Рекомбинантная плазмидная днк pet23-a(+)prxvihum178, кодирующая n-концевой фрагмент пероксиредоксина vi человека, и штамм e.coli bl21/de3/pet23-a(+)/prxvihum178 - продуцент n-концевого фрагмента пероксиредоксина vi человека

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Сконструирована плазмидная ДНК pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 с молекулярной массой 19691, 61 Da, которая содержит промотор РНК-полимеразы Т7, участок инициации репликации, генетический маркер, детерминирующий устойчивость трансформированных данной плазмидой клеток и ампициллину, и последовательность нуклеотидов, кодирующих N-концевой фрагмент пероксиредоксина VI человека размером 177 аминокислотных остатков. Путем трансформации клеток E.coli плазмидной ДНК pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 получен штамм E.coli BL21/DE3/PeT23-a (+)/PrxVIhumΔ178 - продуцент N-концевого фрагмента пероксиредоксина VI человека. Использование предложенного изобретения позволяет получить фрагмент пероксиредоксина VI человека, обладающий антиоксидантной активностью полноразмерного пероксиредоксина при пониженной молекулярной массе, что обеспечивает лучшую проницаемость в ткани. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и может быть использовано для получения антиоксидантного препарата пероксиредоксина, предназначенного для лечения заболеваний, связанных с окислительным стрессом.

Известно, что при неполном восстановлении молекулярного кислорода в процессе клеточного дыхания образуются активные формы кислорода - супероксидный анион радикал (), перекись водорода (H₂O₂), гидроксильный радикал (НО·), которые являются крайне токсичными для клеток. Аэробные организмы выработали защитные механизмы для обезвреживания этих веществ. Одним из таких защитных механизмов является восстановление активных форм кислорода в результате реакций, катализируемых ферментами - антиоксидантами. Эти белки играют важную роль в поддержании окислительно-восстановительного потенциала клетки. К ним относятся хорошо изученные антиоксиданты, такие как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, а, кроме того, открытые в последнее десятилетие пероксиредоксины [Chae H.Z., Robison К., Poole L.B., Church G., Storz G., and Rhee S.G. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7017-7021].

Пероксиредоксины - новое семейство белков, которое в настоящее время насчитывает более 100 представителей, обнаруженных во всех живых организмах от архебактерий до человека и являющихся тиоловыми пероксидазами [Lee S.P., Hwang Y.S., Kim Y.J., Kwon K.S., Kim H.J., Kim K., Chae H.Z. (2001) J. Biol. Chem., 276, 29826-29832].

У млекопитающих выявлено 6 типов пероксиредоксинов, различающихся по аминокислотной последовательности, механизму действия и локализации в организме и в клетке. Все пероксиредоксины в своей последовательности содержат высоко консервативный участок, являющийся активным центром ферментов, в состав которого входят один или два остатка Cys. В тестах in vitro было показано, что пероксиредоксины предотвращают инактивацию глутаминсинтетазы в присутствии Fe³⁺, О₂ и дитиотреитол (ДТТ) - модельной окислительной системе, генерирующей свободные радикалы [Kim К, Kim I.H., Lee K.Y., Rhee S.G., Stadtman E.R. (1988) J. Biol. Chem., 263, 4704-4711].

К настоящему времени 1-Cys пероксиредоксин (пероксиредоксин VI, PrxVI) идентифицирован во многих органах и тканях млекопитающих. Первые природные индивидуальные белковые препараты PrxVI млекопитающих были выделены из обонятельного эпителия [Peshenko I.V., Novoselov V.I., Evdokimov V.A., Nikolaev Yu.V.. Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. (1996) FEBS Letters, 381, 12-14] и легких крысы [Kim T.S., Sundaresh C.G., Feinstein S.I., Dodia C., Skach W.R., Jain M.R., Nagase Т., Seki N.. Isherawa K., Nomura N., Fisher A.B. (1997) J. Biol. Chem., 272, 2542-2550]. Эти способы включают в себя накопление и гомогенизацию ткани, экстракцию целевого белка, а также тонкое фракционирование препарата с помощью трех последовательных хроматографических стадий. И хотя ткани, непосредственно контактирующие с кислородом воздуха, наиболее обогащены PrxVI [Novoselov S.V., Peshenko I.V., Popov V.I., Novoselov V.I., Bystrova M.F., Evdokimov V.J., Kamzalov S.S., Merkulova M.I., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. (1999) Cell Tissue Res., 298, 471-480], эти трудоемкие и промышленно невоспроизводимые способы имеют лишь теоретическое значение. Основными недостатками получения PrxVI из природных источников являются: необходимость накопления животных тканей, малый конечный выход чистого препарата (0,01 мг на одно животное) и возможность возникновения аллергических реакций при использовании чужеродного белка для лечения человека.

