Антитело против митохондриального изофермента аденилаткиназы человека, диагностическая композиция и диагностический набор для диагностики болезней сердца
Изобретение относится к области медицинской иммунологии, в частности к иммунологической композиции и набору для диагностики болезней сердца с использованием митохондриальных изоферментов аденилаткиназы человека. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве маркера используют митохондриальные изоферменты аденилаткиназы человека из мышечных клеток, присутствующие в клетках миокарда. Эти маркеры позволяют более точно и легко диагностировать болезнь сердца. Технический результат - расширение арсенала средств для диагностики болезней сердца. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 20 ил., 5 табл.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к иммунологической композиции и к диагностическому набору для диагностики болезней сердца с использованием митохондриальных изоферментов аденилаткиназы человека, а более конкретно к иммунологической композиции и к диагностическому набору для диагностики болезни сердца, отличающимся тем, что в них в качестве диагностического индикатора болезни сердца, такой как инфаркт миокарда и стенокардия, используется изофермент аденилаткиназы АК3, который обнаруживает специфическую по отношению к сердечной мышце экспрессию и который тем самым позволяет точно, легко и безошибочно диагностировать болезнь сердца благодаря своей превосходной диагностической избирательности.
Предпосылки создания изобретения
Болезни сердца, такие как острый инфаркт миокарда, принадлежат к заболеваниям, которые у половины взрослого населения возникают в возрасте позднее 40 лет, и число пациентов, которые умирают от болезней сердца, постепенно растет во всем мире. В среднем каждый месяц в районных больницах общего профиля проводится 200 или более тестов на болезнь сердца. Каждый год кабинет неотложной помощи в больницах Соединенных Штатов Америки посещают несколько миллионов человек, страдающих болями в области грудной клетки.
До настоящего времени общий метод диагностики болезни сердца у пациентов, страдающих болями в области грудной клетки, предусматривает использование электрокардиограммы (ЭКГ или сонограммы сердца). При диагностике инфаркта миокарда с использованием ЭКГ инфаркт миокарда определяли по изменению аномальных зубцов ST-T и зубцов Q на ЭКГ. Однако 50% пациентам или более с инфарктом миокарда, которые обращались в клинику, ставили неправильный диагноз, при этом приблизительно 5% из указанных пациентов возвращались домой, а 16% из указанных пациентов с неправильным диагнозом умирали.
Для решения этих проблем были разработаны биологические маркеры для диагностики инфаркта миокарда. Идеальные биологические маркеры для диагностики инфаркта миокарда должны предпочтительно удовлетворять следующим требованиям.
Во-первых, они должны присутствовать только в клетках сердечной мышцы и высвобождаться в кровь с некрозом миоцитов.
Во-вторых, они должны быстро высвобождаться в кровь после повреждения сердечной мышцы, а это зависит от клеточного распределения и размера молекулы данного биологического маркера.
В-третьих, зависимость между степенью повреждения сердца и высвобождаемым количеством биологического маркера должна быть линейной.
В-четвертых, данный анализ не должен требовать специальной подготовки и специальных методов, а реагенты, необходимые для данной детекции, должны быть недорогостоящими.
В-пятых, аномальная концентрация биологического маркера в крови должна возрастать после того, как пациент начнет ощущать боль в груди.
В-шестых, высвобождаемые биологические маркеры должны быть быстро выделены для подтверждения наличия инфаркта миокарда. Однако, к сожалению, еще не существует биологических маркеров, удовлетворяющих всем указанным требованиям.
В настоящее время в качестве биологических маркеров для диагностики инфаркта миокарда применяется массовый анализ на креатинкиназу (СК) и тест на тропонин. Поскольку СК имеет тип ММ в мышечной ткани, тип ВВ в головном мозге и в спинном мозге и гибридный тип MB в скелетной мышце или сердечной мышце, то ее концентрации в сыворотке используют в качестве индикатора поражения ткани сердца. В частности, СК-МВ известна как фермент, указывающий на степень поражения при остром инфаркте миокарда, и наблюдается приблизительно 5%-ное изменение уровня его активности в крови при всех мышечных болезнях, таких как ожоги, травмы, болезни сердца и скелетных мышц. Однако диагностика инфаркта миокарда с использованием фермента СК-МВ представляет определенные трудности, заключающиеся в его ограниченной детекции, и дает примерно 20% ложных сигналов, которые снижают точность детекции и не позволяют поставить надежный диагноз. В настоящее время Всемирной организацией здравоохранения были установлены диагностические стандарты для инфаркта миокарда, которые заключаются в следующем: (1) типичные боли в области грудной клетки, (2) аномальный зубец Q на ЭКГ и (3) биологические маркеры должны содержаться в количествах, превышающих пределы стандартных значений. Если по крайней мере два из вышеперечисленных стандартов применимы к данному пациенту, то этому пациенту можно поставить точный диагноз инфаркта миокарда. Биологические маркеры должны рассматриваться как часть этих трех стандартов для диагноза ОИМ.
Альтернативно, Воусе N. и др. разработали тест на тропонин Т сердца (cTnT) для снижения случаев неправильного диагноза при использовании креатинкиназы (СК-МВ) в качестве стандартного маркера повреждения сердца [см. "Clinical Laboratory News, 22 (1), 1-14 (1996)"]. Этот тест был официально признан Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) Соединенных Штатов и является коммерческим продуктом фирмы Boehringer Manheim Diagnostics Co., Ltd., Германия. В Соединенных Штатах этот продукт используется только с ноября 1996, но в настоящее время используется тест на тропонин I, поскольку было установлено, что он перекрестно реагирует с тропонином Т, происходящим от скелетной мышцы. Однако cTnT и cTnI высвобождаются через 12-24 часа после появления боли в груди, и, таким образом, не могут быть использованы в качестве ранних маркеров [см. "Eisenbrey et al. (1995) The Journal of American Medical Association, 74, 1343-1344]". Следовательно, эти тесты не могут рассматриваться как альтернативные тесты, удовлетворяющие данным требованиям. В соответствии с этим они используются лишь как вспомогательное средство для СК-МВ-теста. Указанные диагностические методы имеют ограниченное использование, лишь в нескольких центральных клиниках, поскольку они требуют использования дорогостоящего оборудования для анализов, наличия специалистов по сердечно-сосудистым заболеваниям и высококвалифицированного медицинского персонала, что повышает стоимость проведения диагностики. Кроме того, для пациентов, которым требуется проведение непрерывной детекции, едва ли следует использовать тропонин, поскольку медицинская страховка в отношении тропонина выдается в Корее лишь один раз.
Как было упомянуто выше, стандартный биологический маркер для диагностики болезней сердца не может давать удовлетворительный результат, если принять во внимание точность диагноза и время диагностики после начала ОИМ. А следовательно, для выявления поражения сердечной мышцы необходим новый диагностический индикатор, который позволял бы более точно и быстро установить диагноз, не прибегая при этом к использованию дорогостоящего оборудования для анализов, и который позволял бы проводить анализы для диагностики болезней сердца в небольших клиниках и одним специалистом.
Описание изобретение
Целью настоящего изобретения является получение иммунологической композиции и диагностического набора для диагностики болезни сердца и инфаркта миокарда с использованием митохондриальных изоферментов аденилаткиназы человека, которые обладают превосходной точностью и чувствительностью и которые отличаются тем, что материал-кандидат, используемый в них в качестве диагностического индикатора, удовлетворяет всем требованиям идеальных индикаторов для диагностики инфаркта миокарда, конкретно присутствующих в мышечной ткани сердца, и тем, что в них используются антитела против АК, специфически распознающие митохондриальный изофермент аденилаткиназы человека, обладающий различным субклеточным распределением.
Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуноглобулину, специфичному в отношении митохондриальных изоферментов аденилаткиназы человека (АК) и его частей и отличающемуся тем, что указанный иммуноглобулин продуцируется у видов животных, восприимчивых к данному иммуногену, включая митохондриальный изофермент аденилаткиназы человека (АК) и его часть.
