Рекомбинантные вирусы гриппа а
Изобретение относится к области генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения анттенуированного рекомбинантного штамма вируса гриппа А. Способ предусматривает получение рекомбинантного сегмента NS вируса гриппа А, содержащего функциональный РНК-связывающий домен и модификацию его генной последовательности ниже нуклеотида 400 гена NS1. При этом указанная модификация препятствует трансляции остальной части гена NS1. Предложены также генно-инженерный штамм вируса гриппа А, вакцина его содержащая, а также рекомбинантный сегмент гена NS вируса гриппа А. Получаемый генно-инженерный штамм вируса гриппа А обладает интерферон-индуцирующим, но при этом интерферон-нечувствительный, природный фенотип и способен индуцировать ответ в виде продукции интерферона в клетках MDCK и оплодотворенных куриных яйцах, а также расти там. Изобретение может быть использовано в медицине и вирусологии. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 17 ил.
Область техники
Данное изобретение относится к области создания и применения вакцин и относится к векторам аттенуированных живых вакцин, более конкретно к таким векторам, которые созданы на основе или же получены из генетически модифицированных штаммов вируса гриппа А, а также к производству рекомбинантных вирусов гриппа и вакцин.
Предпосылки изобретения
Вирусы гриппа представляют собой сегментированные вирусы отрицательной нити РНК и принадлежат семейству Orthomyxoviridae. Вирус гриппа А состоит из 9 структурных белков и дополнительно кодирует один неструктурный белок NS1 с регуляторными функциями. Неструктурный белок NS1 в процессе репродуктивного цикла синтезируется в большом количестве и локализуется в цитозоле и ядре инфицированных клеток. Сегментированная природа вирусного генома дает возможность реализации механизма генетической пересортировки (обмен геномными сегментами) в процессе смешанного инфицирования клетки различными штаммами вирусов. Наличие некоторых признаков делает вирусы гриппа привлекательными кандидатами для создания векторов эффективных живых вакцин против различных заболеваний: (i) вирусы гриппа индуцируют мощный клеточный и гуморальный иммунный ответы, на системном уровне и на уровне слизистой, против вирусных белков, сопровождающих инфекцию; (ii) вирус гриппа, будучи РНК-вирусом, в своем репликативном цикле не содержит фазу ДНК. Следовательно, можно исключить хромосомную интеграцию вирусных генов у хозяина; (iii) множество различных подтипов вируса гриппа является доступным. Поскольку антитела против разновидности указанных подтипов не обладают перекрестной реактивностью, предсуществующий иммунитет к вирусному вектору у хозяина, что зачастую является проблемой в случае других живых векторов, можно обойти. Возможны также эффективные бустерные иммунизации различными подтипами вирусов гриппа, экспрессирующими одни и те же антигены; и (iv) аттенуированные вирусы гриппа в качестве живых вакцин гриппа, которые, как было показано, сохраняются и остаются иммуногенными у человека, являются доступными.
До сих пор основная проблема в использовании вируса гриппа в качестве вектора была связана с размером вирусного генома и его ограниченной способностью "терпеть" (не отвечать на) чужеродные последовательности. Среди десяти белков вируса гриппа только для поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) с помощью генной инженерии была достигнута стабильная экспрессия чужеродных эпитопов. Поскольку вирус гриппа "терпит" включение всего лишь приблизительно 10 аминокислот в свою молекулу гемагглютинина, возможности влиять на конформационные свойства включенных эпитопов, которые, вероятно, могли бы быть лучше представлены, если бы было возможно включение более длинных последовательностей, достаточно ограничены. Кроме того, поверхностные гликопротеины вируса гриппа, такие как НА или NA, не могут считаться оптимальными мишенями для представления чужеродных последовательностей, поскольку они ассоциированы с антигенными свойствами вирусов. Конструкция НА живого вируса, содержащая необходимый чужеродный антиген, неприменима для бустерных иммунизации (например, путем второго и дальнейших введений) из-за предсуществующего иммунитета против НА, вызываемого первой иммунизацией или естественной вирусной инфекцией. Бустерная иммунизация была бы возможна только при введении необходимой антигенной структуры в другую молекулу НА, принадлежащую вирусу гриппа другого подтипа. Очевидно, что этот способ является сложным, трудоемким и исключительно длительным, и следовательно, трудно представить себе, чтобы им можно было воспользоваться в процессе рутинного изготовления вакцин.
Предшествующие настоящему изобретению исследования в данной области показали, что ген NS вируса гриппа А может оказаться многообещающей альтернативой [гену] гемагглютинина как вирусному носителю для представления необходимого чужеродного антигена иммунной системе животного или человека. В настоящее время установили, что метод обратной генетики (Egorov et al., 1998, J Virol 72 (8), 6437-41) позволяет спасти вирусы гриппа, содержащие длинные делеции или вставки чужеродных последовательностей со стороны карбокси-конца неструктурного Белка 1 (Белок NS1). Белок NS1 в изобилии представлен в клетках, инфицированных вирусом гриппа и стимулирует ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) так же, как и антительные ответы, в ходе естественного протекания инфекции вируса гриппа.
Дополнительные подробности, связанные с геном NS вируса гриппа, можно почерпнуть в международной заявке WO 99/64571. Кроме того, в международной заявке WO 99/64571 показано, что трансфектанты аттенуированного вируса гриппа А, содержащие делеции "knockout" полного гена NS1, обладают фенотипом, который способен интенсивно индуцировать интерферон (IFN). Это заключение было основано на том наблюдении, что такие трансфектанты были способны расти на интерферон-дефицитных клетках Vero, но не могли расти на куриных яйцах или же клетках MDCK.
