Способ выявления анализируемой последовательности днк

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в медицине и в фармацевтической промышленности. Способ выявления анализируемой последовательности ДНК предусматривает ее гибридизацию с зондами и визуализацию полученного продукта, где зонды представляют собой олигонуклеотиды с нуклеотидной последовательностью длиной 12-30 нуклеотидов, комплементарной участку того же размера в последовательности искомой ДНК, которые модифицированы вставками на основе алкилдиолов или этиленгликолей. Использование предложенного способа позволяет получать более достоверные и селективные результаты при выявлении анализируемых последовательностей ДНК. 10 з.п. ф-лы, 12 ил.

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для ДНК-диагностики, в том числе диагностики генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре ДНК, включая труднодиагностируемые точечные мутации, а также для выявления вирусных нуклеиновых кислот при диагностике вирусных заболеваний.

Выявление анализируемой ДНК, в том числе детекция точечных мутаций, в настоящее время проводится с применением различных методов. Один из основных - определение нуклеотидной последовательности соответствующей ДНК с помощью секвенирования [Sanger F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, P.5463]. Недостатком этого метода является его дороговизна и высокие требования к техническому оснащению лаборатории. Для анализа нуклеотидных последовательностей, кроме того, используются методы рестрикционного анализа [Daiger S.P., et al., Am. J. Hum. Genet., 1989, V.45, Р.310]. Однако этот метод не универсален и не лишен ряда недостатков. Рестрикционный подход, хорошо зарекомендовавший себя в практической диагностике, ограничен теми мутациями, которые затрагивают только сайты рестрикции.

В последние годы все большее развитие получают методы, основанные на микрочиповой технологии - выявлении и анализе последовательности ДНК методом молекулярной гибридизации с набором олигонуклеотидов одинаковой длины, иммобилизованных на твердофазном носителе.

Наиболее близким к предлагаемому способу - прототипом, является способ выявления анализируемых последовательностей нуклеиновых кислот, в том числе содержащих точечные мутации, методом параллельного гибридизационного анализа [Marcotte E.R., Trends Pharmacol. Sci., 2001, V.22, P.427]. Для выявления нуклеиновых кислот (ОТ-ПЦР или ГЩР-фрагментов) используют нативные олигонуклеотидные зонды, иммобилизованные на подложку. О наличии искомых последовательностей нуклеиновых кислот судят по факту образования гибридизационных комплексов ДНК и олигонуклеотидных зондов, которые детектируются с помощью репортерных группировок, вводимых либо в анализируемую ДНК, либо в дополнительные олигонуклеотидные зонды.

Недостатком прототипа является недостаточная достоверность параллельного выявления ряда последовательностей анализируемых ДНК при использовании набора нативных олигонуклеотидных зондов, возникающая из-за разной селективности комплексообразования отдельных представителей таких зондов, обусловленная разной стабильностью олигонуклеотидных комплексов одинаковой длины.

Стабильность олигонуклеотидных комплексов зависит от трех структурных факторов: она возрастает с увеличением числа формируемых в дуплексе пар оснований и зависит от их типа и относительного расположения (последовательности) в комплексе. В результате комплексообразующая способность даже олигонуклеотидов одинаковой длины значительно различается, и АТ-богатые комплексы могут оказаться существенно менее прочными, чем такой же длины GC-богатые комплексы, даже содержащие один мисматч, что приводит к появлению ложных сигналов при параллельном анализе ДНК-последовательностей с помощью набора иммобилизованных на поверхности олигонуклеотидных зондов. Максимальная дискриминация несовершенных комплексов олигонуклеотидов с НК-мишенью, т.е. различие в эффективности образования совершенных комплексов и «неправильных» комплексов, достигается при температуре плавления их правильных комплексов [Hearst E.J., Photobiochem. Photobiophys. SuppL, 1987, Р.23], поэтому селективное комплексообразование нативных олигонуклеотидов одинаковой длины может быть реализовано только в определенных для каждого олигонуклеотида условиях (например, концентрация, температура). «Неоднородность» комплексообразующей способности олигонуклеотидов одной и той же длины и, следовательно, их различная дискриминирующая способность существенно осложняет анализ структуры ДНК (идентификация, секвенирование, выявление точечных мутаций) гибридизационными методами, особенно при использовании метода обратной гибридизации анализируемого фрагмента ДНК с иммобилизованными на твердой подложке олигонуклеотидами одинаковой длины (микрочипах) [Nguyen H. - K., et al. Nucleic Acids Res. 1998, V.26, Р.4249; Лившиц М.А. и др. Молекулярн. Биол. 1992, Т.26, С.1298; Иванов И.Б. и др., Молекулярн. биология. 1997, Т.31, С.139-167; Ginot F. Humn.Mutation. 1997, V.10, Р.1-10; Drobyshev A., et al. Gene. 1997, V.188, P.45-52; Timofeev E., et al., Nucleic Acids Res. 2001, V.29, P.2626].