В настоящее время препаративные количества PrxVI млекопитающих получают более предпочтительными генноинженерными методами, позволяющими нарабатывать нужные количества однородного генетического материала (выбранного вектора, соединенного со структурным геном полипептида) и, как следствие, конечного продукта - белка.

Так, в клетках штамма Е. coli BL21 (DE3) был осуществлен биосинтез полноразмерного рекомбинантного PrxVI человека (PrxVIhum) [Chen L.-W., Dodia С., Feinstein S.I., Jain M.K., Fisher A.B. (2000) J. Biol. Chem., 275, 28421-28427]. Для этого был взят фрагмент кДНК PrxVIhum (PrxVIhum) HA0683 (GenBank™ D14662) длиной 1653 п.о., содержащий открытую рамку считывания для PrxVIhum (224 а.о.) размером 672 п.о. Большая часть исходного фрагмента (длиной 1044 п.о.) была встроена в экспрессирующий вектор рЕТ28с по сайту рестрикции HindIII. Полученная конструкция обеспечивала наработку рекомбинантного белка, который, наряду с аминокислотной последовательностью PrxVIhum, содержал 42 дополнительных аминокислотных остатка, включая шесть остатков His на N-конце полипептидной цепи белка. Взяв за основу тот же фрагмент-PrxVIhum и искусственно введя сайты для узнавания рестриктаз NdeI и XhoI, авторы амплифицировали кодирующую область. Полученный фрагмент был клонирован по этим сайтам в экспрессирующий вектор рЕТ21b. В результате рекомбинантный белок, биосинтез которого детерминировала эта плазмида, содержал только два дополнительных аминокислотных остатка, помимо шести остатков His на С-конце полипептидной цепи продукта. После трансформации Е. coli полученными рекомбинантными ДНК и индукции экспрессии генов изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) клетки наращивали в течение 6 ч и разрушали; белковые препараты подвергали последовательной очистке хроматографическими методами. К недостаткам обоих полученных продуктов можно отнести то, что, хотя и введение в состав полипептидной цепи дополнительных остатков His значительно упрощает выделение рекомбинантных белков, такого рода модификации заметно смещают изоэлектрическую точку белковых продуктов по сравнению с природным и, как следствие, меняют их электростатическое микроокружение. Кроме того, введение дополнительных аминокислотных остатков (42-х в первой конструкции и 2-х - во второй) увеличивает молекулярную массу продукта и, как следствие, ухудшает его проникновение в клетку.

Экспрессия рекомбинантного PrxVI была осуществлена также в бакуловирусной системе [Fujii Т., Fujii J., Taniguchi N. (2001) Eur. J. Biochem., 268, 218-224]. Для этого из различных тканей крысы была выделена смесь мРНК, по которой обратной полимеразной реакцией синтезировали комплементарную цепь ДНК. Затем эту кДНК субклонировали в бакуловирусный челночный вектор pVL1392. Полученная конструкция обеспечивала наработку полноразмерного PrxVI крысы при инфекции эукариотических клеток Sf21. С помощью высаживания, фракционированием на ионообменной смоле с последующими стадиями гель-фильтрации функционально активный рекомбинантный белок был выделен из культуральной жидкости этих клеток. К недостаткам этого метода можно отнести длительность получения (5 дней) препарата, необходимость использования дорогостоящих питательных сред, невысокий по сравнению с бактериальными системами выход целевого продукта и возможность возникновения побочных аллергических реакций при использовании в лекарственных композициях крысиного PrxVI.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является полипептид массой 25034 Да, представляющий собой полноразмерный рекомбинантный PrxVIhum и кодирующая его рекомбинантная плазмидная ДНК pET23-a(+)/PrxVIhum [Меркулова М.И., Шуваева Т.М., Радченко В.В., Янин В.А., Бондарь А.А., Софин А.Д., Липкин В.М. (2002) Биохимия, 67, 1496-1501]. Получаемый пероксиредоксин обладает высокой антиоксидантной активностью. Однако высокая молекулярная масса, препятствующая проникновению молекулы антиоксиданта в клетки организма человека, ограничивает его применение.