Белок NS1 вируса гриппа представляет собой РНК-связывающий белок, который участвует в целом ряде регуляторных функций в процессе [развития] инфекции вируса гриппа. Этот белок синтезируется в больших количествах и обнаруживается главным образом в ядре на ранних стадиях инфицирования, а позже, в вирусном цикле, в цитоплазме инфицированных клеток. Отличный от белка NS1 вируса гриппа другой регуляторный вирусный белок, так называемый белок Nef вируса ВИЧ-1, который является миристилированным белком, локализован в цитозоле и ассоциирован с клеточной мембраной.
Иммунный ответ, направленный против ранне экспрессируемых регуляторных белков ВИЧ-1, мог бы даже вызывать элиминацию инфицированных вирусом клеток хозяина в процессе репликативного цикла, до высвобождения новых инфекционных вирусных частиц. Поскольку белок Nef относится к числу первых высвобождаемых белков, а в дальнейшем является одним из основных белков ВИЧ-1, продуцируемых в процессе [развития] инфекции, можно полагать, что он играет решающую роль в эффективности получаемой вакцины против СПИДа.
"Отрицательный фактор" (Nef) ВИЧ-1 кодируется открытой рамкой считывания, которая локализована на 3'-конце вируса, частично перекрывая район U3 длинного 3'-концевого повтора. Вплоть до 80% раннего, подвергнутого многократному сплайсингу, класса вирусных транскриптов кодирует Nef. Продукт гена Nef представляет собой NH2-концевой миристилированный белок в 27-30 кДа, который преимущественно локализован в цитоплазме и ассоциирован с мембраной и цитоскелетным матриксом. Он является высококонсервативным в ряду различных вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и обезьян (SIV).
Тесная эколюционная взаимосвязь между этими лентивирусами приматов предполагает, что белок Nef играет важную роль в вирусной инфекции и патогенезе, хотя и следует отметить, что конкретная роль в жизненном цикле вируса, а также в его функционировании на клеточном уровне в настоящее время все еще является предметом изучения.
Тем не менее многие подробности, связанные с белком Nef и его эффектами, уже известны. Например, имеются сообщения о том, что некоторые люди, инфицированные ВИЧ, из которого был удален Nef, оставались здоровыми, с нормальным содержанием CD4 в течение 10-14 лет после инфицирования, хотя и удаление Nef нельзя считать универсальным [условием] отсутствия прогрессии [заболевания] в течение длительного периода. Кроме того, Nef-дефицитный вирус иммунодефицита обезьян (SIV) не способен вызывать СПИД у инфицированных взрослых макак. Мутанты SIV с делецией гена Nef способны даже вырабатывать защитную реакцию против вирулентной стимуляции (контрольного заражения). Было показано, что Nef стимулирует синтез провирусной ДНК ВИЧ-1, и было также показано, что ее экспрессия индуцирует эффективную интернализацию и деградацию СD4-рецептора ВИЧ-1 клеточной поверхности. Такая регуляция по типу отрицательной обратной связи Nef-индуцированного CD4, которая придает клеткам резистентность к суперинфекции вирусом, потенциально должна увеличивать вирусную репликацию путем облегчения высвобождения потомства вирионов. Было показано далее, что внеклеточный белок Nef способен активировать ВИЧ-1 из латентного состояния до состояния, когда продуцируется инфекция как в инфицированных T-клеточных линиях, так и в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), полученных у асимптоматических носителей. Далее было показано, что цитотоксические лимфоциты (CTL) оказались неэффективными в лизисе первичных клеток, инфицированных ВИЧ-I, когда экспрессировался продукт гена Nef.
Защита ВИЧ-инфицированных клеток от эффективного узнавания и уничтожения цитотоксическими лимфоцитами (CTL) коррелирует с опосредованной Nef регуляцией по типу отрицательной обратной связи молекул МНС класса I. Nef также мешает индукции мРНК IL-2 в T-клеточных линиях. Более того, существует большое количество клеточных партнеров, которые, как было показано, ассоциированы с экспрессией Nef, включая киназы семейства Src, β-COP, серин-треониновую киназу, тиоэстеразу и р53.
Сообщалось также, что у большей части (приблизительно 2/3) ВИЧ-1-серопозитивных больных вырабатывались Nef-специфические цитотоксические лимфоциты.
В [последовательности] белка Nef были идентифицированы два центральных мультирестрицированных иммунодоминантных района (аминокислоты со 66 до 100 и со 115 до 146) и карбокси-концевой район (аминокислоты со 182 до 206). Эти три мультирестрицированных иммунодоминантных района (аминокислотные последовательности, содержащие более одного T-клеточного эпитопа) узнаются CD8 + CTL человека в ассоциации по меньшей мере с 14 различными молекулами МНС класса I, включая важные гаплотипы МНС HLA-AL, -A3, -A11, -В8, -В17, -В18 и -В37.
Два центральных мультирестрицированных домена белка Nef являются наиболее высококонсервативными районами в ряду различных изолятов ВИЧ-1 и являются иммунодоминантными для большинства из протестированных асимптоматичных ВИЧ-1-серопозитивных доноров. Вдобавок к иммуногенности белка Nef вируса ВИЧ-1, для которого была продемонстрирована его способность индуцировать мощные T-клеточные иммунные ответы, в литературе были опубликованы также данные о Nef-специфических B-клеточных иммунных ответах.
