Набор антигенов для определения антител к вирусу гепатита c "дс-hcv-антигены"

Авторы патента:

Обрядина А.П. (RU)

Бурков А.Н. (RU)

Уланова Т.И. (RU)

Гладышева М.В. (RU)

G01N33/576 - гепатита

Владельцы патента RU 2262704:

Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" (RU)

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для определения антител к вирусу гепатита С. Сущность изобретения состоит в том, что предлагаемый набор включает в себя комбинацию рекомбинантных антигенов, полученных на основе аминокислотных последовательностей наиболее иммунореактивных эпитопов белков вирусов гепатита С разных генотипов, иммобилизованных на поверхности твердофазного носителя. Техническим результатом является разработка нового набора для определения антител к вирусу гепатита С с более высокой чувствительностью и специфичностью. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, генной инженерии и касается препаратов для серодиагностики гепатита С.

Гепатит С является инфекцией, возбудитель которой распространяется среди людей исключительно путем абиогенной "кровяной" трансмиссии. Вирусом гепатита С (HCV) инфицировано около 3% населения Земного шара и фактически речь идет о пандемии. После резкого снижения количества случаев гемотрансфузионного гепатита С (благодаря антивирусному контролю донорской крови) инфицированность поддерживается за счет парентеральных инъекций наркотиков и других процедур, связанных с повреждением кожи и слизистых оболочек. Вирус гепатита С при попадании в организм поражает клетки печени и в 50-80% случаев заражение ведет к персистенции вируса, которая служит главной причиной хронического гепатита и его тяжелейших осложнений - цирроза и первичного рака печени.

Современные методы диагностики позволяют с высокой степенью точности выявлять HCV-инфекцию и следить за ее эволюцией. Это служит основой для превентивных мероприятий и антивирусной терапии. В связи с этим разработка и совершенствование диагностических препаратов, позволяющих не только выявлять инфицированных вирусом гепатита С, но и определять наличие антител к структурным и неструктурным белкам вируса, является крайне актуальной задачей.

Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков.

Вирус гепатита С классифицирован как единственный вид семейства Flaviviridae, куда входят такие (наиболее родственные ему) вирусы, как вирус желтой лихорадки, вирус денге и вирус гепатита G 2. Это мелкий (30-38 нм в диаметре), РНК-содержащий, оболочечный вирус. Геном представлен линейной одноцепочечной плюс-РНК (примерно 9600 нуклеотидов). Она кодирует единственный полипротеин, состоящий из 3011 аминокислотных остатков, который расщепляется клеточными и вирусными протеазами на 3 структурных и 7 неструктурных белков. Структурные белки входят в состав нуклеокапсида (С-белок от англ. Core-сердцевина) и оболочки (Е1 и Е2 от англ. Envelop-оболочка). Неструктурные белки не включаются в вирион. Они участвуют в репликации вируса, выполняя функции различных ферментов (протеазы, РНК-зависимая РНК-полимеразы, геликазы). Для неструктурных белков приняты обозначения NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (NS - от Nonstructural). Для вируса гепатита С характерна высокая частота мутаций, связанных с некорректируемыми ошибками репликации РНК.

На основе гомологии нуклеотидных последовательностей РНК предложено дифференцировать 6 основных генотипов и более сотни субтипов, обозначаемых латинскими буквами в порядке их открытия (1а, 1b, 1с, 2а, 2b, 2с, 3а и т.д.). Определение генотипа имеет большое значение для предсказания эффективности антивирусной терапии, прогноза тяжести и исхода заболевания. Кроме прогностических целей, расшифровка генотипа интересна в плане этиологии инфекции.

Диагностика инфицированности вирусом гепатита С базируется на выявлении специфических серологических маркеров. Наиболее широко практикуется определение анти-HCV при помощи твердофазного иммуноферментного анализа на основе комплекса структурных и неструктурных вирусных белков. Несмотря на общий характер термина, имеются в виду прежде всего иммуноглобулины класса G, поскольку не получено убедительных данных о большей значимости анти-HCV IgM для ранней диагностики, как в случае гепатита А и В. Обнаружение HCV RNA подтверждает факт вирусной инфекции. С другой стороны, количественное определение RNA важно для оценки эффективности противовирусной терапии.

Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических систем являются системы 3-го поколения, в которых в качестве антитело-связывающего субстрата используются рекомбинантные и/или синтетические фрагменты структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (С, NS3, NS4 и NS5). Внедрение диагностикумов 3-го поколения позволило сократить сроки первичного выявления анти-HCV при острой инфекции, существенно повысить специфичность и чувствительность реакции.

Частота выявления анти-HCV среди PHK-HCV позитивных образцов крови приближается к 100%. На фоне хронической инфекции антитела выявляются постоянно, а после элиминации вируса сохраняются (прежде всего анти-Core) в течение 4-8 и более лет. Поэтому формальное наличие анти-HCV не всегда говорит о присутствии вируса в организме и не позволяет судить об активности процесса. Примерно у 5% больных хроническим гепатитом С PHK-HCV может обнаруживаться при отсутствии анти-HCV. Для суждения о вирусной нагрузке, активности HCV-репликации, риске хронизации, разграничении острого и хронического гепатита, длительности инфекционного процесса и степени поражения печени целесообразно использовать определение спектра антител к различным HCV-пептидам, а также наблюдать за их количественной и качественной динамикой.

Детекция антител к каждому из HCV-антигенов имеет самостоятельное диагностическое значение. Так, например, известно, что анти-Core и анти-NS3 выявляются на самых ранних этапах сероконверсии, анти-NS4 и анти-NS5, как правило, появляются позднее.

Было показано, что наличие в сыворотке анти-HCV Core является достаточно надежным маркером вирусной репликации.

Анти-NS3 могут являться самостоятельным диагностическим маркером острой инфекции. Высокие титры анти-NS3 при остром гепатите

С свидетельствуют о значительной вирусной нагрузке, а длительное сохранение их в острой фазе связано с высоким риском хронизации инфекционного процесса.

Выявление анти-NS4 и высокие титры этих антител свидетельствуют о длительности инфекционного процесса, и, по всей видимости, коррелируют со степенью поражения печени.

Выявление анти-NS5 в высоких титрах часто свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а в острой стадии является предиктором хронизации инфекционного процесса.

Несмотря на высокую специфичность, современные ИФА-системы не гарантированы от гипердиагностики, т.е. от ложноположительных результатов. Для их исключения также требуется динамическая оценка на основе индикации анти-HCV к дискретным антигенам.

Наряду с ложноположительными возможны и ложноотрицательные результаты, когда анти-HCV антитела не удается обнаружить, несмотря на присутствие вируса в организме.

В настоящее время в коммерческих тестах для выявления антител к вирусу гепатита С используются в качестве антигенов рекомбинантные белки или синтетические пептиды, созданные на основе аминокислотной последовательности вируса гепатита С 1-го генотипа. Однако такие тесты могут быть недостаточно эффективны для надежной детекции антител при инфицировании вирусом другого генотипа.

Таким образом, для эффективной диагностики гепатита С необходим высокочувствительный тест, способный с одинаковой эффективностью выявлять антитела к ВГС любого генотипа.

Известен диагностический набор "Ortho HCV Version 3.0 ELISA Test System" (США), в котором используются три рекомбинантных антигена-с22-3, с200 и NS5. Другой коммерческий диагностический набор "Abbott HCV EIA 2.0" (США) включает структурные (НС34) и неструктурные (НС-31) белки вируса гепатита С. Эти наборы предназначены для обнаружения антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови.

Известен диагностический набор для диагностики вирусной инфекции гепатита С, полученный иммобилизацией на твердофазном носителе трех или более HCV антигенов, включающих NS3 антиген, NS4 антиген, NS5 антиген (ЕР 806669 А1, 12.11.1997, МПК G 01 N 33/576).

Известен также набор для определения антител к вирусу гепатита С человека, представляющий собой комбинацию, включающую полипептид С 22 домена С вируса гепатита человека, соответствующий аминокислотам 1-222, или фрагмент указанного полипептида, содержащий эпитоп указанного домена, полипептид С 33с домена NS3 ВГС человека, соответствующий аминокислотам 1192-1457, или фрагмент, содержащий эпитоп указанного домена, полипептид С 100 доменов NS3 и NS4, соответствующий аминокислотам 1569-1931, или его фрагмент, причем указанные полипептиды адсорбированы на поверхности твердой фазы (RU 2130969 С1, 27.05.1999, МПК C 12 N 15/00).

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового препарата для определения антител к вирусу гепатита С с более высокой чувствительностью и специфичностью.