Задачей предлагаемого изобретения является конструирование плазмиды, детерминирующей синтез укороченного полипептида PrxVIhum, сохраняющего антиоксидантную активность полноразмерного PrxVIhum, a также создание высокопродуктивного штамма-продуцента для получения полипептида пероксиредоксина человека VI, являющегося N-концевым фрагментом PrxVIhum.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178, кодирующей N-концевой фрагмент пероксиредоксина VI человека с молекулярной массой 19691,61 Да, содержащей ЕсоRI-NdeI-фрагмент плазмиды рЕТ23-а(+), включающий промотор РНК-полимеразы фага Т7, участок инициации репликации (ori) и терминатор транскрипции рибосомального оперона E.coli, Ndel-EcoRl - фрагмент гена PrxVIhum длиной 552 п.о., кодирующий PrxVIhumΔ178, генетический маркер - Ар, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой рЕТ23-a(+)/PrxVIhumΔ178 клеток E.coli к ампициллину, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: NdeI-790, EcoRI-192, PvulI-1531, а также за счет штамма Е. coli BL21/DE3/pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178- продуцента N-концевого фрагмента пероксиредоксина VI человека, обеспечивающего синтез N-концевого фрагмента PrxVIhum размером 177 аминокислотных остатков (PrxVIhumΔ178) с уровнем экспрессии в 30% от суммарного клеточного белка (30 мг/л культуральной жидкости).

Преимуществом заявленного технического решения является возможность получения антиоксиданта - пероксиредоксина VI человека с сохранением антиоксидантной активности полноразмерного пероксиредоксина при пониженной молекулярной массе, что обеспечивает проникновение препарата в клетки организма человека.

Исходной плазмидой для конструирования новой последовательности ДНК, кодирующей полипептид PrxVIhumΔ178, служит плазмида рЕТ23-а(+)/PrxVIhum, детерминирующая экспрессию полноразмерного рекомбинантного PrxVIhum. Эту плазмиду конструируют на основе векторной плазмиды рЕТ23-а(+)[Studier F.W., Moffatt, B.A. (1986) J. Mol. Biol., 189, 113-130]. Фрагмент PrxVIhum, предназначенный для клонирования с сохранением рамки считывания в экспрессирующем векторе, получают методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Taylor G. In: Polymerase Chain Reaction. A Practical Approach, v.1, McPherson M.J., Quirke P., Taylor G. R. eds. Oxford Univ. Press. Oxford. 1994] с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, в последовательности которых введены точечные замены для создания соответствующих участков рестрикции. В качестве прямого праймера используют (подчеркнут сайт узнавания рестриктазы NdeI), в качестве обратного -5'-CCATTAAGGCTGGGGTGTG-3' (подчеркнут участок узнавания рестриктазы EcoRI). В качестве матрицы для проведения ПЦР используют плазмиду, содержащую последовательность PrxVIhum HA0683 (GenBank™ D 14662). Реакционная смесь для проведения ПЦР содержит (в объеме 50 мкл): 1 нг плазмидной ДНК, 20 пмоль каждого праймера, 5 мкл буфера для ПЦР фирмы “Promega”, 200 мкМ каждого dNTP, 5 единиц Taq-полимеразы. Реакцию начинают со стадии предварительной денатурации ДНК - 94°С, 5 мин, затем проводят 30 циклов ПЦР при следующих параметрах температурного цикла: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг с праймерами - 30 с при 60°С, элонгация - 45 с при 72°С с последующей инкубацией при 72°С в течение 5 мин. После обработки продукта реакции соответствующими рестриктазами PrxVIhum клонируют в плазмиду рЕТ23-а(+) по сайтам NdeI-EcoRI.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ23-а(+)/PrxVIhumΔ178 характеризуется следующими признаками:

имеет размер 4210 п.о.

кодирует N-концевой фрагмент PrxVIhum длиной 177 а.о.

состоит из EcoRI-NdeI-фрагмента плазмиды рЕТ23-а(+), включающего промотор РНК-полимеразы фага Т7, участок инициации репликации (ori) и терминатор транскрипции рибосомального оперона E.coli, Ndel-EcoRI-фрагмента длиной 552 п.о. с последовательностью, кодирующей PrxVIhumΔ178.