Краткое содержание изобретения
Настоящее изобретение связано с областью создания векторов аттенуированных живых вакцин, более конкретно - с такими векторами, которые созданы на основе или же получены из генетически модифицированных штаммов вируса гриппа А. Оно связано, кроме того, с конструкцией и модификацией полученных методами генной инженерии неструктурных генов вирусов гриппа А, в частности, сегмента гена NS1, причем модификации включают в себя делеции выборочных частей сегмента гена NS1 и/или вставок гетерологичных, предпочтительно антигенных, последовательностей в выборочные сайты гена NS1. Другим объектом настоящего изобретения является обеспечение химерных вирусов гриппа, которые содержат такие модифицированные сегменты гена NS1, но для которых не является помехой то, что они являются интерферон-чувствительными, в отличие от трансфектантов, описанных в международной заявке WO 99/64571. Настоящее изобретение связано, далее, с рекомбинантными белками, полученными из NS1-модифицированных вирусов путем экспрессии в системе соответствующего хозяина, а кроме того, с вакциной, содержащей NS1-модифицированные вирусы согласно изобретению.
Еще одним аспектом данного изобретения является обеспечение способа получения рекомбинантного вируса гриппа, а также аттенуированных вакцин гриппа на основе получения стабильных клеточных линий (штаммов) (например, Vero, MDCK и т.д.), экспрессирующих искусственные гены гриппа (антисмысловая РНК), содержащие природные или полученные генноинженерным способом искусственные последовательности [вируса] гриппа (делеции или вставки). Эти клеточные линии, продуцирующие такие гены в больших количествах, могут быть использованы для инфицирования вирусом гриппа, а затем подвергнуты процедурам отбора с целью получения искомого гена, встроенного в потомство вирусов.
Авторам настоящего изобретения удалось установить систему обратной генетики на клетках Vero, позволяющих манипулировать вирулентностью штамма PR8 вируса гриппа А путем изменения длины транслируемого белка NS1. В процессе исследований, которые привели в результате к данному изобретению, изучали способность вируса гриппа А проявлять толерантность и быть устойчивым к включению длинных вставок в ген NS. В результате была получена коллекция нескольких химерных конструкций гена NS1 с помощью гетерологичных последовательностей, включая последовательности, полученные из HIV-1, кодирующие ELDKWA белков gp41 или Nef, путем включения одной или более гетерологичных последовательностей или - необязательно - нескольких повторов любой такой последовательности в рамку считывания белка NS1.
Указанные выше гетерологичные последовательности были вставлены вниз по течению в положении нуклеотида 400 (соответствующее положению аминокислоты 124) и - необязательно - предварялись последовательностью 2А сайта ауторасщепления и/или лидерной последовательностью, полученной из молекулы гемагглютинина вируса гриппа. Остальные конструкции дополнительно содержали якорную последовательность, полученную из молекулы гемагглютинина вируса гриппа, в качестве вставки непосредственно после требуемой антигенной последовательности(ей), образуя таким образом конец гетерологичной вставки как целого. В каждом случае после вставок следовал стоп-кодон для предотвращения транскрипции и трансляции оставшейся части сегмента гена NS1 (включая эффекторный домен), при этом сайт расщепления для сплайсинга NS (необходимый для транскрипции и трансляции сегмента гена NS2=NEP) сохранялся полностью функциональным.
Уцелевшие (спасенные) вирусы вызывали экспрессию и аккумуляцию чужеродных антигенов в цитозоле и/или на поверхности инфицированных клеток. Авторам настоящего изобретения удалось также успешно сохранить вирусы-трансфектанты, собирая мультирестрицированный иммунодоминантный район, обогащенный T-клеточными эпитопами белка Nef вируса ВИЧ-1 (136 аминокислот).
Все трансфектанты проявляли нормальные характеристики роста в клетках Vero, в подвергнутых эмбриогенезу куриных яйцах и в клетках MDCK, однако были аттенуированы у мышей. Химерные вирусы гриппа NS1-Nef не реплицировались в дыхательных путях инфицированных мышей, однако индуцировали выраженный Nef-специфический ответ цитотоксических лимфоцитов после однократной интраназальной иммунизации. Кроме того, после трех иммунизации наблюдали Nef-специфический антительный ответ. Перенос рекомбинантного гена NS-nef путем пересортировки из вирусного вектора PR8 (грипп A/PR/8/34; Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205) в остальные штаммы гриппа давал в результате одинаковый уровень аттенуации и иммуногенности. Обнаружение этого явления позволило авторам настоящего изобретения предпринять успешные повторные иммунизации (бустер-иммунизации) с использованием ряда аттенуированных векторов различных подтипов антигенов.
Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось показать, что такой подход, связанный с созданием набора химерных штаммов вируса гриппа, принадлежащих различным подтипам гриппа, но несущих идентичный рекомбинантный химерный ген NS1, дает возможность создания целого ряда штаммов для бустер-иммунизации. Далее, им удалось доказать, что, уцелев однажды, конструкция нового химерного гена NS1 может быть рутинно перенесена в другой штамм вируса гриппа путем генетической пересортировки.
Описание графического материала
На фиг.1 показана функциональная карта полученного генно-инженерным путем белка NS1 [вектора] PR8.
На фиг.2 показана структура рекомбинантных белков NS1 уцелевших вирусов-трансфектантов гриппа, экспрессирующих пептиды gp-41 и IL-1β.
