обнаруживают антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ-1. При наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании с реакцией с другими белками или без нее результат считают сомнительным. По данным Федерального научно-методического центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом возможна трактовка сывороток как положительных и при наличии антител только к одному белку оболочки.
Выявление антител к антигену р24 может указывать на период начала сероконверсии, так как антитела именно к этому белку появляются первыми. Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также указывать на наличие инфекции ВИЧ-2 или на неспецифическую реакцию.
Использование при диагностике ВИЧ в качестве экспертного метода реакции иммуноблотинга имеет ряд существенных недостатков:
1. Невозможность подтверждения выявления антигена р24 ВИЧ 1 в случае использования тестов, определяющих одновременно антиген и антитела к ВИЧ, что делает нецелесообразным (бессмысленным) использование в качестве скрининговых тесты для одновременного выявления антигена и антител к ВИЧ (приказ Минздрава РФ №292 от 30.07.2001: "для обследования доноров на станциях переливания крови необходимо использовать тест-системы, выявляющие одновременно антиген и антитела к ВИЧ").
2. Выявление антител только IgG класса. Невозможно полноценное подтверждение положительных результатов, полученных при использовании тестов 3 и 4 поколения (выявляющих антитела IgG и IgM).
3. Субъективность интерпретации оценки теста, особенно в случаях "сомнительных" и "неопределенных" результатов и в начальных стадиях сероконверсии (выявляемые полосы на нитроцеллюлозных мембранах в этих случаях бывают нечеткими, едва видны невооруженным глазом и при оценке разными лицами зачастую наблюдаются разногласия).
4. Невозможность автоматизированной количественной оценки результатов анализа.
5. Более низкая по сравнению с ИФА чувствительность.
6. Недолговечность хранения (при хранении полоски нитроцеллюлозной мембраны выцветают и не могут являться объективным подтверждением выявления или не выявления ВИЧ в спорных случаях).
7. Трудность при постановке реакции и хранении (полоски нитроцеллюлозной мембраны очень хрупкие и часто ломаются).
8. Высокая стоимость наборов ИБ.
Известен реагент, представляющий собой набор для одновременного определения антигенов и антител к одному и тому же патогену, в том числе ВИЧ (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Однако не раскрывается тест-система, позволяющая диагностировать ВИЧ-инфекцию на различных стадиях.
Задачей настоящего изобретения является получение тест-системы, с помощью которой достигается возможность подтверждения позитивных или сомнительных результатов скрининговых исследований на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1 при использовании тестов для одновременного выявления антигенов и антител.
Предлагаемое техническое решение достигается иммуноферментной тест-системой для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена р24 к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, характеризующейся тем, что она включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека, представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа.
Кроме того, для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты для иммуноферментного анализа.
Технический результат, достигаемый настоящим изобретением заключается в возможности подтверждения позитивных результатов на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1, высокой чувствительности, возможности автоматизированной интерпретации результатов, что исключает субъективность оценки, простоте выполнения теста, меньшей по сравнению с существующими наборами ИБ стоимости.
Данное техническое решение отличается от известных:
1. Использованием в качестве твердофазного носителя планшета для иммунологических реакций.
2. Одновременным использованием в качестве сорбента антител к р 24 ВИЧ и набора антигенов ВИЧ.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Действующим началом разработанной тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР + АГ р24 ВИЧ 1" являются:
- иммуносорбент - рекомбинантные антигены, аналогичные структурным белкам ВИЧ-1: gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ 1 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), ВИЧ-2: gp36 (env) и моноклональные антитела мыши к антигену ВИЧ 1(р24), сорбированные раздельно на стрипах полистиролового разборного планшета.
Для приготовления иммуносорбента используют:
1. HIV-1 gp41 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 103.
2. HIV-1 gp120 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 109.
3. HIV-1 р24 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 105.
4. HIV-1 p31 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 108.
5. HIV-2 p36 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 106.
- Конъюгат 1, лиофилизированный или жидкий, - моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ1, конъюгированные с биотином.
1. Конъюгат 2, лиофилизированный или жидкий, - смесь рекомбинантных антигенов, аналогичных структурным белкам ВИЧ-1: gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ 1 группы О), gp120 (env), р24 (gag), р31(ро1); ВИЧ-2: gp36 (env), конъюгированных с биотином;
2. Конъюгаты 3, 4 - лиофилизированные или жидкие - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена;
В ходе предварительных исследований был выбран дизайн тест-системы, отработана технология приготовления ее компонентов, оптимизированы условия проведения иммуноферментной реакции.