Настоящее изобретение также относится к иммунологической композиции, состоящей из комбинации иммуноглобулина и детектируемого маркера.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для диагностики болезней сердца, содержащему иммуноглобулин согласно изобретению, связывающийся с детектируемым маркером, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения митохондриального изофермента аденилаткиназы человека 3 (АК3) в детектируемом образце, включающему в себя следующие стадии (а), (b) и (с):
(a) продуцирования иммунного комплекса посредством реакции детектируемого образца и контрольного образца с антителом против изофермента аденилаткиназы 3 (АК3) или его части соответственно;
(b) обнаружения иммунного комплекса, полученного на указанной стадии (а),
и (c) сравнения результатов обнаружения детектируемого образца и контрольного образца.
Краткое описание графического материала
Вышеуказанные цели и другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут более очевидными из описания предпочтительного варианта осуществления изобретения со ссылками на сопровождающий его графический материал.
На фиг.1 схематически иллюстрируется субклеточное распределение изоферментов аденилаткиназы в клетках;
на фиг.2 схематически иллюстрируется электрофорез для ПЦР-продукта изофермента аденилаткиназы 3 (АК3);
на фиг.3 представлена генетическая карта PCR.2.1-АК3;
на фиг.4 представлена рестрикционная карта плазмиды, полученная путем гидролиза специфическим рестриктирующим ферментом;
на фиг.5 иллюстрируется характер гидролиза рестриктирующим ферментом;
на фиг.6 представлена генетическая карта pQE 30-АК3;
на фиг.7а проиллюстрирован результат электрофореза в ДСН-ПААГ для АК3;
на фиг.7b проиллюстрирован результат Вестерн-блот-анализа для АК3;
на фиг.8а проиллюстрирован результат электрофореза в ДСН-ПААГ для АК1;
на фиг.8b проиллюстрирован результат Вестерн-блот-анализа для АК1;
на фиг.9а проиллюстрирован результат электрофореза в ДСН-ПААГ для АК2;
на фиг.9b проиллюстрирован результат Вестерн-блот-анализа для АК2;
на фиг.10 представлен график, иллюстрирующий процесс очистки кроличьего антитела против АК3;
на фиг.11 представлен очищенный рекомбинант изоферментов АК;
на фиг.12 проиллюстрирован результат анализа на перекрестную реактивность очищенных антител против изофермента АК;
на фиг.13 проиллюстрировано распределение изоферментов АК в ткани;
на фиг.14 проиллюстрированы результаты Вестерн-блот-анализа, полученные с использованием антитела против АК2 и антитела против АК3 из сыворотки пациентов с инфарктом миокарда в условиях замены или без замены;
на фиг.15 проиллюстрирован мигрирующий характер электрофореза в нативном геле для АК и сыворотки человека;
на фиг.16 результат Вестерн-блот-анализа для регистрации АК3 в сыворотке данного пациента и
на фиг.17 проиллюстрирован результат Вестерн-блот-анализа для АК3 в примере 6.
Наилучший вариант осуществления настоящего изобретения
Ниже подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылками на прилагаемый графический материал.
Используемый здесь термин "биологический образец" означает физиологическую жидкость организма или ее часть, например мочу, кровь, сыворотку и плазму крови, выделенные из организма человека.
Используемый здесь термин "детектируемый маркер" означает маркер для детекции иммунного комплекса, например радиоактивный изотоп-индикатор, частицу золота, фермент, хемилюминесцентное соединение, флуоресцеин, фикобилипротеин, хелат редкоземельного металла, флуоресцентный материал, такой как родамин, кофактор фермента, биотин, стрептавидин и т.п.
Используемый здесь термин "моноклональный" относится к иммуноглобулину, происходящему от одной клонированной гибридомной клеточной системы и системы, способной продуцировать один тип антител, которые продуцируются слитыми клетками, такими как гибридомная клеточная линия.
Используемый здесь термин "поликлональный" относится к системе, позволяющей продуцировать иммуноглобулины, происходящие из множества видов клеток, обладающих общей полиаффинностью по отношению к иммуногену, где термин "иммуноглобулин" в основном означает иммуноглобулин, синтезированный в организме животного, обладающего приобретенным иммунитетом.
Используемый здесь термин "митохондриальный изофермент аденилаткиназы" означает митохондриальный изофермент аденилаткиназы как таковой, такой как митохондриальный изофермент аденилаткиназы 2 (АК2) и митохондриальный изофермент аденилаткиназы 3 (АК3), их рекомбинантные белки и их искусственные и природные мутанты.
Используемый здесь термин "часть митохондриального изофермента аденилаткиназы" означает рестриктированный или усеченный пептидный фрагмент митохондриального фермента аденилаткиназы, включая реагирующую с антителом часть митохондриального изофермента аденилаткиназы.
Аденилаткиназа (АК) представляет собой фермент, поддерживающий быстрое динамическое равновесие между адениновыми нуклеотидами путем катализа обратимой реакции переноса фосфорной кислоты на ХТР, ADP и АМР в клетке, как показано ниже:
ХТР+АМР или XDP+ADP
(где ХТР представляет АТР или GTP).
Указанный фермент представляет собой один из ферментов, необходимых для реакции фосфорилирования, относящейся к метаболической активности клетки и к переносу сигнала. Известно также, что он участвует в метаболизме энергии, апоптозе, онкогенезе и т.п. и, как сообщалось, имеет около 40 видов изоферментов в биологической системе [см. "Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, Т., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. & Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem., 264, 10148-10152"].
Как показано на фиг.1, клетка позвоночных имеет 3 подтипа изофермента, т.е., АК1 (ЕС 2.7.4.3) в цитоплазме, АК2 в межмембранном пространстве митохондрии и АКЗ (ЕС 2.7.4.10) в митохондриальном матриксе [см. "Kuby, S.A., Palmieri, R.H., Frischat, A., Wu, L.H., Maland, L., & Manship, M. (1984) Biochemistry 23, 2392-2399; Sachsenheimer, W. & Schulz, G.E. (1997) J. Mol. Biol. 114, 23-36; Egner, U., Tomasselli, A.G. & Schulz, G.E. (1978) J. Mol. Biol. 195, 649-658"]. Предполагаемый АК3 человека был идентифицирован на основе его сходства с коровьим и мышиным АК3. Однако кДНК АКЗ человека оказалась более близкородственной недавно идентифицированным генам АК4 мыши, а поэтому ген АКЗ человека был переименован в АК4 [Yoneda, Т. Sato, M., Maeda, M., Takagi, H. (1998) Identification of a novel adenylate kinase system in brain; cloning of the fourth adenylate kinase. Mol. Brain. Res., 62, 187-195].
В этом документе авторы настоящего изобретения используют название АК3 вместо АК4, поскольку мышиный АК4 имеет тип изофермента головного мозга, а АК3 не экспрессируется в головном мозге человека. Недавно у человека был идентифицирован изофермент АК5, имеющий тип изофермента головного мозга.
Были клонированы два подтипа человеческих генов АК2 (чАК2), гены АК2А и АК2В. Кроме того, мРНК чАК1 и чАК2 были обнаружены в тканях многих видов, таких как ткани сердечной мышцы, скелетной мышцы, печени и т.п.[см. "Lee, Y., J.W.Kim, I.A.Lee, H.B.Kang, Y.K.Choe, H.G.Lee, J.S.Lim, H.J.Kim, C.K.Park & I.S.Choe, (1996) Biochem. Mol. Biol. International, 39(4), 833-842"]. Эти генные продукты экспрессируются по тканеспецифическому типу. Сообщалось, что АК1 экспрессируется как в сердечной мышце, так и в скелетной мышце, а АК2 не экспрессируется в скелетной мышце [см. "Lee, Y., J.W. Kim, S.M. Lee, H.J.Kim, K.S.Lee, C. Park & I.S.Choe (1998) J.Biochem-Tokyo, 123, 47-54"].
Изофермент аденилаткиназы человека 3 (АК3) представляет собой фермент переноса фосфорной кислоты, состоящий из 223 аминокислот и называемый также "нуклеозидтрифосфат-аденилат-фосфотрансферазой". Последовательность гена АКЗ человека и первичная последовательность аминокислот были подтверждены Xu и др. [см. "Xu, G., O'Connell, P., Stevens, J.& White, R. (1992) Characterization of human adenylate kinase 3 (АК3) cDNA and mapping of the AK3 pseudogene to an intron of the NF1 gene. Genomics 13; 537-542"].