На фиг.3 показана структура рекомбинантного белка NS1 уцелевшего трансфектанта PR82Anef (PR8/Nef), экспрессирующего аминокислоты 70-206 белка Nef штамма NL4-3 вируса ВИЧ-1.
На фиг.4 показана репликация химерных вирусов гриппа/Nef в нижних дыхательных путях мышей.
На фиг.5 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, полученных у иммунизированных мышей, на 106 клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида Nef, пептида NP или в отсутствие пептида в качестве индикатора T-клеточных ответов.
На фиг.6 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, полученных из лимфатических узлов, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей, на 106 клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида Nef, пептида NP или в отсутствие пептида в качестве индикатора T-клеточных ответов.
На фиг.7 показаны IgG-иммунные ответы Nef-специфической сыворотки после второй и третьей иммунизации мышей рекомбинантными вирусами гриппа/Nef.
На фиг.8 представлены результаты анализа снижения бляшкообразования.
На фиг.9 представлены результаты анализа индукции интерферона.
На фиг.10а-10с показана иммунофлуоресценция клеток Vero, предварительно инфицированных рекомбинантным вирусом PR8/Nef (10a, 10b) и вирусом гриппа дикого типа PR8 (10с).
На фиг.11 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в селезенке мышей.
На фиг.12 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в лимфатических узлах, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей.
На фиг.13 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в моноклональных популяциях клеток мочеполовой системы иммунизированных мышей.
На фиг.14 представлены результаты анализа ELISA, определяющего Nef-специфический IgG в сыворотках мышей через две недели после третьей иммунизации вектором PR8/NS-Nef или Aichi/NS-Nef.
Фиг.15 являет собой схематическое представление системы транскрипции вируса гриппа NS антисмысловой РНК для применения при получении рекомбинантных вирусов гриппа.
Подробное описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение связано с полученными генно-инженерным путем конструкциями гена NS вируса гриппа А, содержащими модификации последовательности, т.е. делении или вставки, между нуклеотидами в положениях 400 и 525 сегмента гена NS1 (нумерация основана на [последовательности] гена NS вируса гриппа A/PR/8/34). Неожиданно оказалось, что сохранение функциональности сегмента гена NS1 вплоть до положения нуклеотида 400 (соответствующего аминокислоте в положении 124 в белке NS1) при сопутствующей делеции остального отрезка или по меньшей мере основной его части или при вставке чужеродной нуклеотидной последовательности в этот район после положения нуклеотида 400 или смещения рамки считывания, чтобы вызвать ошибочную транскрипцию или трансляцию оставшегося отрезка NS1, приводило в результате к спасению конструкций гена NS, а следовательно, к тому, что их вирусные векторы становились интерферон-индуцирующими, но не интерферон-чувствительными.
Это неожиданное открытие было подтверждено экспериментами, когда генно-инженерные химерные вирусы гриппа согласно настоящему изобретению не только способствовали развитию сильной реакции на интерферон в клетках MDCK и в куриных яйцах, но и приобретали также способность расти на субстрате этих хозяев с эффективностью, сравнимой с таковой вируса PR8 дикого типа. И, наоборот, химерные вирусы гриппа, содержащие делеции первой трети гена NS1 или делеции полного гена NS1, отличались индукцией гамма-интерферона, а также интерферон-чувствительным фенотипом. Они не обладали способностью расти на куриных яйцах или клетках MDCK, и следовательно, их не удавалось культивировать на интерферон-дефицитных линиях клеток, таких как клетки Vero. Химерные вирусы гриппа последнего типа были описаны в международной заявке WO 99/64571. Подразумевается, что вирусы согласно данному изобретению, которые не столь аттенуированы, как вирусы, описанные в международной заявке WO 99/64571, являются более иммуногенными, а следовательно, и более подходящими для производства высокоэффективных живых вакцин против различных типов вирусных инфекций.
В другом аспекте данного изобретения использовали генно-инженерный ген NS в качестве геномного фрагмента вируса гриппа А в способе, где он переносится в любой желаемый штамм вируса гриппа А или живые вакцины гриппа путем генетической пересортировки. В данном контексте, предпочтительно, чтобы полученный генно-инженерным путем ген NS был создан в виде клона кДНК, который может быть перенесен в любой штамм вируса гриппа А или живую вакцину гриппа в виде геномного фрагмента с помощью методов обратной генетики. Например, этим способом может быть получен другой вектор, такой как Aichi/NS-Nef, принадлежащий подтипу H3N2, но содержащий тот же самый рекомбинантный NS-ген. В отличие от стратегии получения рекомбинантных вирусов гриппа, экспрессирующих чужеродные антигены в контексте молекул гемагглютинина или нейраминидазы, этот подход делает возможным быстрое получение перекрестно-нереактивных векторов для оптимальных бустер-иммунизаций.
В предпочтительном аспекте данного изобретения ген NS, полученный генно-инженерным путем, сконструирован таким образом, чтобы экспрессировались вирусные антигены, в частности, для экспрессии последовательностей Nef вируса ВИЧ-1 или гликопротеина gp-41 ELDKWA.
В другом аспекте данного изобретения ген NS, полученный генно-инженерным путем, сохраняется в виде геномного фрагмента вируса гриппа, экспрессия которого служит фактором, способствующим сверхэкспрессии и активации протеинкиназы р-68 (PKR) в инфицированных клетках или выявляющим ее.