При постановке ИФА в тест-системе "ДС - ИФА - АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+Аг р24 ВИЧ 1" в лунки планшета с сорбированными антителами к р24 вносят по 25 мкл конъюгата-1, а в лунки с сорбированными антигенами - по 25 мкл конъюгата-2. Схема постановки реакции приведена ниже. Далее в каждую лунку вносят по 25 мкл исследуемого образца. При этом в лунках с антигенами цвет меняется с оранжевого на розовый, а в лунке с антителами - с зеленого на серый. Смесь инкубируется 45 мин при 37°С на шейкере (или 1 час при 37°С в термостате). Затем без отмывки в лунки планшета для определения антигена р24 вносят по 50 мкл конъюгата-3, а в лунки для определения антител по 50 мкл конъюгата-4. После инкубации в течение 20 мин при 37°С на шейкере (или 30 мин при 37°С в термостате) планшет промывают и проявляют субстратной смесью. Общее время реакции 1 ч 25 мин (или 1 ч 50 мин). Присутствующий в исследуемом образце антиген р24 связывается с моноклональными антителами к р24, а специфические антитела образуют комплекс с рекомбинантными антигенами на планшете. Образовавшийся иммунный комплекс анти-р24 с р24 выявляют конъюгатами анти-р24-биотин, затем стрептавидин-пероксидазой, а иммунные комплексы Аг-ВИЧ с Ат-ВИЧ - конъюгатом Аг-биотин, затем стрептавидин-пероксидазой.
Схема постановки реакции.
Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн: 450 /620-680 нм с настройкой прибора "по воздуху". Допустим учет результатов при одной длине волны 450 нм.
Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) в лунках с К- не более 0,2, в лунках с К+ - не ниже 1,0. ОП крит. рассчитывают по формуле:
ОП крит. gp41 = ср. знач. ОП К-(gp41)+0,15
ОП крит. gp120 = ср. знач. ОП К-(gp120)+0,15
ОП крит. р24 = ср. знач. ОП К-(р24)+0,15
ОП крит. р31 = ср. знач. ОП К-(р31)+0,15
ОП крит. gp36 = ср. знач. ОП К-(gp36)+0,15
ОП крит. Ag р24 = ср. знач. ОП к- (Ag p24)+0,04
где 0,15 и 0,04 - коэффициенты, установленные методом статистической обработки на предприятии-изготовителе. В процессе разработки тест-системы были использованы:
1. Образцы сывороток крови здоровых доноров (n=610).
2. Образцы сывороток крови больных с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с ВИЧ (ОРЗ, пневмонии, ангины, герпетическая и цитомегаловирусная инфекции, сифилис, хламидиоз, вирусные гепатиты А, В и С (n=224)).
3. Образцы сывороток крови больных с различными неинфекционными заболеваниями - травмы, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкология (n=35).
4. Образцы сывороток крови беременных женщин (n=40).
5. Образцы сывороток крови, серопозитивных в ИФА и подтвержденных в иммуноблоте (n=428).
6. Образцы сывороток с положительным результатом, полученным в иммуноферментных тест-системах для одновременного определения антител ВИЧ 1,2 и антигена р24, и неопределенным результатом по иммуноблоту (n=123).
7. Внутренняя панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ 1,2, протестированная на зарегистрированных Минздравом РФ иммуноферментных тест-системах и иммуноблоте (n=21).
8. Стандарт "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Франция, кат. №72217, представляющий собой антиген, полученный из вирусного лизата.
9. Внутренний стандарт предприятия. Образец, содержащий р 24 антиген в концентрации 200 пг/мл, полученный из вирусного лизата и оттитрованный по стандарту "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" фирмы "BIO RAD", Франция, кат. №72217.
10. Стандартная панель сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ 1) - ОСО 42-28-212-93-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.
11. Стандартная панель сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека второго типа (ВИЧ 2) - ОСО-42-28-216-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.
12. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа и второго (ВИЧ 1, 2) - ОСО-42-28-214-94-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.