Изофермент аденилаткиназы человека 3 катализирует нижеследующие реакции:
GTP+AMP или GDP+ADP
см. "Chiga, M., Rogers, A.E., Paut, G.W.E. (1961) J.Biol. Chem., 236, 1800; Albrecht, G.J. (1970), Biochemistry (9:2426)"].
По сравнению с другими ферментами исследование фермента АК3 не было таким интенсивным, и поэтому о тканеспецифичности фермента АК3 в организме человека до сих пор не было никаких сообщений.
Было обнаружено, что генетический дефект фермента АК в организме человека вызывает наследственную гемолитическую анемию (см. "Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, Т., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. & Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem., 264, 10148-10152") и что пирофосфат тиамина биологически синтезируется путем кооперации креатинкиназы и АК в мышечной ткани и в ткани головного мозга.
Сначала авторами настоящего изобретения было обнаружено, что АК3 также экспрессируется в сердечной мышце, как и АК2, но не экспрессируется в скелетной мышце, а затем данные факты были ими использованы для диагностики болезни сердца, такой как инфаркт миокарда.
Авторами настоящего изобретения были клонированы гены митохондриальных изоферментов АК2 (чАК2) и АК3 (чАК3) из мышечной ткани человека в целях конструирования экспрессирующих векторов pQE-AK2 и pQE-АК3, а затем были выделены и очищены генетически рекомбинантные АК2 и АК3 в большом количестве путем инкубирования трансформированных колиформных бацилл для получения генетических рекомбинантных экспрессирующих систем E.coli в 1,1 мг бульона АК2/л и 9,8 мг бульона АК3/л.
Рекомбинантный изофермент чАК был подтвержден путем проведения анализа состава аминокислот. Было установлено, что специфическая активность и величина pI чАК составляют 1000 ед/мг и 6,6 соответственно, а удельная активность и величина pI чАК3 составляют 400 мед/мг и >11,7, соответственно. Указанные физико-химические свойства аналогичны физико-химическим свойствам изофермента АК3, выделенного из печени крупного рогатого скота.
Для общего обзора аспектов тканеспецифической экспрессии в целях выявления физиологической функции изофермента АК была получена поликлональная кроличья антисыворотка с использованием чАК1, чАК2 и чАК3, и антитела против чАК1, чАК2 и АК3 были получены путем удаления антител, перекрестно распознающих их изоферменты. В результате проведения иммуногистохимии залитых парафином тканей с использованием указанных антител чАК1 был обнаружен во всех тканях, чАК2 был обнаружен лишь в печени, головном мозге, сердечной мышце, почках и в легких, а чАК3 был обнаружен лишь в печени, сердечной мышце, почках и легких. В частности, было установлено, что АК1 обнаруживался в обеих из указанных двух тканей даже при Вестерн-блот-анализе головного мозга, сердечной мышцы и скелетной мышцы, а АК2 и АК3 не экспрессировались в скелетной мышце и обнаруживали для ткани сердца специфическую экспрессию. Следовательно, различный характер распределения изофермента аденилаткиназы в человеческих органах, а в частности его преимущественное распределение в сердечной мышце и в скелетной мышце, указывает на то, что эффективность его использования в качестве клинического маркера для выявления поражения клеток сердца может быть очень высокой.
Иммуноглобулин согласно изобретению отличается тем, что он продуцируется из системы животного, реагирующей с иммуногенсодержащим митохондриальным изоферметом аденилаткиназы человека (АК) и его частью. Указанные митохондриальные изоферменты аденилаткиназы человека предпочтительно представляют собой митохондриальный изофермент аденилаткиназы человека 2(АК2) и митохондриальный изофермент аденилаткиназы человека 2(АК3). В настоящем изобретении могут быть использованы все иммуноглобулины (моноклональные или поликлональные), которые ограничиваются IgA, IgG, IgM, IgD, IgE или IgY. При этом необязательно использовать целое антитело, а можно использовать фрагмент антитела, включая антигенсвязывающую область, например Fab-, Fab'- или F (ab')2-фрагменты.
Указанные иммуноглобулины, специфичные к изоферменту аденилаткиназы, получают из сыворотки животного, иммунизованного очищенным изоферментом аденилаткиназой, из гибридомной клетки, продуцированной путем слияния лимфоцита селезенки и миеломной клетки или из лимфоцита, трансформированного in vitro. Более конкретно, моноклональное антитело, специфичное к изоферменту аденилаткиназы, может быть продуцировано хорошо известным методом слияния клеток [см., "Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519"]. Указанное моноклональное антитело, находящееся на депозите Корейского научно-исследовательского фонда клеточных линий (KCLRF) Центра Медицинского колледжа Сеульского национального университета (адрес: Youn-geon-dong, Chongro-ku, Seoul, Korea), депонировано 19 мая 2000 г. под № KCLRF-BP-00030. В вышеупомянутом методе одну группу из двух групп клеток, подвергаемых слиянию для продуцирования "гибридомы", которая секретирует антитело, используют в качестве клетки иммунологически подходящего животного-хозяина, такого как мышь, которой был инъецирован изофермент аденилаткиназы, а другую группу клеток, подвергаемых слиянию, используют в качестве раковой или миеломной клеточной линии. Указанные две группы клеток подвергают слиянию хорошо известным методом с использованием полиэтиленгликоля и т.п. А затем антителопродуцирующие клетки подвергают пролиферации путем стандартного инкубирования ткани. Группу гомогенных клеток получают путем субклонирования методом ограниченного разведения, а затем гибридому, которая может продуцировать иммуноглобулин, специфичный в отношении изофермента аденилаткиназы, инкубируют в большом количестве in vivo или in vitro стандартным методом.
Моноклональное антитело, полученное вышеуказанным методом, может быть использовано без очистки, но предпочтительно его использовать после очистки до высокой степени чистоты, проводимой стандартным методом. Таким методом очистки является, например, преципитация соли, ионообменная хроматография и аффинная хроматография.
Поликлональное антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть продуцировано стандартным методом, где очищенный изофермент аденилаткиназы 2 или изофермент аденилаткиназы 3 инъецируют животному, а затем получают сыворотку, содержащую антитело, полученное у этого животного. Указанное поликлональное антитело может быть очищено любым из известных стандартных методов и может быть продуцировано у животного-хозяина, такого как коза, кролик, овца, обезьяна, лошадь, свинья, корова, собака и т.п.
В соответствии с настоящим изобретением ферменты аденилаткиназы могут быть использованы после их выделения стандартным методом или путем биосинтеза многих видов их фрагментов стандартным методом генной инженерии. Альтернативно, пептиды изофермента аденилаткиназы 3 могут быть химически синтезированы методом органического синтеза белков.
В другом предпочтительном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к получению иммунологической композиции, связывающей иммуноглобулин настоящего изобретения с детектируемым маркером. Для указанной иммунологической композиции детектируемый маркер может быть выбран из группы, состоящей из радиоактивного индикатора, частиц золота, фермента, хемилюминесцентного соединения, флуоресцентного материала, кофактора фермента, стрептавидина, биотина и т.п.
В соответствии с настоящим изобретением антитело, специфичное в отношении изофермента аденилаткиназы, используют для обнаружения изофермента аденилаткиназы в биологическом образце, включая кровь или другую физиологическую жидкость. В частности, присутствие изофермента аденилаткиназы (АК) в биологическом образце может быть подтверждено путем обнаружения указанного связанного иммуноглобулина в результате контактирования иммунологической композиции согласно изобретению с данным биологическим образцом. Метод детекции, используемый в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений, например, могут быть использованы два метода, один из которых представляет собой твердофазный иммуноферментный "сэндвич"-анализ (ELISA), где антитело связывают с микротитрационным планшетом или 96-луночным планшетом для проведения реакции пробы сыворотки, а "второе" антитело связывают с указанным антителом для проявления его ферментативной окраски, а другой метод представляет собой анализ, где указанный белок, выделенный путем электрофореза на полиакриламидном геле, подвергают блоттингу на нитроцеллюлозной или PVDF-мембране для реакции антитела.