содержит генетический маркер - Ар, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 клеток E.coli к ампициллину, а также уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: NdeI-790, EcoRI-192, PvuII-1531.

Преимущества предложенной конструкции достигаются за счет того, что входящий в ее состав фрагмент PrxVIhumΔ178 кодирует укороченный по сравнению с PrxVIhum полипептид, сохраняющий антиоксидантную активность природного белка. Это, во-первых, упрощает хроматографическую очистку PrxVIhumΔ178; во-вторых, делает более технологичным его использование в составе лечебных композиций за счет лучшей проницаемости в ткани и увеличения времени циркуляции с биологическими жидкостями по сравнению с полноразмерным белком; в-третьих, увеличивает долю целевого продукта в общей биомассе штамма-продуцента, что в свою очередь ведет к снижению себестоимости конечного продукта.

Для получения штамма-продуцента полипептида PrxVIhumΔ178 компетентные клетки Е. coli BL21/DE3 трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178.

Полученный штамм Е. coli BL2\/DE3/pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3,5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физико-биохимические признаки: клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли азота, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность NdeI-ЕсоRI-фрагмента плазмиды pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 и кодируемая им аминокислотная последовательность полипептида PrxVIhumΔ178; на фиг.2 - физическая карта полученной плазмиды; на фиг.3 - результаты сравнительного исследования протекторных свойств рекомбинантного полноразмерного PrxVI человека и его N-концевого фрагмента (PrxVIhumΔ178) по защите глутаминсинтетазы E.coli от инактивации в модельной окислительной системе in vitro.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ23-a(+)/PrxVIhumΔ178, кодирующей N-концевой фрагмент Рrх VI человека. Используют фрагмент кДНК Рrх VI человека, который ранее был клонирован с сохранением рамки считывания в экспрессирующем векторе [Меркулова М.И., Шуваева Т.М., Радченко В.В., Янин В.А., Бондарь А.А., Софин А.Д., Липкин В.М.(2002) Биохимия, 67, 1496-1501]. Этот вектор, pET23-a(+)/PrxVJhum, используют в качестве матрицы для ПЦР. Полученный таким образом фрагмент ДНК кодирует N-концевой фрагмент Ргх VI длиной 177 аминокислотных остатков. В качестве прямого праймера на этой стадии используют 5'-GCG ААА ТТА АТА CGA CTC ACT ATA GGG -3' (комплементарный промоторной области вектора pET23-a(+)/PrxVIhum). В качестве обратного для PrxVIΔ178 - 5'-ССА ТСС ТТС ААС ТТА GGT GGC-3' (подчеркнут сайт рестриктазы EcoRI, выделен стоп-кодон). Реакционная смесь содержит (в объеме 50 мкл): ~1 нг плазмидной ДНК, 20 пмоль каждого праймера, 5 мкл буфера для ПЦР (“Promega”, США), 200 мкМ каждого dNTP, 5 единиц Taq-полимеразы. Реакцию начинают с предварительной денатурации ДНК при 94°С в течение 3 мин, затем проводят 10 циклов ПЦР при следующих параметрах температурного цикла: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг с праймерами - 30 с при 55°С, элонгация - 45 с при 72°С, затем еще 10 циклов реакции: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг с праймерами - 30 с при 62°С, элонгация - 45 с при 72°С с последующей инкубацией при 72°С в течение 5 мин. После обработки соответствующими рестриктазами фрагмент PrxVIhumΔ178 лигируют с NdeI-EcoRI-фрагментом плазмиды рЕТ23-а(+) с использованием ДНК-лигазы фага Т4. Точность сборки конструкции проверяют рестрикционным анализом и секвенированием полученой вставки по модифицированному методу Сенгера [Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК, М., “Наука”, 1999]. На фиг.2 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178.