В другом аспекте данного изобретения химерный ген NS является частью аттенуированного (адаптированного к холоду) вектора живой вакцины гриппа, где ген NS, полученный генно-инженерным путем, является основным или дополнительным аттенуирующим фактором. Это особенно ценно для производства безопасных и высокоэффективных вакцин на основе вируса гриппа, включая, но не ограничиваясь ими, анти-ВИЧ-1-вакцины, где конструкция перенесенного химерного гена NS включает в себя последовательности гена nef, 2A, и/или gp-41 или других вирусных антигенов, для индукции сильного антительного и/или B- и T-клеточного иммунного ответа.
Вакцина, включающая в себя аттенуированный (адаптированный к холоду) вектор живой вакцины гриппа, может быть получена в виде подходящей фармацевтической композиции и может быть использована для профилактических иммунизации, а также и для терапевтической вакцинации, включая индукцию высвобождения интерферона в комбинации со стимуляцией B- и T-клеточного ответов. В таких композициях векторы гриппа могут быть использованы в комбинации с любым другим вектором, экспрессирующим аналогичные антигены, с тем, чтобы обеспечить максимальный бустерный эффект. Таким образом, выработка аттенуированных векторов NS гриппа предоставляет возможность получения новых рекомбинантных вакцин приблизительно с оптимальным балансом безопасности и иммуногенности, направленной против широкого класса патогенов.
В особом аспекте данного изобретения полученный генно-инженерным путем ген NS вируса гриппа А содержит вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности, полученной из гена nef ВИЧ-1 (нуклеотиды 210-618 гена nef клона NL4-3 ВИЧ-1), плюс вставку ауторасщепляемой последовательности 2А (54 нуклеотида), расположенную ближе к N-концу полученной из ВИЧ-1 вставки в положении 400 белка NS. Элиминация первых 68 аминокислот белка Nef была произведена с целью исключения доменов, содержащих миристоилированный сайт, и других доменов, ассоциированных с патогенными свойствами мультифункционального белка Nef ВИЧ-1.
В последующих экспериментах авторы данного изобретения обнаружили, что вирус гриппа PR8/Nef и вирус гриппа Aichi/Nef вызывают образование высокого титра антител против вирусного вектора и в меньшей степени, но все еще значительного титра антител против гена nef. Вирус PR8/Nef представляет собой вирус PR8-124 с усеченным NS1, содержащим ауторасщепляемую последовательность 2А после положения 124 в белке NS1, который дополнительно содержит последовательность nef (аминокислоты 70-206 белка Nef ВИЧ-1) после ауторасщепляемого сайта. Вирус Aichi пересортирован таким образом, что, за исключением гена NS, все гены, включая гены, кодирующие белки оболочки гемагглютинин и нейраминидазу, происходят из штамма H3N2 вируса Aichi дикого типа, в то время как рекомбинантный ген NS происходит из вируса PR8/Nef. Было обнаружено также, что вирусы PR8/Nef и Aichi/Nef вызывают сильные T-клеточные ответы против гена nef, так же как и против вирусного вектора. Этот эксперимент доказал, что можно перенести химерный ген NS в другой штамм вируса гриппа и обеспечить тем самым получение по существу такого же иммунного ответа. Это открытие является очень важным, поскольку создает возможность обеспечить бустер-иммунизации и создавать сезонные вакцины гриппа с варьирующими иммуногенными подтипами, но константной активностью на основе химерного гена NS1.
В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения рекомбинантных вирусов гриппа путем конструирования вектора, содержащего модифицированный ген NS, где последовательность гена NS1 частично или полностью удалена или усечена, смешивания указанного вектора с липидами, чтобы предоставить возможность для самоассоциации комплексов липид-ДНК и переноса комплексов липид-ДНК в нужную стабильную клеточную линию, например линию клеток Vero или MDCK, и селекции клонов, в которых модифицированный ген NS стабильно интегрирован и реплицируется и которые затем инфицируют любым необходимым штаммом гриппа, и в частности, штаммом гриппа дикого типа, вызывающим эпидемию, для получения аттенуированного потомства вирусов, содержащих указанный модифицированный ген NS. В этом способе модифицированный ген NS может, кроме того, включать в себя вставки гетерологичных генных последовательностей, кодирующих, например, другие вирусные антигены или патогены, например, такие, которые описаны в настоящей заявке.
Другим объектом данного изобретения является способ быстрого производства вакцины, включающий в себя стадии трансформации стабильной клеточной линии с тем, чтобы она продуцировала необходимый искусственный вирусный ген, в частности, модифицированный ген NS вируса гриппа А, где последовательность гена NS1 частично или полностью удалена или усечена, инфицирования трансформированной клеточной линии необходимым вирусом, и в частности, штаммом гриппа дикого типа, вызывающим эпидемию, для получения аттенуированного потомства вирусов, содержащих указанный модифицированный ген NS, селекции аттенуированных рекомбинантных вирусов и размножения указанных вирусов в условиях, подходящих для эффективной репликации вирусов, предпочтительно с использованием интерферон-дефицитных субстратов, и комбинирования полученного вирусного материала с фармацевтически приемлемым носителем, в результате чего получают антивирусную вакцину. В таком способе модифицированный ген NS может, кроме того, включать в себя вставки гетерологичных генных последовательностей, кодирующих, например, другие вирусные антигены или патогены, например, такие, которые описаны в настоящей заявке.