В соответствии с настоящим изобретением набор для диагностики болезней сердца включает в себя иммуноглобулин согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Поскольку для изготовления диагностического набора необходимо заменить лишь белковый компонент, то указанный набор согласно изобретению может быть получен в виде пластыря или ленты. Так, например, диагностический набор для диагностики болезней сердца согласно изобретению может включать в себя антитело, специфичное к изоферменту аденилаткиназы, и изофермент аденилаткиназы, содержащийся в каждом тестируемом образце соотвественно. Изофермент аденилаткиназы и антитело, специфичное к изоферменту аденилаткиназы, могут быть фиксированы на твердой фазе указанных мембран и могут быть помечены. При использовании ферментной метки набор согласно изобретению может включать в себя субстрат фермента. В случае проведения анализа с использованием "второго" антитела для мечения иммунного комплекса набор согласно изобретению может включать в себя антитело против изофермента аденилаткиназы или "второе" антитело, специфичное к изоферменту аденилаткиназы. Набор согласно изобретению может, кроме того, включать в себя подходящий стандартный позитивный или негативный контроль и дополнительные инструкции по применению.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения изофермента аденилаткиназы (АК) в испытуемом образце, включающему в себя следующие стадии:
(a) продуцирование иммунного комплекса путем реакции детектируемого образца и контрольного образца с антителом против изофермента аденилаткиназы (АК) или его части соответственно;
(b) обнаружение иммунного комплекса, полученного на указанной стадии (а), и
(c) сравнение результатов обнаружения детектируемого образца с результатом обнаружения контрольного образца.
В этом способе указанная стадия может быть осуществлена методом с использованием иммунофлуоресцентного антитела, методом развития окраски, вызываемой ферментным субстратом, методом, предусматривающим связывание с хемилюминесцентным соединением, или методом с использованием комплексов, образованных золотыми частицами. Для указанного контрольного образца может быть использована сыворотка, детектируемая как положительная методом с использованием иммунофлуоресцентного антитела, методом развития окраски, вызываемой ферментным субстратом, методом, предусматривающим связывание с хемилюминесцентным соединением, или методом с использованием комплексов, образованных золотыми частицами. Однако метод обнаружения, используемый в настоящем изобретении, не ограничивается указанными методами, и в этих целях может использован любой из стандартных методов детекции.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны более подробно в нижеследующих примерах, не ограничивающих объем настоящего изобретения.
Пример 1. Клонирование гена АК3
Экстракция полной РНК из скелетной мышцы человека.
Для выделения РНК 1 мл РНКзола (4 М тиоцианат гуанидина, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил, 0,1 М 2-меркаптоэтанол) добавляли к 100 мг мышечной ткани, а затем гомогенизировали, после чего добавляли 100 мкл хлороформа, встряхивали в течение 15 секунд и оставляли на 15 минут на льду. Раствор клеточного лизата центрифугировали при 12000×g в течение 15 минут для удаления нерастворенного клеточного дебриса. Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли в нее равное количество изопропанола и содержимое смешивали, в результате чего получали смесь, которую инкубировали при температуре 70°С в течение 15 минут. Затем эту смесь центрифугировали при температуре 4°С, при 12000×g в течение 15 минут для преципитации РНК. РНК-осадок промывали 75% этанолом и сушили, затем добавляли 100 мкл DEPC-очищенной воды для экстракции полной РНК.
Получение кДНК АК3 с помощью ОТ-ПЦР
Выделенные, как описано выше, 10,5 мкл полноразмерной РНК смешивали с 1 мкл 500 нг/мкл олиго dT, 1,5 мкл 2,5 мМ dNTP, 1 мкл 100 мМ DTT, 1 мкл 200 ед/мкл обратной транскриптазы MMLV, 6 мкл 5× буфера для обратной транскриптазы и 9 мкл DEPC-очищенной воды с получением 30 мкл полного объема и подвергали реакции при температуре 42°С в течение 30 минут, а затем инкубировали при температуре 75°С в течение 30 минут. Для получения композиции из ПЦР-реакционной смеси синтезированную, как описано выше, кДНК использовали в качестве матричной кДНК. Затем добавляли 8 мкл 2,5 мМ dNTP, 1 мкл 5 единиц/мкл ДНК-полимеразы Ex taq, 10 мкл 10× буфера для ДНК-полимеразы, 1 мкл смыслового праймера и 1 мкл антисмыслового праймера (100 пмоль/мкл), после чего добавляли дистиллированную воду с получением 100 мкл полного объема. Смесь денатурировали при температуре 98°С в течение 10 секунд, отжигали при температуре 55°С в течение 30 секунд, удлиняли при температуре 72°С в течение 40 секунд и указанную полимеразную цепную реакцию повторяли в 35 циклах. В этой процедуре использовали два праймера, то есть (5'-GGATCCATGGCTTCCAAACTCCTGC-3' (смысловой) 5'-CAGGGTCAATATGCTTCTTTGG-3' (антисмысловой), и ПЦР-продукт детектировали в 1% агарозном геле (см. фиг.2).
[Конструирование АК3-субклонирующего вектора (pCR2.1-АК3)]
АК3-ПЦР-продукт, имеющий 680 п.н., очищали из агарозного геля с использованием набора для гель-экстракции и клонировали с использованием набора для ПЦР-клонирования pCR2.1 (Invitrogen) (см. фиг.3). Для лигирования смеси 1 мкл 50 нг линеаризованного вектора pCR2.1, 5 мкл ПЦР-продукта, 1 мкл 4 единиц/мкл ДНК-лигазы Т4, 1 мкл 10 × лигазного буфера и 2 мкл dH2O смешивали до полного объема 10 мкл, а затем подвергали реакции при температуре 16°С в течение 12 часов. Для трансформации сконструированной плазмиды pCR2.1-АК3 использовали штамм JM109 E.coli в качестве клетки-хозяина. Два микролитра смеси для лигирования добавляли к 50 мкл компетентных клеток JM109, оставляли на льду на 30 минут, подвергали тепловому шоку при температуре 42°С в течение 45 секунд и погружали на лед на 2 минуты. Затем добавляли 250 мкл культуральной среды SOC, смесь инкубировали при температуре 37°С и центрифугировали при 225 об/мин в течение 1 часа. 100 мкл данной культуральной среды высевали на планшет с LB/ампициллином, содержащий X-gal и IPTG, и инкубировали при температуре 37°С в течение ночи. Из полученных белых колоний отбирали 10, добавляли в культуральную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина соответственно, а затем инкубировали при температуре 37°C в течение ночи. Для получения продукта инкубирования выделяли плазмидную ДНК с использованием препаративного набора плазмид. 5 мкг выделенной плазмидной ДНК смешивали с 1 мкл EcoRI, 1 мкл реакционного EcoRI-буфера и 3 мкл dH2O, а затем подвергали реакции в течение 1 часа и электрофорезу в 1% агарозном геле. Было подтверждено, что ПЦР-продукт был субклонирован (см. фиг.4). Для определения правильного субклонирования последовательность оснований для плазмиды, в которую был встроен ПЦР-продукт, подтверждали с использованием автоматического ДНК-секвенатора. На этот раз в качестве праймеров использовали обратный праймер М13 (смысловой праймер) и промоторный праймер Т7 (антисмысловой праймер).
Пример 2. Конструирование АК3-экспрессирующего вектора и выделение и очистка рекомбинантного АК3
После того как вектор pCR2.1-AK3 для субклонирования гена АК3 был подвергнут двойной рестрикции ферментами BamHI и Xhol, вставку элюировали из агарозного геля. Плазмиду pQE30 (производимую Quiagene) также гидролизовали ферментами BamHI и Sal1, и большой фрагмент элюировали из агарозного геля для конструирования АК3-экпрессирующего вектора. Лигирование ДНК-фрагментов проводили путем инкубирования со смесью 3 мкл большого фрагмента pQE30, 5 мкл гидролизованного фрагмента АК3, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и 1 мкл 10× буфера для лигазной реакции при температуре 16°С в течение ночи. Для трансформации клеток хозяев использовали M15 E.coli. Колонию, полученную путем высевания на планшет, содержащий ампициллин и канамицин, инкубировали в течение ночи в культуральной среде LB. Плазмиду выделяли и гидролизовали ферментом EcoRl, а затем подтверждали присутствие вставки (см., фиг.5 и 6). Колонию, в которой была подтверждена генная вставка, инкубировали в течение ночи в 50 мл культуральной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и 50 мл инкубированного продукта инокулировали в 1 л другой культуральной среды LB. После инкубирования в течение 1 часа при 37°С со встряхиванием рост рекомбинантных бацилл детектировали по видимому поглощению света при 600 нм в пределах 0,5-0,7 единиц. На этой стадии добавляли IPTG, так чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ, и экспрессию рекомбинантного белка индуцировали инкубированием еще в течение 4 часов. Индуцированный бульон центрифугировали при 4000×g в течение 20 минут с получением клеточного осадка, который суспендировали в 50 мл буфера (буфер для связывания; 5 мМ имидазола, 0,5 М NaCl, 20 мМ Трис-HCl, содержащий 0,1% твина 20, рН 7,9), а затем поддерживали при температуре -20°С. Оттаявшую суспензию подвергали пятикратной 30-секундной ультразвуковой дезинтеграции с одноминутной паузой после каждого цикла. Полученный продукт центрифугировали при 10000×g при температуре 4°С в течение 30 минут. Жидкий супернатант использовали для получения неочищенных экстрактов, содержащих растворимые белки.