Технической задачей изобретения является повышение достоверности и селективности выявления анализируемых последовательностей ДНК.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в качестве олигонуклеотидных зондов используют олигонуклеотиды, содержащие ненуклеотидные вставки и формирующие непрерывные гибридизационные комплексы с близкой стабильностью независимо от их нуклеотидного состава.

Суть предлагаемого способа состоит в том, что в качестве олигонуклеотидных зондов используют модифицированные олигонуклеотиды длиной 12-30 звеньев, имеющие непрерывный сайт связывания с искомой ДНК последовательностью и содержащие одну-пять ненуклеотидных вставок на основе алкилдиолов или этиленгликолей, расположенных друг за другом через 2-10 нуклеотидов в последовательности модифицированного олигонуклеотида по всей его длине. Синтез таких модифицированных олигонуклеотидов проводят в стандартных условиях фосфитамидного метода с использованием легко получаемого синтона аналогично работе [Durand M., et al. Nucleic Acids Res. 1990, V.18, Р.6353]. Такие олигонуклеотидные зонды формируют гибридизационные комплексы с непрерывной последовательностью ДНК с близкой температурой плавления, что приводит в условиях параллельного гибридизационного анализа ДНК к появлению сигналов гибридизации равной интенсивности. Гибридизацию проводят при температуре, близкой к температуре плавления комплексов - 20-60°С в течение 30-60 минут. Анализируемая последовательность ДНК может содержать точечные мутации. Определяемая мутация должна находиться в сайге связывания модифицированного олигонуклеотидного зонда с анализируемой последовательностью ДНК. Визуализация продукта гибридизации происходит при детекции репортерной группы, которая может быть введена не только в анализируемую ДНК, но и в гибридизационный комплекс с использованием дополнительного зонда, несущего метку или с помощью ферментативных превращений в присутствии ДНК-лигазы или ДНК-полимеразы.

Предлагаемый способ выявления ДНК с помощью модифицированных зондов может быть осуществлен в различных форматах - как в условиях гомофазной, так и в условиях гетерофазной гибридизации.

1. Гомофазную гибридизацию проводят в растворе с модифицированным олигонуклеотидным зондом, несущим репортерную группу (радиоактивномеченный концевой фосфат, флуоресцентные группировки, лиганды для специфического связывания с белками, конъюгированными с ферментами). Анализ гибридизационного комплекса осуществляют с помощью электрофореза в нативном геле с последующим проявлением в зависимости от используемой репортерной группировки.

2. При прямой гетерофазной гибридизации анализируемую ДНК иммобилизуют на носитель (нитроцеллюлюзные фильтры, капрон, лавсан, иммунологические планшеты) и инкубируют с олигонуклеотидными модифицированными зондами, несущими репортерную группу (как в п.1). Проявление гибридизационного комплекса проводят после промывки носителя от избытка меченых зондов.