Пример 2. Экспрессия PrxVIhumΔ178-фрагмента кДНК РгхVI человека. Для экспрессии фрагмента PrxVIhum в качестве штамма-хозяина выбирают штамм E.coli BL-21(DE-3), несущий в хромосоме ген РНК-полимеразы фага Т7 под контролем индуцибельного lac-промотора [Studier F.W., Moffatt B.A. (1986) J. Mol. Biol., 189, 113-130]. Трансформацию компетентных клеток E.coli BL-21(DE-3) осуществляют химическим методом с использованием хлорида кальция [Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.-Y.]. Для наработки рекомбинантного белка клетки выращивают при 37°С до достижения в жидкой культуре значения поглощения А₆₀₀0,6. Затем для индукции экспрессии белков добавляют индуктор lac-промотора ИПТГ до конечной концентрации 0,4 мМ и продолжают инкубацию еще 5 ч. После этого суспензию клеток подвергают центрифугированию. Осадок, содержащий клетки штамма-продуцента, разрушают ультразвуком и повторно центрифугируют. Белковую фракцию, содержащую в своем составе целевой продукт, высаживают насыщенным раствором (NH₄)₂SO₄ и диализуют против 12 мМ Трис-НСl буфера (рН 7,8), в состав которого входят 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДДТ. Белковую смесь хроматографируют на ДЭАЭ-сефарозе в градиенте хлорида натрия. Фракции, содержащие целевой полипептид, подвергают дальнейшей очистке с помощью гель-фильтрации на сефакриле S-200 и анализируют с помощью полиакриламидного гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия.

Пример 3. Сравнение протекторных свойств рекомбинантного полноразмерного PrxVIhum и его N-концевого фрагмента PrxVIhumΔ178 по защите глутаминсинтетазы Е. coli от инактивации в модельной окислительной системе in vitro.

Глутаминсинтетазу выделяют из клеток E.coli штамма DH5α [Streicher S.L., Tyier В. (1980) J. Bacteriol., 142, 69-78] и инактивируют в присутствии Fe³⁺, О₂ и ДТТ - в модельной окислительной системе, генерирующей свободные радикалы [Kim К., Kim I.H., Lee K.Y., Rhee S.G., Stadtman E.R. (1988) J. Biol. Chem., 263, 4704-4711]. Реакцию инактивации глутаминсинтетазы проводят в объеме 60 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкг фермента, 50 мМ Hepes (рН 7,4), 3 мМ ДТТ и 3 мкМ FеСl₃, в присутствии разных концентраций пероксиредоксина в течение 10 мин при 37°С. Затем определяют оставшуюся активность глутаминсинтетазы E.coli. Протекторные свойства пероксиредоксина по защите глутаминсинтетазы E.coli от инактивации определяют как отношение оставшейся активности фермента после инактивации в присутствии разных концентраций пероксиредоксина к активности неинактивированной глутаминсинтетазы. Результаты теста представлены на фиг.3.

Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента PrxVIhumΔ178.

С целью улучшения аэрации в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят индивидуальную колонию клеток E.coli BL21/DE3, содержащую сконструированную плазмиду pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178.

Выращивают при 37°С на качалке при 180 об/мин в течение 2,5 ч до достижения в жидкой культуре значения поглощения A₆₀₀ 0,6. Затем добавляют ИПТГ до концентрации 0,4 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 ч. Отбирают пробу 1 мл и центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-НСl (рН 6,8), 20% глицерина, 3% додецилсульфата натрия и 0,01% бромфенолового синего. Клеточную суспензию прогревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отбирают образцы 2,5 мкл, 5 мкл, 7,5 мкл, 10 мкл и 15 мкл и анализируют электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия [Laemmli U.K. (1970) Nature, 227, 680-687]. Гель окрашивают Кумасси R-250 и сканируют на лазерном денситометре Ultrascan XL. По данным сканирования полипептид PrxVIhumΔ178 составлял 30% суммарного клеточного белка, что соответствует выходу конечного чистого белкового продукта 30 мг/л культуры клеток.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178, кодирующая N-концевой фрагмент пероксиредоксина VI человека, с молекулярной массой 19691,61 Да, содержащая EcoRI - NdeI-фрагмент плазмиды рЕТ23-а(+), включающий промотор РНК-полимеразы фага Т7, участок инициации репликации (ori), генетический маркер (Ар), детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой рЕТ23-a(+)/PrxVIhumΔ178 клеток E.coli к ампициллину, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: NdeI-790, EcoRI-192, PvuII-1531, и NdeI - EcoRI-фрагмент гена PrxVIhum длиной 552 п.о., кодирующий PrxVIhumΔ178.

2. Штамм E.coli BL21/DE3/pET23-a(+)/PrxVIhumΔ178 - продуцент N-концевого фрагмента пероксиредоксина VI человека.