Экспрессированную АК3 очищали путем использования хелатной смолы (Pharmacia), которую слоем упаковывали в колонку объемом в 5 мл, и промывали 5 колоночными объемами дистиллированной воды. Этанол удаляли, Ni+ связывали с хелатной смолой с использованием 5 колоночных объемов буфера для загрузки (50 мМ NiSO4, содержащий 0,1% твина 20), промывали 3 колоночными объемами дистиллированной воды, а затем уравновешивали 5 колоночными объемами буфера для связывания. Полученный, как описано выше, неочищенный экстракт загружали, промывали 10 колоночными объемами буфера для связывания, затем промывали 5 колоночными объемами буфера для промывки (20 мМ Трис-HCl, рН 7,9, содержащего 60 мМ имидазола, 0,5 М NaCl и 0,1% твина 20) для исключения неспецифического связывания, и элюировали 5 колоночными объемами элюирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,9, содержащего 0,5 М NaCl, 1 M имидазола и 0,1% твина 20). При этом скорость потока на всех стадиях составляла 1 мл/мин. Из элюированного АК3 удаляли соли путем диализа против буфера (10 мМ Трис-HCl, содержащего 0,1% твина 20, рН 7,9,) с трехкратной сменой буфера в течение 12 часов, а затем концентрировали с использованием ПЭГ 8000. Концентрацию белка количественно определяли с использованием набора для количественного анализа, содержащего белок ВСА; вычисленные выходы очистки представлены в таблице 1, а очищенный АК3 использовали в анализах, проводимых с помощью электрофореза на ПААГ с ДСН (фиг.7), или для очистки и продуцирования антитела.
Таблица 1
Очистка рекомбинантного АК3
| Стадии очистки | Общий белок (мг) | Выход очистки (%) |
| Гомогенат | 949,05 | 100 |
| Растворимая фракция | 178,75 | 18 |
| Аффинная хроматография на Ni-хелате | 14,3 | 1,5 |
Пример 3. Продуцирование и очистка кроличьего антитела против АК3
1 мл очищенного белка АК3 и 1 мл полного адъюванта Фрейнда (FCA) смешивали с помощью эмульгирующего шприца с получением эмульсии. Полученную эмульсию внутривенно и внутрикожно инъецировали кроликам NZW (самцам) весом 2 кг. В течение первой недели 50-100 мкг/мл антигенной эмульсии сначала инъецировали внутрикожно в несколько участков поверхности тела кролика. Следующее инъецирование проводили с использованием 100 мкг/мл антигена, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) путем внутрикожного введения бустер-инъкции два раза с интервалом в две недели. Через одну неделю после последней инокуляции из вены уха кролика брали кровь для детекции индукции антител и продуцирование антител определяли с помощью блот-анализа. На пятой неделе внутрикожно инъецировали 100 мкг белка. На шестой неделе для бустер-иммунизации внутривенно инъецировали раствор белка (20 мкг/мл), не смешанный с адъювантом. А затем кроликов сажали на голодную диету на 24 часа, после чего брали кровь посредством сердечной пункции и из этой крови получали сыворотку.
Кровь, собранную в стеклянный сосуд, оставляли на 1 час при комнатной температуре для свертывания, а затем оставляли на 6 часов при температуре 4°С. Свернувшуюся часть крови удаляли путем центрифугирования при температуре 4°С и при 2500×g в течение 30 минут и сыворотку выделяли. Поликлональные антитела против АК3, очищенные из выделенной сыворотки, получали нижеописанным методом очистки для элиминации антител, перекрестно реагирующих с изоферментами АК1 и АК2, имеющими высокую степень гомологии с АК3. Каждую 500 мкл аликвоту сыворотки хранили при температуре -80°С и использовали в биохимическом анализе для скрининга сыворотки пациента.
Процедуры очистки поликлонального антитела против АК3 осуществляли следующим образом. Выделенную кроличью сыворотку наносили на окрашенный синим аффи-гель СМ для аффинной хроматографии, являющейся в высокой степени эффективной для очистки антитела. Смолу окрашенного синим аффи-геля СМ промывали 0,1 М уксусной кислотой (рН 3,0), содержащей 1,4 М NaCl, 40% изопропанола и вторично дистиллированную воду, и упаковывали в стеклянную колонку. Эту колонку уравновешивали PBS. Элюент всего пика, который обнаруживался сразу после загрузки антисыворотки на колонку, собирали. Иммуноглобулины в вышеуказанном элюенте осаждали путем преципитации сульфатом аммония в условиях концентрации сульфата аммония с 45%-ным насыщением. Для получения АК3-антитела, обладающего специфичностью в отношении АК3 и не обладающего перекрестной реактивностью с указанными иммуноглобулинами против АК1 и АК2, очищенные АК1 (фиг.8) и АК2 связывали с аффи-гелем 15 (Bio-Rad), а АК3 связывали с аффи-гелем 10 (Bio-Rad) для проведения аффинной колоночной хроматографии. Аффинные хроматографические колонки, на которые были загружены АК1, АК2 и АК3 соответственно соединяли в нужном порядке и уравновешивали 0,1 М фосфатно-натриевым буфером (рН 7,5), содержащим 0,5 М NaCl. Для удаления неспецифически связанных антител колонки промывали 0,1 М фосфатно-натриевым буфером (рН 7,5), содержащим 1М KCl. И наконец, антитела, специфичные к АК3, элюировали 0,1 М глицином/HCl (рН 2,5) (см. фиг.10). Для нейтрализации сильной кислотности элюент вводили непосредственно в отношении 1/20 к объему 2 М Трис/HCl (рН 7,5). АК3-специфическое поликлональное антитело, очищенное, как описано выше, диализовали в PBS, хранили при температуре 4°С и использовали в Вестерн-блот-анализе. Антигены АК1, АК2 и АК3 для полученных антител против изофермента аденилаткиназы (Ab против АК1, Ab против АК2 и Ab против АК3) подвергали Вестерн-блот-анализу в соответствии с нижеописанным методом, и было подтверждено, что они не обладают перекрестной реактивностью друг с другом (см. фиг.11 и 12). В случае электрофореза очищенного рекомбинантного АК осуществляли общий метод электрофореза в ДСН-ПААГ Lamile, а в случае отсутствия замены осуществляли электрофорез в модифицированном нативном геле. После завершения ДСН-ПААГ-электрофореза в модифицированном нативном геле прокладку для переноса изготавливали в следующем порядке: после завершения электрофореза в ДСН-ПААГ или в модифицированном нативном геле, на держатель для геля помещали волокно, поверх него помещали фильтровальную бумагу, а поверх этой бумаги помещали PVDF-пленку, предварительно обработанную этанолом, после чего наносили гель и покрывали его волокном. "Сэндвич" для переноса помещали в резервуар с буфером, снабженный охлаждающим устройством, и в течение 2 часов подавали постоянный электрический ток (90 В, 0,8 А). После детекции переноса предварительно окрашенного маркера пленку PVDF снимали с держателя для геля, погружали в блокирующий раствор TBST, содержащий 5% обезжиренное сухое молоко, а затем слегка встряхивали в течение 2 минут. PVDF-пленку с блокированным белком погружали в раствор антитела против АК3, имеющий адекватную концентрацию, а затем встряхивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Пленку, связанную с антителом, дважды промывали TBST для удаления неспецифически связанных антител. Промытую PVDF-мембрану обрабатывали раствором антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированного с пероксидазой хрена, в течение 1 часа при 37°С. Затем мембрану тщательно промывали TBST. После удаления TBST с пленки проводили реакцию с использованием набора для ЭХЛ-Вестерн-блот-анализа, а затем проявляли путем экспонирования с рентгеновской пленкой.