Указанная задача решается новым набором рекомбинантных антигенов, полученных на основе аминокислотных последовательностей наиболее иммунореактивных эпитопов белков вирусов гепатита С разных генотипов.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что в состав разработанного препарата входят полученные с помощью методов генной инженерии антигены вируса гепатита С, представляющие собой полипептиды, синтезированные рекомбинантными штаммами-продуцентами и содержащие наиболее иммуноактивные эпитопы структурных или неструктурных антигенов вируса гепатита С разных генотипов.

Рекомбинантные антигены вируса гепатита С (HCV-Ag) могут быть использованы для приготовления иммуноферментных тест-систем или иммуноблотов для выявления антител к вирусу гепатита С в сыворотке (плазме) крови человека с целью специфической диагностики гепатита С, а также для приготовления положительных контролей и стандартов при конструировании тестов для выявления антигенов вируса гепатита С.

В состав набора входят:

1. HCV Core 2-119 аа генотип 1a - 34 кД

2. HCV Core 2-119 аа генотип 3а - 39 кД

3. HCV Core 2-119 аа генотип 3 - 39 кД

4. HCV NS 3 1192-1456 аа генотип 1a - 54,7 кД

5. HCV NS 3 1192-1456 аа генотип 1с - 54,7 кД

6. HCV NS 3 1359-1456 аа генотип 1b - 37,2 кД

7. HCV NS 3 1359-1456 аа генотип 1a - 37,2 кД

8. HCV NS 3 1359-1456 аа генотип 1с - 37,2 кД

9. HCV NS 3 1359-1456 аа генотип 2b - 37,2 кД

10. HCV NS 3 1359-1456 аа генотип 2с - 37,2 кД

11. HCV NS 4 mosaic (генотипы 1, 2, 3, 4, 5) - 66 кД

12. HCV NS 5 2061-2302 аа генотип 1b - 51,8 кД

13. HCV NS 5 2212-2313 аа генотип 1a - 35 кД

14. HCV NS 5 2212-2313 аа генотип 3а - 35 кД

15. HCV NS 5 2212-2313 аа генотип 1b - 35 кД

16. HCV NS 5 2212-2313 аа генотип 2b - 35 кД

Антигены, входящие в набор, иммобилизуют на твердом носителе, либо в смеси, либо по отдельности в зависимости от решаемой задачи. Носителями могут служить полистироловые или полихлорвиниловые планшеты или шарики для иммунологических реакций, нитроцеллюлоза, нейлон, латексы, эритроциты, а также другие твердофазные носители. Твердая фаза может быть в виде планшета, бус, полосок.

Данный набор обладает высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет наиболее эффективно определять спектр противовирусных антител.

Данное техническое решение отличается от известных:

- комбинацией рекомбинантных полипептидов;

- первичной структурой полипептидов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Синтез антигена HCV Core 2-119 аа генотип 1a

Для получения нуклеотидных последовательностей белка HCV core 2-119 рекомбинантные гены, собранные с помощью PCR из синтетических олигонуклеотидов, клонировали в вектор pGEX4T-2 и экспрессировали в клетках Е.coli в виде гибридного белка с глютатион-S-трансферазой. Трансформацию клеток Е.coli штамм f. JМ109 и экспрессию генов проводили согласно методике, описанной ранее [2]. Рекомбинантный белок чистили при помощи аффинной хроматографии на глютатион-сефарозе 4В (Pharmacia) [1].

Для получения микробной массы клеток-продуцентов антигенов HCV реактивировали культуры клеток, хранящихся в замороженном состоянии в среде с глицерином. Для этого клетки рассевали на чашки с агаризованной LB-средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и инкубировали при температуре 37°С 18-20 часов, после чего использовали как посевной материал при наработке биомассы штамма-продуцента.

Штамм бактерий Е.coli выращивали на среде LB с селективными добавками, клетки собирали центрифугированием, разрушали ультразвуком, полученные дезинтеграты центрифугировали. Тельца включения, содержащие рекомбинантные полипептиды, промывали с помощью центрифугирования, солюбилизировали. Полипептиды очищали с помощью аффинной хроматографии на глютатион-сефарозе 4В. Чистоту полученных полипептидов анализировали с помощью SDS-PAGE-электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Пример 2. Синтез HCV Core 2-119 aa генотип 3а