Дальнейшие аспекты данного изобретения определены в зависимых пунктах формулы изобретения. Для того, чтобы достичь более полного понимания описанного здесь изобретения, ниже приведены следующие примеры. Эти примеры представлены с целью иллюстрации изобретения, но не с целью какого бы то ни было его ограничения.
Пример 1: Получение рекомбинантной антисмысловой нити вирусов гриппа А ("метод обратной генетики")
Плазмидные клоны, содержащие последовательность nef, были получены на основе существующего плазмидного клона гена NS гриппа pUC19/NSPR (Egorov et al., 1998, J Virol 72/8,6437-41). Последовательность nef вставляли в белок NS1 ORF, вниз по течению (от) дополнительной последовательности: узнаваемую протеиназой последовательность Р2А (NFDLLKLAGDVESNPG/P), полученную из вызывающего ящур вируса, который посттрансляционно расщеплен широко распространенной клеточной протеиназой (Mattion et al., 1996, J Ivrol 70 (11), 8124-7; Percy et al., 1994, J Virol 68 (7), 4486-92), так, чтобы молекула gp-41 была отщеплена от полипептида NS1 и транспортирована к клеточной поверхности. Плазмидный клон использовали для синтеза химерной РНК, с тем, чтобы ее перенести в клетки Vero для дальнейшего сохранения (спасения) рекомбинантных вирусов гриппа. В функциональной карте белка NS1, полученного генно-инженерным способом, согласно изобретению (Фиг.1), указано, что вставки вводятся после аминокислоты в положении аа124 и завершаются стоп-кодоном, с помощью которого достигается то, что остальной прилегающий отрезок генного сегмента NS1 (включая эффекторный домен) остается нетраслированным. Из Фиг.2 становится понятным, каким образом могут быть расположены необходимые антигенные или иные гетерологичные последовательности (например, последовательности gp-41 и IL-1β), чтобы получились иммуногенные конструкции, которые после трансфекции в подходящий вирусный вектор, предпочтительно адаптированный к холоду вирус гриппа, могли бы служить основой эффективной вакцины против различных типов инфекционных заболеваний.
Аналогично, на фиг.3 показано расположение вставки из аминокислот аа70-206 белка Nef вируса ВИЧ-1 NL4-3 в белок NS1 уцелевшего (спасенного) трансфектанта гриппа PR82Anef (PR8/Nef).
Как правило, в экспериментах выявлялась тенденция, при которой длина гетерологичной вставки или вставок была прямо пропорциональна степени аттенуации полученного вирусного штамма. Кроме того, иммуногенный потенциал продуктов экспрессии более крупных вставок обычно превосходил таковой более мелких вставок. Следовательно, согласно данному изобретению, предпочтительно создавать вставки, кодирующие по меньшей мере приблизительно около 80 аминокислот.
Для создания химерного вируса Aichi/NS-Nef РНК, представляющую рекомбинантный сегмент NS вируса PR8/NS-Nef, вводили в геном вируса A/Aichi/1/68 (H3N2) путем стандартной генетической пересортировки, предпринятой на клетках Vero с использованием поликлональной кроличьей гипериммунной антисыворотки против вируса PR8 для селекции. Генотипирование пересортировок было предпринято путем амплификации ОТ-ПЦР (полимеразно-цепьевая реакция с обратной транскрипцией) и анализа сравнительной рестрикции копий кДНК, полученных из каждого геномного сегмента.
Пример 2: Трансфекция рекомбинантных вирусов в клетках Vero
Искусственная отрицательно-смысловая РНК была получена из плазмидных клонов путем транскрипции Т3 в присутствии очищенного вирусного рибонуклеопротеина (РНП). Клетки Vero были предварительно инфицированы хелперным пересортированным штаммом вируса гриппа 25А-1 (H1N1, (Egorov et al., 1994, Vopr Virusol 39 (5), 201-5), а затем трансфицированы комплексами РНК путем DEAE-декстрановой трансфекции (Egorov et al., 1998, J. Virol 72 (8), 6437-41; Luytjes et al., 1989, Cell 59 (6), 1107-13). Уцелевшие (спасенные) вирусы-трансфектанты были подвержены бляшкообразованию, были трижды очищены на клетках Vero, амплифицированы на клетках Vero и затем были протестированы их биологические свойства.
На Фиг.10а-с показана иммунофлуоресценция клеток Vero, предварительно инфицированных рекомбинантным вирусом PR8/Nef (MOI 0,01 на 10а и 0,1 на 10b) и вирусом гриппа дикого типа PR8 (10с). Через 24 часа после инфицирования клетки были трипсинизированы и фиксированы на покровных стеклах 100% ацетоном. После нескольких этапов промывки в PBS покровные стекла инкубировали в течение 40 минут при 37°С в присутствии разбавленного 1:50 мышиного моноклонального антитела против Nef (эпитоп аа179-195), затем дважды промывали в PBS и инкубировали в присутствии разбавленного 1:100 козьего антитела против IgG мыши, конъюгированного с ФИТЦ.
Пример 3: Иммунизация мышей BALB/c
Мышей BALB/c в группе, каждая из которых состояла из трех особей, иммунизировали вирусами гриппа PR8/Nef, Aichi/Nef; PR8-124 в количестве 2-5×105 PFU (бляшкообразующие единицы)/мышь и штаммом PR8wt в количестве 4×104 PFU/мышь, как показано на фиг.5. Клетки селезенки были получены у мышей через 9 дней после иммунизации и использованы в качестве эффекторных клеток в анализе ELISPOT. На фиг.5 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, на 106 клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида EWRFDSRLAFHHVAREL (пептид Nef), пептида TYQRTRALVRTMGD (пептид NP) или в отсутствие пептида (без пептида, б/п). Результаты выражены в виде среднего значения +/-SEM для параллельных культур.