Пример 4. Обнаружение АК3 в сыворотке пациента
С помощью Вестерн-блот-анализа распределения АК3 в ткани скелетной мышцы и сердечной мышцы было подтверждено, что АК1 присутствует как в скелетной мышце, так и в сердечной мышце, а АК2 и АК3 присутствуют лишь в сердечной мышце (см. фиг.13). Поскольку специфичность АК2 и АК3 в отношении сердечной мышцы дает возможность использовать их в качестве биологического маркера для диагностики болезни, такой как инфаркт миокарда, было подтверждено, что путем Вестерн-блот-анализа, проведенного после электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, нельзя установить, какой именно фермент присутствует в сыворотке пациента с инфарктом миокарда, АК2 или АК3 (см. фиг.14). Тем самым присутствие АК2 и АК3 не могло быть обнаружено Вестерн-блот-анализом в условиях замены, что обусловлено неспецифическим связыванием с сывороточными белками. Присутствие АК2 не могло быть подтверждено в Вестерн-блот-анализе в условиях электрофореза в ДСН-ПААГ. Для АК3 данная полоса могла быть подтверждена в сыворотке пациента с инфарктом миокарда в той же области, что и для очищенного АК3, благодаря перекрыванию с неспецифическими полосами. Однако, поскольку всегда обнаруживается множество неспецифических полос, был разработан новый метод электрофореза, который может обнаруживать лишь АК3. Новым методом электрофореза является метод, в котором электрический ток течет в обратном направлении, которое отличается от обычного направления при осуществлении электрофореза в стандартном акриламидном геле, где нативный гель состоит из 2 мл раствора мономера, 2,5 мл 4× буфера для выделения геля (158 мМ Трис, 0,256 н. Н3PO4, рН 6,9), 4,25 мл Н2О, 1,25 мл катализатора (0,06% сульфат аммония, 0,02% фосфат рибофлавина) и 20 мкл TEMED. В методе с обратным направлением тока образец загружали путем смешивания 1 мкл сыворотки, 8 мкл DW и 1 мкл буфера для образца (50% сахароза, 0,1% бромфеноловый синий) и в течение 2 часов подавали электрический ток 20 мА в буфер резервуара (25 мМ Трис, 5,5% глицин).
Направление миграции АК1, АК2 и АК3 идентифицировали путем загрузки на гель очищенных АК, сыворотки пациента и нормальной сыворотки вышеупомянутым способом. Было установлено, что сильно основный АК3 распространяется в гель, а АК1 и АК2 диффундируют в буфер резервуара (см., фиг.15).
Пример 5. Продуцирование моноклональных антител против АК2 и АК3
Для продуцирования моноклональных антител против АК3 и АК2 эмульсию (0,1 мл), полученную путем смешивания 50 мкг раствора антигенного белка и такого же объема полного адъюванта Фрейнда, сначала инъецировали в подушечки лап 4-недельной мыши BALB/c (гаплотип H-2d) и дважды инокулировали через интервалы в 10 дней. Для второй бустер-инъекции в качестве иммунного адъюванта использовали неполный адъювант Фрейнда. После подтверждения продуцирования антитела в сыворотке мыши брали лимфоузел и приготавливали клеточную суспензию с использованием модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей фетальную телячью сыворотку, IL-2, пенициллин-стрептомицин, после чего лимфоциты В в этой клеточной суспензии и предварительно приготовленную миеломную клеточную линию Sp2/0-Ag14, которая представляла собой опухолевые клетки того же самого мышиного штамма, описанного выше, подвергали слиянию путем ПЭГ-обработки. Каждые 1,5×108 клеток, взятых из иммунных клеток и клеток Sр2, центрифугировали в центрифужной пробирке при 400×g в течение 10 минут с образованием осадка, супернатант удаляли, затем к нему добавляли 1 мл 50% ПЭГ 1500 при 37°С, смешивали кончиком пипетки в течение 1 минуты и очень осторожно перемешивали. К полученной смеси в течение 1 минуты добавляли 1 мл культуральной среды, содержащей фетальную телячью сыворотку при 37°С, и непрерывно добавляли, перемешивая, бессывороточную среду, и клетки, нерастворившиеся в ПЭГ, постепенно разводили. И наконец, к смеси добавляли 7 мл бессывороточной среды и перемешивали приблизительно 3 минуты. После промывки клеток их в достаточной степени диспергировали путем добавления 20 мл бульона, затем каждые 0,1 мл дисперсии распределяли по 96-луночным планшетам для культивирования тканей и инкубировали в течение 24 часов в 7% CO2-инкубаторе при 37°С для создания планшета с клетками-основателями. Гибридные клетки сортировали по их жизнеспособности в среде с гипоксантин-аминоптерин-тимидином (HAT). На следующий день после слияния клеток к ним добавляли 0,1 мл среды HAT на каждую лунку. На второй, третий, пятый, восьмой и одиннадцатый дни каждую половину бульонной среды отсасывали и 0,1 мл HAT частично заменяли свежей средой. После этого через интервалы в 3 или 4 дня повторяли ту же самую процедуру, которая была описана выше, а через 4 недели лунки, содержащие выжившие клетки, отдельно отбирали, супернатант удаляли и проводили ELISA с использованием 96-луночного микротитрационного планшета, сенсибилизированного АК3. В этом анализе, с использованием 1 мл культуры, были отобраны лишь лунки, имеющие оптическую плотность 0,3 или более при 405 нм. Отобранные клетки переносили в 24-луночный планшет для культивирования ткани и подвергали пролиферации в масштабе 1 мл вместе с клетками-фидерами, происходящими от BALB/c (суспензия клеток селезенки BALB/c, обработанная митомицином после растворения эритроцитов) в среде НТ вместо HAT в течение 15 дней в 2 мл и 10 мл культуры соответственно. В этом процессе клонирование гибридомных клеток проводили методом лимитирующего разведения. Тридцать шесть лунок разводили до плотности 5 клеток на лунку, другие 36 лунок разводили до плотности 1 клетка на лунку, а остальные 24 лунки разводили до плотности 0,5 клеток на лунку в 96-луночном микротитрационном планшете. Пассирование клеток проводили на 5-й и 12-й день после инкубирования, а затем индуцировали пролиферацию клеток, как описано выше в масштабе 1 мл культуры. Инкубированный супернатант в лунке, где, как предполагалось, образовывалось моноклональное антитело, отбирали и проводили ELISA для скрининга антител. В этом процессе клоны, указывающие на перекрестную реактивность с АК1 и АК2 удаляли и гибридомные клетки, специфически распознающие лишь АК3, четко отбирали и классифицировали как клеточные линии, продуцирующие моноклональное антитело против АК3. И наконец, отобранную гибридому переносили в 5-миллилитровую колбу для инкубирования и инкубировали в целях пролиферации. Для продуцирования моноклонального антитела (mAb) из созданной клеточной линии гибридомные клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавками (10% фетальная телячья сыворотка, HAT, пенициллин и G418) и эти клетки секретировали mAb в культуральную среду. Моноклональное антитело выделяли и очищали (25 мкг антитела на 1 мл культуры) из культуральной среды. Альтернативно mAb индуцировали из асцита мышей. Гибридомные клетки культивировали в присутствии 5% двуокиси углерода в DMEM-бульоне и через 3 дня 2×106 слитых жизнеспособных клеток собирали и внутрибрюшинно инъецировали мышам BALB/c, что приводило к пролиферации опухоли и продуцированию антитела из асцита. Антитело выделяли и очищали методом аффинной колоночной хроматографии на АК3 с выходом 0,8 мг, мл.