3. При обратной гетерофазной гибридизации, т.е. при использовании модифицированных олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на носитель (мелкодисперсный полимер, капрон, иммунологические планшеты, стекло), возможно несколько вариантов введения метки в гибридизационный комплекс:

а) введение репортерной группировки в анализируемую ДНК в условиях полимеразной цепной реакции (либо меченые праймеры, либо меченые трифосфаты);

б) использование в условиях гибридизации дополнительных олигонуклеотидных зондов в растворе, несущих метку (сэндвич-гибридизация).

4. Ферментативное лигирование на анализируемой ДИК олигонуклеотидного зонда, иммобилизованного на носителе с олигонуклеотидным зондом в растворе, несущим репортерную группу.

5. Ферментативное удлинение зонда с помощью ДНК-полимеразы с использованием трифосфатов, несущих репортерную группу.

Эксперименты проводили на нуклеиновых кислотах, являющихся продуктами амплификации ДНК, которую предварительно денатурировали, нагреванием при 95-100°С в течение 5-10 мин, или добавлением 0.1-0.2 М NaOH. Гибридизацию проводили в интервале температур 20-60°С в течение 30-60 мин в стандарных гибридизационных буферных растворах:

PBS: 0.5 М NaCl, 10 mM EDTA, 10 тМ фосфат натрия рН 7.2

SSPE: 0.18 M NaCl, 10 mM NaHPO₄, 1 mM EDTA, pH 7.0

SSC: 15 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride, pH 7.0

ТЕ: 10 mM tris pH 7.8, 1 mM EDTA, 1 M NaCl

В качестве твердофазных носителей использовали капрон, нитроцеллюлозу, иммунологические планшеты, мелкодисперсный полимер.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

1. В качестве олигонуклеотидных зондов для гибридизации используют модифицированные олигонуклеотиды длиной 12-30 звеньев, содержащие через 2-10 нуклеотидов в впоследовательности модифицированного олигонуклеотида 1-5 ненуклеотидные вставки на основе алкилдиолов или этиленгликолей, что позволяет дополнительно повысить селективность и достоверность способа за счет появления сигналов анализа одинаковой интенсивности.

2. Гомофазную или гетерофазную гибридизацию проводят при температуре 20-60°С в течение 30-60 минут, что обеспечивает максимальное селективное связывание только с полностью комплементарными участками ДНК.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1 (синтез модифицированного зонда)

Синтез модифицированного олигодезоксирибонуклеотида ACGGACCTCC^ACGCCGTACG, где ^ - ненуклеотидная вставка на основе гександиола ОН-(СН₂)₆-OH проводили на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-700 в рамках фосфитамидного метода. В качестве синтонов были использованы коммерчески доступные фосфитамидные дезоксирибонуклеотидные мономеры и полученный аналогично методу [Durand M., et al. Nucleic Acids Res. 1990, V.18, P.6353] мономер на основе гександиола.

Пример 2 (гибридизация в растворе 20-мерных зондов, содержащих гександиольную вставку).

Олигонуклеотидные зонды (20-меры), нативный Р1 и содержащие ненуклеотидные вставки (Р1-1 - Р1-4), меченные ³²Р или флуоресцеином по 5'-концу, в концентрации 10^-5 М инкубировали с ДНК M1 (10^-7 М) в 5 мкл буфера ТЕ в течение 30 мин при 30°С. Реакционную смесь анализировали электрофорезом в нативном 10% полиакриламидном геле. Эффективность образования гибридизационного комплекса как с участием нативного, так и модифицированных зондов составляла ˜ 100%. На Фиг.1 представлена описанная выше схема гомогенной гибридизации анализируемой ДНК-М1 с нативным Р1 и модифицированными 20-мерными олигонуклеотидами Р1-1 - Р1-4, где Х - репортерная группа, ^ - ненуклеотидная вставка гександиол.

Пример 3 (гибридизация в растворе 12-мерных зондов, содержащих пентандиольную вставку).