Мышей BALB/c в группах, каждая из которых состояла из трех особей, иммунизировали вирусами гриппа PR8/Nef, Aichi/Nef; PR8-124 в количестве 2-5×105 PFU/мышь, и штаммом PR8wt в количестве 2×104 PFU/мышь, как показано на фигуре 6. Простые клеточные суспензии из лимфатических узлов, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей, были получены у мышей через 9 дней после иммунизации и использованы в качестве эффекторных клеток в анализе ELISPOT (Power et al, J Immunol Methods 227: 99-107): Вкратце, трехкратные серийные разведения клеточных популяций, полученных из мышиных селезенок, дренирующих лимфатических узлов и мочеполовых путей, переносили в лунки, покрытые моноклональными антителами против интерферона-гамма (анти-IFN-γ-mAb (R4-6A2; BD PharMingen)). Клетки инкубировали в течение 22 часов при 37°С и 5% СО2 в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС), IL-2 (30 ед/мл), пенициллин, стрептомицин и 50 мкМ 2-ME, в присутствии синтетических пептидов. Биотинилированные анти-IFN-γ-mAb (XMG1.2; BD PharMingen) были использованы в качестве конъюгирующего антитела, затем планшеты инкубировали в присутствии стрептавидин-пероксидазы (0.25 ед/мл; Boehringer Mannheim Biochemica). Пятна колонии, представляющие собой секретирующие гамма-интерферон клетки CD8+, культивировали, используя субстрат 3-амино-9-этилкарбазол (Sigma), содержащий перекись водорода в 0.1 М натрий-ацетате, рН 5.0. Пятна просчитывали с помощью аналитического микроскопа, и результаты выражали в виде среднего числа секретирующих гамма-интерферон клеток +/- SEM, из трех повторов. Клетки, инкубируемые в отсутствие синтетических пептидов, давали <10 пятен/106 клеток. В связи с тем, что истощение СD8+-клеток приводило обычно к более чем 92% уменьшению образования пятен, в большинстве анализов процедуру разделения клеток опускали. На фигуре 6 показано число клеток, секретирующих интерферон гамма, на 106 клеток селезенки, регистрируемое после того, как клетки селезенки были проинкубированы в присутствии пептида EWRFDSRLAFHHVAREL (пептид Nef), пептида TYQRTRALVRTMGD peptide (пептид NP) или же в отсутствие пептида (без пептида, б/п).
Из фигуры 4, на которой показана репликация химерных вирусов гриппа/Nef в нижних дыхательных путях у мышей, становится ясно, что вирусы PR8/Nef и Aichi/Nef в этой ткани не реплицировались, а следовательно, были сильно аттенуированы, тогда как в то же самое время они были высокоиммуногенными для мышей, вызывая сильный T-клеточный и B-клеточный иммунные ответы (как показано на фигурах 5, 6 и 7). Для того, чтобы охарактеризовать специфический ответ CD8+-Т-клеток на вставку (Nef-пептида) и на вектор (NP-пептида), самок мышей BALB/c единожды или дважды иммунизировали интраназально без наркоза 106 PFU на животное вирусами дикого типа PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef; PR8/NS-124 или PR8.
По три мыши BALB/c в каждой группе иммунизировали единожды или дважды интраназально без наркоза 106 PFU на животное вирусами дикого типа PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef; PR8/NS-124 или PR8, как показано на фиг.11. Бустерную иммунизацию предпринимали на 21 день после примирования. Суспензии клеток-потомков одной клетки, полученные из селезенок мышей через 10 дней после иммунизации, оценивали методом ELISPOT на [наличие] Nef-пептид-специфических (А) или NP-пептид-специфических (В) IFN-γ-секретирующих СD8+-Т-клеток. На фиг.11 показано среднее количество антиген-специфических IFN-γ-секретирующих клеток +/- SEM по трем параллельным культурам.
Лимфатические узлы, дренирующие дыхательные пути (медиастинальные и ретробронхиальные лимфатические узлы) собирали через 10 дней после иммунизации у иммунизированных мышей BALB/c, как показано на Фиг.11. Суспензии клеток-потомков одной клетки оценивали методом ELISPOT на [наличие] Nef-пептид-специфических (А) или NP-пептид-специфических (В) IFN-γ-секретирующих СD8+-Т-клеток. На Фиг.12 показано среднее количество антиген-специфических IFN-γ-секретирующих клеток +/- SEM по трем параллельным культурам.
По три мыши BALB/c в каждой группе дважды интраназально иммунизировали без наркоза с использованием 106 PFU на мышь вирусами гриппа PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef или PR8/NS-124, как показано на Фиг.13. Бустерную иммунизацию предпринимали на 21 день после примирования. Суспензии клеток-потомков одной клетки, полученные через 10 дней после второй иммунизации из переваренного [обработанного протеиназами] мочеполового тракта (влагалище, шейка матки, рога матки и уретра) иммунизированных мышей, оценивали методом ELISPOT на [наличие] Nef-пептид-специфических (А) или NP-пептид-специфических (В) IFN-γ-секретирующих CD8+-T-клеток. На фиг.13 показано среднее количество антиген-специфических IFN-γ-секретирующих клеток +/- SEM по трем параллельным культурам.