Пример 6. Диагностика инфаркта миокарда с использованием антитела против АК3 и использование АК3 в качестве биохимического маркера для диагностики инфаркта миокарда
В соответствии с фиг.13 характер экспрессии АК3 в мышечной ткани является специфическим для сердечной мышцы. Принимая во внимание возможность высвобождения АК3 в кровь, обусловленного повреждением сердечной мышцы, в этом примере описан эксперимент, проведенный для оценки эффективности АК3 в качестве диагностического индикатора инфаркта миокарда с использованием пробы сыворотки, взятой у амбулаторного больного в кабинете неотложной помощи больницы общего профиля.
Были взяты пробы крови у 30 индивидуумов, и названия болезней указаны в таблице 2. Из 5 пациентов с инфарктом миокарда 4 пациента имели острое течение болезни, а один пациент имел хроническое заболевание. Единицы СКМВ каждой сыворотки детектировали в клинической патологической лаборатории. Число единиц СКМВ здорового индивидуума составляло ниже 7, и это значение принималось за норму.
Сыворотки 29 пациентов тестировали, как описано выше, с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием антитела против АКЗ. В результате этого у пациента с инфарктом миокарда был обнаружен АКЗ в концентрации, идентичной концентрации СКМВ (см. фиг.16). Однако у пациента, которому проводили операцию по поводу перелома кости ноги, СКМВ составлял 44 единицы и был ложноположительным, а АК3 не был детектирован (см. фиг.16, панель В, дорожка 8). У пациента, которому проводили операцию по поводу кровоизлияния в мозг (пациент №22 в таблице 2), величина СКМВ была очень высокой и составляла вплоть до 56,3, но патологии сердца не наблюдалось. В этом примере АК3 не был обнаружен. Результаты этого эксперимента подтвердили, что детекция АКЗ с использованием антитела против АК3 позволяет более точно поставить диагноз инфаркта миокарда, чем по СКМВ. Таким образом, диагноз острого или хронического инфаркта миокарда был поставлен более точно с использованием иммунологической композиции или диагностического набора, содержащего антитело против АК3, чем с использованием миоглобулина СКМВ. Отсюда очевидно, что диагностический набор с использованием антитела согласно изобретению является клинически специфичным по отношению к сердечной мышце.
Таблица 2
| Пациент № | Название болезни | Пол/возраст | Количество СКМВ | Детекция АК3 |
| 0 | Нормальная контрольная сыворотка | М/26 | - | |
| 1 | Стабильная стенокардия | М/62 | 2,7 | - |
| 2 | Нестабильная стенокардия | М/53 | 4,6 | - |
| 3 | Операция по поводу перитонита | М/54 | 7,3 | - |
| 4 | Острый инфаркт миокарда | М/56 | 22,1 | + |
| 5 | Операция по поводу тифлита | Ж/32 | 3,0 | - |
| 6 | Предсердная фибрилляция | М/45 | 3,3 | - |
| 7 | Ишемическая болезнь миокарда (пациент, имеющий в анамнезе инфаркт миокарда) | М/78 | 2,8 | - |
| 8 | Рак пищевода | М/55 | 1,1 | - |
| 9 | Операция по поводу перелома кости ноги | М/25 | 44,0 | - |
| 10 | Нестабильная стенокардия | М/67 | 3,6 | - |
| 11 | Операция по устранению дефекта межжелудочковой перегородки | М/34 | 8,5 | - |
| 12 | Астма | М/76 | 9,2 | - |
| 13 | Острый инфаркт миокарда | М/40 | 40,4 | + |
| 14 | Нестабильная стенокардия | М/67 | 2,5 | - |
| 15 | Нестабильная стенокардия | М/58 | 5,8 | - |
| 16 | Операция по устранению дефекта межжелудочковой перегородки | М/34 | 12,8 | - |
| 17 | Операция по поводу перитонита | М/85 | 5,6 | - |
| 18 | Инфаркт миокарда | М/41 | 18,0 | + |
| 19 | Тяжелая псевдопаралитическая миастения | Ж/45 | 6,2 | - |
| 20 | Нестабильная стенокардия | М/67 | 0,7 | - |
| 21 | Рак легких | М/79 | 2,7 | - |
| 22 | Операция по поводу кровоизлияния в мозг | М/25 | 56,3 | - |
| 23 | Операция по поводу перфорации кишки | М/64 | 4,3 | - |
| 24 | Ожирение миокарда, диабет | М/67 | 2,9 | - |
| 25 | Дизаритмия | Ж/52 | 2,7 | - |
| 26 | Множественный перелом ребер | М/18 | 3,9 | - |
| 27 | Диабет, гипертония, предсердная фибрилляция | Ж/91 | 2,4 | - |
| 28 | Соматизированное расстройство (психическое заболевание) | М/28 | 3,1 | - |
| 29 | Острый инфаркт миокарда | М/34 | 56,3 | + |
На фиг.16 показан результат Вестерн-блот-анализа для детекции АК3 в сыворотке пациента. Данные, полученные для тестируемой сыворотки и показанные на фиг.16, представлены ниже в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Данные для тестируемой сыворотки на фиг.16 (панель А)
| Дорожка № | Название болезни | Единица СКМВa) | № пациента в таблице 2 |
| 1 | Острый инфаркт миокарда | 22,1 | 4 |
| 2 | Острый инфаркт миокарда | 40,4 | 13 |
| 3 | Острый инфаркт миокарда | 18 | 18 |
| 4 | Острый инфаркт миокарда | 56,3 | 29 |
| S | Образец ткани сердца человека | ||
| N | Нормальная сыворотка | ||
| АК2 | Очищенный рекомбинантный АК2 | ||
| p | Очищенный рекомбинантный АК3 | ||
| а) СКМВ нормальной сыворотки составляет менее 7 единиц. |
Таблица 4
Данные для тестируемой сыворотки на фиг.16 (панель В)
| Дорожка № | Название болезни | Единица СКМВa) | № пациента в таблице 2 |
| 5 | Стабильная стенокардия | 2,7 | 1 |
| 6 | Рак пищевода | 1,1 | 8 |
| 7 | Предсердная фибрилляция | 3,3 | 6 |
| 8 | Перелом кости ноги | 44,0 | 9 |
| 9 | Операция по дефекту межжелудочковой перегородки | 12,8 | 16 |
| 10 | Операция по поводу перитонита | 5,6 | 17 |
| 11 | Рак легкого | 2,7 | 21 |
| N | Нормальная сыворотка | н.о.a) | |
| Р | АК3 | ||
| а) н.о.: не определяли |
Пример 7. Диагностика инфаркта миокарда с использованием антитела против АК3 и клинический тест на специфичность в отношении инфаркта миокарда
В этом эксперименте для подтверждения клинической специфичности АК3 в качестве биохимического маркера для диагностики болезни сердца брали тест-сыворотку у стационарных больных, которые были госпитализированы по поводу внутренних болезней с расстройством кровообращения в центральной больнице Guro при Корейском университете и у которых был точно диагностирован инфаркт миокарда. Измеряли концентрацию СКМВ и проводили ЭХЛ-Вестерн-блот-анализ и "сэндвич"-анализ ELISA с использованием антитела против АК3.
В соответствии с ELISA аффинно-очищенное кроличье поликлональное антитело против АК3 (450 нг/лунку) связывали с 96-луночным микротитрационным планшетом, затем добавляли 100 мкл сыворотки и проводили реакцию при 30°С в течение 1 часа. Реагенты тщательно промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), снова подвергали реакции с биотинилированным кроличьем поликлональным антителом против АК3, обрабатывали для связывания с ПХ (пероксидазой хрена), присоединенной к стрептавидину, и обрабатывали хромофорным субстратом. Затем определяли оптическую плотность с помощью ELISA-детектора. В этом эксперименте в качестве стандартного материала использовали генетически рекомбинантные АК3, выделенные и очищенные авторами настоящего изобретения. Результаты по диагностике острого инфаркта миокарда (ОИМ), проводимой с использованием СКМВ и антитела против АК3, представлены ниже в таблице 5.