Эксперимент проводили при температуре 20°С, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидных зондов использовали нативный Р2 и модифицированные 12-мерные олигонуклеотиды Р2-1 - Р2-3. Эффективность гибридизации по данным электрофореза как с участием нативного, так и модифицированных зондов составляла ˜100%. На Фиг.2 представлена описанная выше схема гомогенной гибридизации анализируемой ДНК-М1 с нативным Р2 и модифицированными 12-мерными олигонуклеотидами Р2-1 - Р2-3, где Х - репортерная группа, ^ - ненуклеотидная вставка пентандиол.

Пример 4 (прямая твердофазная гибридизация 30-мерных зондов, содержащих тетраэтиленгликольную вставку).

ДНК М2 (6 мкл ПЦР-смеси) иммобилизовали под действием УФ облучения в течение 15 мин на носителе (нитроцеллюлозной мембране). Модифицированные 20-мерные, меченные биотином или ³²P, зонды (нативный Р3 и модифицированный Р3-1) (10^-7 М), последовательность которых полностью комплементарна участку ДНК М2, инкубировали с иммобилизованной ДНК при температуре 60°С в течение 60 мин в 40 мкл буфера SSCx6. После стандартных отмывочных процедур проводили визуализацию продукта гибридизации. Для изотопномеченных зондов измеряли радиоактивность капрона в точке иммобилизации ДНК М2. В случае биотиновой метки наличие гибридизационного комплекса контролировали после обработки конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза и хромогеных субстратов NBT и BCIP по появлению темно-синего окрашивания. Интенсивность сигнала при прямой гибридизации как с участием нативного, так и модифицированного зондов составляла 90%. На Фиг.3 представлена описанная выше схема прямой твердофазной гибридизации анализируемой ДНК М2 с нативным Р3 и модифицированным 30-мерным олигонуклеотидом Р3-1, где Х - репортерная группа, ^ - ненуклеотидная вставка тетраэтиленгликоль.

Пример 5 (обратная твердофазная гибридизация 15-мерных зондов, содержащих диэтиленгликольную вставку).

Олигонуклеотидные зонды, нативные Р4, Р5, Р6 и Р7 и модифицированные Р5-1,2, Р6-1,2 и Р7-1,2, иммобилизовали на мелкодисперсном полимере. Иммобилизованные зонды инкубировали с ДНК М3 (2 мкл ПЦР-смеси), содержащей на обоих цепях биотиновую метку, в течение 30 мин при температуре 50°С в 20 мкл буфера SSPE. После стандартных отмывочных процедур и обработки конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза проводили визуализацию гибридизационного комплекса, как описано в примере 4, и получали цифровое изображение. Интенсивность сигнала в случае нативных зондов составляла 80-100%, сигналы при использовании модифицированных зондов обладали близкой интенсивностью ˜ 80% (по отношению к черной контрольной метке). На Фиг.4 представлена описанная выше схема обратной твердофазной гибридизации анализируемой ДНК М3 с нативными Р4, Р5, Р6, Р7 и модифицированными 15-мерными олигонуклеотидами Р5-1,2, Р6-1,2 и Р7-1,2, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П -мелкодисперсный полимер.

Пример 6

Иммобилизованные на мелкодисперсном полимере зонды (нативные Р8, Р9 и Р10 и содержащие ненуклеотидные вставки Р8-1,2, Р9-1,2 и Р10-1,2), последовательность которых имела однобуквенное несоответствие с соответствующим сайтом связывания ДНК М3, инкубировали, как описано в примере 5. Интенсивность сигналов гибридизационного комплекса нативных зондов Р8, Р9 и Р10 близка к интенсивности сигналов комплекса ДНК М3 с нативными зондами Р4, Р5, Р6 и Р7 (см. пример 5), модифицированные зонды Р8-1, Р9-1 и Р10-1 дискриминируют последовательность матрицы с одним нуклеотидным несоответствием - сигналы гибридизационных комплексов модифицированных олигонуклеотидов составляют 5-10%. Таким образом было проведено сравнение дискриминации однонуклеотидных несоответствий нативными зондами, обладающими разными гибридизационными свойствами, и модифицированными, имеющими близкие гибридизационные свойства. На Фиг.5 представлена описанная выше схема обратной твердофазной гибридизации анализируемой ДНК М3 с нативными Р8, Р9, Р10 и модифицированными 15-мерными олигонуклеотидами Р8-1, Р9-1 и Р10-1, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П - мелкодисперсный полимер.