Оценка чувствительности тест-системы при детекции антигена р24 была проведена с использованием Стандарта "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Внутреннего стандарта предприятия. При использовании Внутреннего Стандарта были приготовлены 4 последовательных 2-кратных разведения от 40 пг/мл до 5 пг/мл с нормальной донорской плазмой, не содержащей антител к ВИЧ 1, 2, в качестве дилюента. Наименьшее количество выявляемого антигена было принято за критерий чувствительности. Полученные данные представлены в таблице 1.
| Таблица 1. Оценка чувствительности тест-системы по р24 ВИЧ 1 | |||||
| HIV 1 ANTIGEN Standard, BIO-RAD | Внутренний стандарт предприятия | ||||
| Концентрация пг/мл | ОП | ОП/ОП крит | Концентрация пг/мл | ОП | ОП/ОП крит |
| 40 | 0,45 | 6,1 | 40 | 0,5 | 6,8 |
| 20 | 0,24 | 3,2 | 20 | 0,27 | 3,6 |
| 10 | 0,14 | 1,97 | 10 | 0,15 | 2,2 |
| 5 | 0,09 | 1,2 | 5 | 0,1 | 1,3 |
| Негативный образец | 0,033 | - | - | - | |
| ОП крит | 0,073 |
| Таблица 2. Сравнительная характеристика чувствительности тест-систем по р24 ВИЧ 1 | ||||
| HIV 1 ANTIGEN Standard, BIO-RAD | Внутренний стандарт предприятия (СОП) | |||
| концентрация пг/мл | Genetic Systems | ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР + Аг р24 ВИЧ 1 | Genetic Systems | ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР + Аг р24 ВИЧ1 |
| 20 | 2,5 | 3,2 | 3,0 | 3,6 |
| 10 | 1,4 | 1,9 | 1,6 | 2,2 |
| 5 | 1,0 | 1,2 | 1,2 | 1,3 |
| Cut off | 0,114 | 0,073 |
Для оценки чувствительности тест-системы при детекции специфических антител были использованы стандартные панели образцов, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита (ВИЧ 1, 2) человека (ОСО 42-28-212-93-02П с.012, ОСО 42-28-216-02П (ВИЧ 2) с.003).
Полученные данные представлены в таблицах 3, 4.
Было проведено сравнение диагностической эффективности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" с тест-системами "Дженскрин-ВИЧ-Аг/Ат" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1/2" (Диапроф-Мед), "Вироностика ВИЧ Уни-форм II Аг/Ат" (Biomerioux), "Рекомбинант-ВИЧ1,2 ДСМ" (МБС), "Амеркард Анти-ВИЧ-1,2 К" (Амеркард), "ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна" (Авиценна). Для этого образцы сывороток из внутренней панели были протестированы во всех указанных тестах. Представленные в таблице 5 результаты указывают на высокую диагностическую эффективность "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1".
Исследования чувствительности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" проводились также с сыворотками крови пациентов, подтвержденных в иммуноблоте как ВИЧ позитивные. Всего протестировано 428 образцов таких сывороток. Получено несколько вариантов выявления антител к разным белкам ВИЧ и антигена р24. Результаты представлены в таблице 6.
| Таблица 6. Результаты выявления антител к разным белкам ВИЧ 1 и антигена р24 при тестировании ВИЧ 1 позитивных сывороток (n=428) | |||||
| % выявления | Белковый профиль | ||||
| анти-gр41 | анти-gр120 | анти-р24 | анти-р31 | р24 | |
| 51,1% | + | + | + | + | - |
| 35,3% | + | - | + | + | - |
| 4% | + | - | + | - | - |
| 3,3% | + | - | - | + | - |
| 1,4% | + | - | - | + | + |
| 1,2% | + | + | + | + | + |
| 1,2% | + | + | - | + | + |
| 0,9% | + | - | + | + | + |
| 0,7% | + | - | + | - | + |
| 0,5% | + | - | - | - | + |
| 0,2% | + | + | - | - | + |
| 0,2% | + | + | - | - | - |
| % выявления антител к отдельным белкам или Аг р24 | 100% | 53,9% | 93,2% | 94,4% | 6,1% |
При тестировании ВИЧ 1 позитивных образцов 3% сывороток продемонстрировали положительную реакцию с gp36 (env ВИЧ 2). ОП/ОПкрит. в этих образцах не превышал 2,0. Полученные нами данные по кросс реактивности белков внешней оболочки ВИЧ 1 (gp41) и ВИЧ 2 (gp36) совпадают с литературными данными.