Таблица 5
| Образец № | Название болезни | СКМВa) (нг/мл) | АК3 | Примечания (возраст/пол) | ||
| Вестерн-блот-анализd) | "Сэндвич"-ELISAb) (мкг/мл) | |||||
| 1 | 417 | инфаркт миокарда | 406,6 | ++ | 2,0 | 75/М |
| 2 | 436 | " | 123,8 | ++ | 10,0 | 58/М |
| 3 | 464 | " | 230,9 | +++ | 4,7 | 67/М |
| 4 | 474 | " | 47,23 | ++ | 11,6 | 65/М |
| 5 | 481 | " | 378,6 | + | 2,0 | 53/М |
| 6 | 487 | " | + | 3,0 | ||
| 7 | 503 | " | 51,1 | + | 7,3 | 56/М |
| 8 | 514 | " | 33,2 | ++ | 7,6 | 53/М |
| 9 | 526 | " | 2,15 | ++ | 3,3 | 57/Ж |
| 10 | 547 | " | 314,2 | +++ | 7,0 | 60/М |
| 11 | 548 | " | 71,79 | + | 4,2 | 63/М |
| 12 | 553 | " | 175,4 | +++ | 5,8 | 52/М |
| 13 | 565(6) | " | >500,0 | +++ | 4,7 | 61/М |
| 14 | 578 | " | 176,7 | + | 8,1 | 57/М |
| 15 | 606 | " | 1,55 | + | 1,2 | 64/М |
| 16 | 607 | " | +++ | 10,0 | ||
| 17 | 614 | " | 19,84 | + | n.d.c) | 62/М |
| 18 | 616 | " | 97,93 | ++ | n.d. | 45/М |
| 19 | 621 | " | 1,79 | + | n.d. | 66/М |
| 20 | 625 | " | 1,85 | + | n.d. | 51/М |
| 21 | 626 | " | 1,62 | ++ | 5,0 | 41/М |
a) СКМВ-анализ проводили в больнице общего профиля Ansan при Корейском университете.
b) оптическая плотность сыворотки у здорового пациента в " сэндвич"-ELISA-анализе составляет А490<0,02. Для всех 6 образцов, полученных от здоровых индивидуумов, эти значения были ниже контрольного диапазона.
c) Тест не проводили из-за отсутствия сыворотки.
d) Все образцы были АК3-положительными.
На фиг.17а и фиг.17b показаны результаты Вестерн-блот-анализа на АК3 с использованием ЭХЛ-субстрата.
Как видно из таблицы 5, в результате анализа, проводимого с использованием диагностических индикаторов СКМВ и АК3 на пробах сыворотки, взятых у всех 60 пациентов, включая 21 образец, взятый у пациентов, у которых был точно диагностирован инфаркт миокарда и которые были госпитализированы по поводу внутренних болезней с расстройством кровообращения в центральной больнице Guro при Корейском университете, и 10 образцов, у пациентов с инфарктом миокарда, которые были госпитализированы в центральной больнице при университете Hanyang в Корее, было подтверждено, что АК3 обнаруживался со 100%-ной точностью. Даже все те пациенты, у которых был поставлен ложный отрицательный диагноз в результате теста по СКМВ, используемого в настоящее время в качестве репрезентативного оптимального индикатора для диагностики инфаркта миокарда, могли в соответствии с АК3-анализом, рассматриваться как пациенты с положительным диагнозом. Следовательно, иммунологическая композиция согласно изобретению позволяет давать более точный диагноз, а также обладает высокой специфичностью в патолого-биологическом анализе и высокой клинической специфичностью.
Промышленное применение
Как видно из вышеприведенного описания, митохондриальные изоферменты аденилаткиназы человека, а в частности изофермент АК3, конкретно используемый в настоящем изобретении, имеет следующие отличительные признаки:
(1) он высвобождается в кровоток при повреждении, характерном для сердечной мышцы;
(2) он высвобождается сразу после повреждения сердечной мышцы;
(3) поскольку он имеет значительный период полужизни в кровотоке, то его непрерывно возрастающее количество указывает на повреждение сердечной мышцы (в случае образца №7 таблицы 2 АК3 не был обнаружен в сыворотке индивидуума, имеющего в анамнезе инфаркт миокарда). Такие аномальные патологические концентрации АК3, в зависимости от времени после начала ОИМ, обнаруживают линейную зависимость;
(4) увеличение концентрации в сыворотке подтверждается через 2 часа после возникновения боли в груди (Фиг.16, дорожка 3).
В соответствии с этим иммунологическая композиция или диагностический набор согласно изобретению позволяет установить ранний диагноз болезни сердца, такой как инфаркт миокарда; не требует применения специальной техники или подготовки для получения результата соответствующего клинического анализа и облегчает автоматизацию анализа. Более того, образцы для анализов являются стабильными и недорогостоящими и не подвержены повреждениям и негативным воздействиям. Они также дают более точный результат, чем результаты, полученные с использованием стандартного диагностического индикатора СКМВ, который преимущественно используется в клинической патологии. Кроме того, диагностический набор согласно изобретению может быть применен в виде набора типа пластыря и типа ленты, а поэтому позволяет быстро и просто поставить диагноз. Поскольку известные диагностические методы требуют использования дорогостоящего оборудования и высокого качества диагностической техники, или экспресс-наборы РОСТ требуют множества маркеров для одновременного проведения нескольких повторных тестов, которые являются достаточно дорогостоящими, то они могут быть осуществлены лишь в нескольких центральных больницах, тогда как диагностический набор согласно изобретению является недорогостоящим и может быть легко использован в медпунктах и самим пациентом. Кроме того, ожидается, что использование описанного набора даст значительный экономический эффект и позволит избежать применения дорогостоящих импортных диагностических реагентов и наборов.
1. Иммунологическая композиция для диагностики сердечного заболевания, отличающаяся тем, что содержит антитело или часть его, которое связывается с изоферментом 2 (АК2) или изоферментом 3 (АК3) митохондриальной аденилаткиназы человека, в сочетании с соответствующим носителем.
2. Иммунологическая композиция по п.1, где изоферментом митохондриальной аденилаткиназы человека является АК3.
3. Диагностический набор для диагностики сердечного заболевания, отличающийся тем, что содержит антитело или часть его, которое специфически связывается с изоферментом 2 (АК2) или изоферментом 3 (АК3) митохондриальной аденилаткиназы человека, и детектируемый маркер.
4. Диагностический набор по п.3, где изоферментом митохондриальной аденилаткиназы человека является АК3.
5. Диагностический набор по п.3 или 4, где детектируемый маркер выбран из группы, состоящей из радиоактивных индикаторов, ферментов, частиц золота, хемилюминесцентных соединений, флуоресцеина, фикобилипротеина, хелатобразувщих соединений редкоземельного металла, родамина, кофакторов фермента, стрептазидина и биотина.
6. Способ детектирования изофермента аденилаткиназы в биологическом образце, отличающийся тем, что включает в себя следующие стадии:
(i) получение иммунного комплекса в результате контактирования антитела, которое специфически связывается с изоферментом 2 (АК2) или изоферментом 3 (АК3) митохондриальной аденилаткиназы человека, или части этого антитела с биологическим образцом; и
(ii) детектирование иммунного комплекса, полученного на стадии (i).
7. Способ детектирования по п.6, где указанное детектирование используется в диагностике сердечного заболевания.
8. Способ детектирования по п.6 или 7, где изоферментом митохондриальной аденилаткиназы человека является АК3.
9. Способ детектирования по п.6 или 7, где стадия детектирования осуществляется методом иммунофлуоресцентного антитела, методом развития окраски, вызываемой фермент-субстратным взаимодействием, методом связывания с хемилюминесцентным соединением или методом образования комплексов с частицами золота.
10. Способ детектирования по п.6 или 7, где указанный биологический образец выбран из группы, состоящей из мочи, крови, сыворотки и плазмы крови.
11. Применение изофермента 2 (АК2) или изофермента 3 (АК3) митохондриальной аденилаткиназы человека в качестве маркера для диагностики сердечного заболевания.
12. Применение по п.11, где изоферментом митохондриальной аденилаткиназы человека является АК3.
13. Применение антитела или части его, которое специфически связывается с изоферментом 2 (АК2) или изоферментом 3 (АК3) митохондриальной аденилаткиназы человека, для диагностики сердечного заболевания.
14. Применение по п.13, где изоферментом митохондриальной аденилаткиназы человека является АК3.