Пример 7.

ДНК М4, последовательность которой отличается на один нуклеотид в сайте связывания Р5 от последовательности ДНК М3, инкубировали с иммобилизованными зондами Р5, Р5-1 и Р5-2, как описано в примере 5. Интенсивность сигнала комплекса ДНК М4 и нативного зонда Р5 близка к интенсивности сигнала комплекса ДНК М3 с нативным зондом Р5 (см. пример 5), модифицированные зонды Р5-1 и Р5-2 дискриминируют последовательность ДНК М5 с одним нуклеотидным несоответствием - сигналы гибридизационных комплексов модифицированных олигонуклеотидов составляют 7-10%. На Фиг.6 представлена описанная выше схема обратной твердофазной гибридизации анализируемой ДНК М4 с нативным Р5 и модифицированными 15-мерными олигонуклеотидами Р5-1 и Р5-2, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П - мелкодисперсный полимер.

Пример 8.

ДНК М5, последовательность которой отличается на один нуклеотид в сайте связывания Р6 от последовательности ДНК М3, инкубировали с иммобилизованными зондами Р6, Р6-1 и Р6-2, как описано в примере 5. Интенсивность сигнала комплекса ДНК М6 и нативного зонда Р6 близка к интенсивности сигнала комплекса ДНК М3 с нативным зондом Р6 (см. пример 5), модифицированные зонды Р6-1 и Р6-2 дискриминируют последовательность ДНК М5 с одним нуклеотидным несоответствием - сигналы гибридизационных комплексов модифицированных олигонуклеотидов составляют 7-10%. На Фиг.7 представлена описанная выше схема обратной твердофазной гибридизации анализируемой ДНК М5 с нативным Р6 и модифицированными 15-мерными олигонуклеотидами Р6-1 и Р6-2, где ^ -ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П - мелкодисперсный полимер.

Пример 9 (обратная твердофазная сэндвич гибридизация 15-мерных зондов, содержащих диэтиленгликольную вставку) (фиг.8).

Нативные Р12 и модифицированные Р12-1 зонды, иммобилизованные на мелкодисперсный полимер, комплементарны участку последовательности ДНК М6, дополнительный зонд Р11, содержащий репортерную группу, комплементарен соответствующим участкам ДНК М6-М10. Иммобилизованные зонды Р12 и Р12-1 инкубировали с матрицами М6-М10 (2 мкл ПЦР-смеси) в присутствии дополнительного зонда Р11 (в концентрации 10^-5 М) в течение 30 мин при температуре 50°С в 20 мкл буфера PBS. После стандартных отмывочных процедур и обработки конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза проводили визуализацию наличия гибридизационного комплекса. Сигнал гибридизационного комплекса наблюдался только в случае использования матрицы М6, содержащей последовательность, полностью комплементарную матрице зонду Р12 и Р12-1. На Фиг.8 представлена описанная выше схема обратной твердофазной гибридизации анализируемых ДНК матриц М6-М10 с 16-мерными нативным Р12 и модифицированным олигонуклеотидами Р12-1, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П - мелкодисперсный полимер, Р11 дополнительный сэндвич олигонуклеотид, содержащий биотиновую метку.

Пример 10 (использование 16-мерных модифицированных зондов в присутствии лигазы для дискриминации нуклеотидных несоответствий).