Интерпретация результатов
Анализ тестирования ВИЧ позитивных сывороток и образцов из стандартных и внутренней панелей в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" позволил разработать критерии для интерпретации результатов этого теста. Рекомендуемые критерии приведены в таблице 7.
| Таблица 7. Рекомендуемые критерии для интерпретации результатов "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1 м | ||||||
| анти-gp41 | анти-gp120 | анти-р24 | анти-р31 | р24 | анти-р36 | Результат |
| + | +1 любой | - | положительный по ВИЧ1 | |||
| ±1 любой | + | - | положительный по ВИЧ1 | |||
| - | - | ± | ± | - | + | положительный по ВИЧ 2 |
| другие профили | неопределенный | |||||
| - | - | - | - | - | - | отрицательный |
| Примечание: при результате (р24±1 любой) рекомендуется подтверждение р24 в "ДС-ИФА-ВИЧ-Аг" |
Исходя из этих критериев, все образцы ВИЧ позитивных сывороток (n=428) определены как положительные и в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ1". Из 16 образцов стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ 1, 14 определены как положительные и 2 как неопределенные. Все 8 образцов из стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ 2, определены как положительные. Из 10 образцов внутренней панели, содержащей антитела к ВИЧ 1, 7 определены как положительные и 3 как неопределенные.
Исследования чувствительности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" проводились также с сыворотками крови пациентов, имеющих положительный результат в иммуноферментных тест-системах, одновременно выявляющих антитела и антиген р24, и неопределенный в иммуноблоте. Всего протестировано 123 таких образца. Данные представлены в таблице 8.
При тестировании сывороток с неопределенным результатом по иммуноблоту (n=123) в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" 72 образца (58,5%) продемонстрировали положительный результат. Из них 26 сывороток (21,1%) позитивные только по р24, 20 (16,3%) - только по антителам, 16 (13%) - по р24 с антителами к одному из белков, 10 (8,1%) - по р24 с антителами к двум и более из белков. Таким образом, тестирование только на антитела (без выявления р24) позволило бы определить как положительные 30 образцов (24,4%). Выявление в тесте антигена р24 позволило определить как положительные дополнительно 42 образца (34,1%).
Для оценки специфичности тест-системы была использована стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ 1, 2 (n=20); образцы сывороток крови здоровых доноров (n=610), образцы сывороток крови больных с различными инфекционными заболеваниями (n=224), не связанными с ВИЧ; образцы сывороток крови больных с различными неинфекционными заболеваниями - травмы, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкология (n=35); образцы сывороток крови беременных женщин (n=40). Всего протестировано 929 образцов. Один образец из сывороток крови здоровых доноров показал ложноположительный результат - выявлены антитела к gp41 и р24. 7 образцов сывороток крови здоровых доноров и 2 образца сывороток крови больных с инфекционными заболеваниями, не связанными с ВИЧ, показали ложноположительный результат по р24.
Для оценки специфичности тест-системы была использована стандартная панель негативных образцов (ОСО 42-28-214-94-02п, с.009). Специфичность составила 100%.
Таким образом, проведенные исследования показали, что специфичность тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" составляет 99% при исследовании образцов сывороток крови нормальных доноров и больных с различными инфекционными и соматическими заболеваниями.
Полученные данные показывают высокую диагностическую эффективность разработанной тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1". Тест-система может быть использована для выявления антител к отдельным белкам ВИЧ 1 и 2 типов и антигена р24 ВИЧ1 с целью подтверждения положительного результата скрининга тест-системами, выявляющими антитела, либо тест-системами, одновременно выявляющими антитела и антиген р24 ВИЧ1. Тест-система может быть использована как альтернативный иммуноблоту тест для подтверждения положительных результатов, а также для исследований динамики антител к ВИЧ и антигена р24 на разных стадиях инфекции.
ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТА
1. Подтверждающий иммуноферментный тест планшетного формата
2. Подтверждающий тест, сочетающий определение спектра антител ВИЧ 1, 2 и антигена р24 ВИЧ 1
3. Выявление антител всех классов Ig
4. Чувствительность при детекции р24 не менее 5 пг/мл
5. Позволяет сократить количество неопределенных результатов по сравнению с иммуноблотом
6. Время анализа - 1 ч 25 мин (иммуноблот - от 3 до 20 часов)
7. Визуальная оценка внесения всех компонентов и образцов.
1. Иммуноферментная тест-система для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена р24 к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, характеризующаяся тем, что она включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека, представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа.
2. Иммуноферментная тест-система по п.1, отличающаяся тем, что для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты для иммуноферментного анализа.