Иммобилизованный на мелкодисперсный полимер модифицированный олигонуклеотидный зонд Р12-1 инкубировали при Т=37°С в течение 30 мин с ДНК М6, М7, М9 (10^-6 М) в присутствии зонда P11 (10^-6 М), несущего биотиновую метку, ДНК-лигазы (50 ед.акт.) и rATP (5*10^-6 М). После стандартных отмывочных процедур и обработки конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза проводили визуализацию продукта гибридизации, как описано в примере 4. Сигнал гибридизационного комплекса наблюдался только в случае использования матрицы М6, содержащей полностью комплементарную зонду Р12-1 последовательность. Интенсивность сигнала гибридизации в случае М7 и М9 составляла 5-7% На Фиг.9 представлена описанная выше схема реакции лигирования на анализируемых ДНК матрицах М6, М7 и М9 содержащего биотиновую метку олигонуклеотида P11 и модифицированного Р12-1 16-мерного олигонуклеотида, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П-мелкодисперсный полимер.

Пример 11 (использование 16-мерных модифицированных зондов в реакции удлинения цепи для дискриминации нуклеотидных несоответствий). Иммобилизованный на мелкодисперсный полимер нативный Р12 и модифицированный олигонуклеотидный зонд Р12-1 инкубировали при Т=60°С в течение 30 мин с ДНК М6, М9 (10^-6 М) в присутствии зонда dUTP (10^-5 М), несущего биотиновую метку, Taq-полимеразы (2 ед.акт.) и dATP (5*10^-5 М). После стандартных отмывочных процедур и обработки конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза проводили визуализацию продукта гибридизации, как описано в примере 4. На Фиг.10 представлена описанная выше схема реакции удлинения цепи на анализируемых ДНК матрицах М6 и М9 нативного Р12 и модифицированного Р12-1 16-мерного олигонуклеотида, где ^ - ненуклеотидная вставка диэтиленгликоль, ˜П - мелкодисперсный полимер. Сигнал гибридизационного комплекса для нативного зонда Р12 наблюдался как для правильной матрицы М6, содержащей полностью комплементарную зонду Р12 последовательность, так и для неправильной матрицы М9. В то время как модифицированный зонд Р12-1 эффективно дискриминировал несоответствия между матрицами М6 и М9.

Пример 12 (использование 12-мерного модифицированного зонда, содержащего декандиольную вставку в реакции лигирования для дискриминации нуклеотидных несоответствий).

Олигонуклеотидный зонд (12-мер), нативный Р2 и содержащий декандиольную ненуклеотидную вставку модифицированный Р2-1, в концентрации 10^-5 М инкубировали при Т=37°С в течение 30 мин с ДНК M11, M12, М13 (10^-5 М) в присутствии дополнительного зонда Р13 (5*10^-5 М), меченного ³²P или флуоресцеином по 5'-концу, ДНК-лигазы (50 ед.акт.) и rАТР (5*10^-6 М). Реакционную смесь анализировали электрофорезом в денатурирующем 20% полиакриламидном геле. В случае нативного олигонуклеотида Р2 эффективность образования продукта как на правильной матрице М11, так и на матрицах М12 и М13, содержащих нуклеотидную ошибку в сайте связывания 12-мерного олигонуклеотида, была близка и составляла ˜ 79%. Модифицированный 12-мерный олигонуклеотид, содержащий декандиольную ненуклеотидную вставку, эффективно дискриминировал (<9%) неправильные матрицы М12 и М13. На Фиг.11 представлена описанная выше схема реакции лигирования на анализируемых ДНК матрицах M11, M12 и М13 содержащего репортерную группу олигонуклеотида Р13 и нативного Р2 или модифицированного Р2-1 12-мерного олигонуклеотида, где ^ - декандиольная ненуклеотидная вставка, X - репортерная группа.

Пример 13 (использование 30-мерного модифицированного зонда, содержащего гексаэтиленгликолевую вставку для дискриминации нуклеотидных несоответствий).

Иммобилизованные на иммунологические планшеты 30-мерные олигонуклеотидные зонды нативный Р3 и модифицированный Р3-1 инкубировали при Т=60°С в течение 30 мин с несущими биотиновую метку матрицами (10^-6 М) ДНК М2, которая полностью комплементарна олигонуклеотиду Р3, и ДНК М14, которая содержит нуклеотидные несоответствия в сайте связывания Р3. После стандартных отмывочных процедур и обработки конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза проводили визуализацию продукта гибридизации раствором паранитрофенилфосфатом до появления желтого окрашивания раствора. Сигнал гибридизационного комплекса для нативного зонда Р3 наблюдался как для правильной матрицы М2, содержащей полностью комплементарную зонду Р14 последовательность, так и для неправильной матрицы М14, в то время как модифицированный зонд Р3-1 эффективно дискриминировал несоответствия между матрицами М2 и М14. На Фиг.12 представлена описанная выше схема реакции на анализируемых ДНК матрицах М2 и М14 нативного Р3 и модифицированного Р3-1 30-мерного олигонуклеотида, где ^ - ненуклеотидная вставка - гексаэтиленгликоль, ˜П - иммунологические планшеты.

Достоверность способа параллельного анализа ДНК определяется эквивалентностью эффективности сигналов гибридизационных комплексов. Как видно из приведенных примеров, модифицированные олигонуклеотидные зонды выявляют анализируемые ДНК с эффективностью, близкой эффективности нативных обычных олигонуклеотидов, но в отличие от последних дают легко интерпретируемые сигналы с близкой интенсивностью. Это обеспечивает более высокую достоверность и надежность выявления заранее заданных последовательностей в нуклеиновых кислотах, в том числе содержащих точечные мутации.

1. Способ выявления анализируемой последовательности ДНК, включающий параллельную гибридизацию анализируемой ДНК с олигонуклеотидными зондами с последующей визуализацией продукта гибридизации, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют как в гомофазной, так и в гетерофазной среде при температуре 20-60°С, а в качестве олигонуклеотидных зондов используют модифицированные олигонуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность длиной 12-30 нуклеотидов, которая полностью комплементарна идентичному по размеру участку последовательности искомой ДНК и содержит 1-5 ненуклеотидных вставок на основе алкилдиолов и этиленгликолей, расположенных друг за другом через 2-10 нуклеотидов в последовательности модифицированного олигонуклеотида.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что модифицированные олигонуклеотиды используют в концентрации 10^-5-10^-7 М.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве алкилдиолов используют пентан-, гексан- или декандиол, а в качестве этиленгликолей используют ди-, тетра- или гексаэтиленгликоль.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомофазную гибридизацию анализируемой ДНК проводят в растворе с модифицированным олигонуклеотидом, несущим репортерную группу.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве репортерной группы используют соединения, выбранные из группы: радиоактивномеченный концевой фосфат, флуоресцентные группировки, лиганды для специфического связывания с белками, конъюгированными с ферментами.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что прямую гетерофазную гибридизацию ДНК, иммобилизованную на твердофазный носитель, проводят с модифицированным олигонуклеотидом, несущим репортерную группу.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве твердофазного носителя используют капрон, нитроцеллюлозу, иммунологические планшеты, мелкодисперсный полимер.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что обратную гетерофазную гибридизацию анализируемой ДНК, несущей репортерную группу, проводят с модифицированными олигонуклеотидами, иммобилизованными на твердофазный носитель.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что обратную гетерофазную гибридизацию анализируемой ДНК проводят с модифицированными олигонуклеотидами, иммобилизованными на твердофазный носитель, в присутствии в растворе дополнительных олигонуклеотидных зондов, несущих репортерную группу.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что обратную гетерофазную гибридизацию анализируемой ДНК проводят с модифицированными олигонуклеотидами, иммобилизованными на твердофазный носитель, в присутствии в растворе ДНК-лигазы и дополнительных олигонуклеотидных зондов, несущих репортерную группу.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что обратную гетерофазную гибридизацию анализируемой ДНК проводят с модифицированными олигонуклеотидами, иммобилизованными на твердофазный носитель, в присутствии ДНК - полимеразы и трифосфатов, несущих репортерную группу.