У мышей, единожды иммунизированных либо вирусом PR8/NS-Nef, либо вирусом Aichi/NS-Nef, индуцировалось значительное количество Nef-пептид-специфических СD8+-Т-клеток в суспензиях клеток-потомков одной клетки, полученных из селезенок (139+/-4 пятен у PR8/NS-Nef-иммунизированных мышей; 137+/-39 пятен у Aichi/NS-Nef-иммунизированных мышей; Фиг.11 В) и лимфатических узлов (173+/-23 пятен у PR8/NS-Nef-иммунизированных мышей; 160+/-25 пятен у Aichi/NS-Nef-иммунизированных мышей; Фиг.12В). Никакого подобного этому Nef-пептид-специфического СD8+-T-клеточного ответа не наблюдали ни в одном из указанных компартментов мышей, иммунизированных вирусами PR8/NS-124 и PR8 дикого типа (количество пятен во всех случаях было меньше 13; Фиг 11В и 12В).
При сравнении с вектор (NP-пептид)-специфическими СD8+-T-клеточными ответами оказалось, что во всех тестируемых группах мышей обнаруживается сходное количество специфических СD8+-клеток селезенки (Фиг.11 А). В противоположность системному компартменту (селезенки), в ассоциированных со слизистой дыхательных путей лимфатических узлах были обнаружены значительные различия. Репликативно компетентный вирус PR8/NS-124 индуцировал Nef-пептид-специфические CD8+-T- клетки в достаточно большом количестве, в то время как рекомбинантные вирусы гриппа/NS-Nef и патогенный вирус PR8 дикого типа индуцировали NP-пептид-специфические СD8+-Т-клетки в меньших количествах (Фиг.12А).
На Фиг.7, на которой приведено распределение Nef-специфических иммунных ответов сывороточного IgG у мышей, иммунизированных рекомбинантными вирусами гриппа/NS-Nef, показано, что иммунные ответы B-клеток после второй и третьей иммунизации значительно сильнее в случае, когда мышей дважды иммунизировали PR8/Nef, а затем, во время третьей иммунизации - Aichi/Nef, в то время как этот ответ был менее выражен, чем в том случае, когда производили дважды иммунизацию под действием вируса PR8-124.
Далее, группу мышей внутривенно примировали вирусом PR8/NS-Nef, а через 21 день повторно иммунизировали вирусом Aichi/NS-Nef. Другую группу мышей иммунизировали теми же самыми вирусами, но в обратном порядке. Данные, приведенные на Фиг.11 и 12, указывают на то, что последовательность, в которой использовали соответствующие рекомбинантные векторы для примирования и повторной иммунизации, по-видимому, является критичной, поскольку убедительно было показано, что примирование под действием Aichi/NS-Nef (H3N2), за которым следовала повторная иммунизация под действием PR8/NS-Nef (H1N1), индуцировала значительно меньшее количество (приблизительно сравнимое с первичным ответом СD8+-Т-клеток) Nef-пептид-специфических и NP-пептид-специфических CD8+-T- клеток в селезенках и дренирующих лимфатических узлах по сравнению с иммунизацией, проводимой в обратном порядке. Сильный ответ СD8+-Т-клеток, специфичный в отношении вторичного антигена, наблюдали в обоих тестируемых компартментах после примирования мышей рекомбинантным вектором PR8/NS-Nef (H1N1), а затем вторично иммунизированных вектором Aichi/NS-Nef подтипа H3N2. В этом случае Nef- и NP-пептид-специфический иммунный ответы были приблизительно в 1.5-3 раза выше, чем иммунный ответ после однократной иммунизации (Фиг.11 и 12).
У иммунизированных мышей получали суспензии клеток-потомков одной клетки, полученных из мочеполового тракта. Прежде чем удавалось зарегистрировать значительное число Nef-пептид-специфических СD8+-Т-клеток, необходимо было произвести две иммунизации. Наиболее сильный Nef-пептид-специфический СD8+-T-клеточный ответ был выявлен в тех случаях, когда мышей интраназально примировали вирусом PR8/NS-Nef (H1N1), а затем вторично иммунизировали вирусом Aichi/NS-Nef (H3N2) (342+/-18 IFN-γ SC/106 клеток; Фиг.13В). Такой же порядок иммунизации был выявлен и для индукции наиболее сильного NP-пептид-специфического CD8+-T-клеточного ответа (Фиг.13А).
Так же, как это было описано для получения T-клеточных ответов, мышей использовали и для получения Nef-специфического сывороточного антительного ответа. Мышей интраназально примировали, используя 106 PFU/мл вируса PR8/NS-Nef (H1N1) или Aichi/NS-Nef (H3N2), а затем, три недели спустя, повторно иммунизировали тем же самым вектором. Третью иммунизацию предпринимали еще через три недели, используя при этом вектор другого подтипа. Контрольную группу три раза иммунизировали вирусом PR8 дикого типа. Реактивности образцов сыворотки (полученных через две недели после третьей иммунизации) в отношении слитого пептида GST-Nef определяли методом ELISA, что и показано на Фиг.14. Nef-специфические антитела обнаруживались только в группе мышей, которых последовательно иммунизировали векторами H1N1 и H3N2 (Фиг.14). Наиболее высокий уровень Nef-специфического IgG обнаруживался у мышей, иммунизированных дважды интраназально с использованием 106 PFU вируса PR8/NS-Nef (H1N1) и повторно иммунизированных 106 PFU вируса Aichi/NS-Nef (H3N2), по сравнению с контрольной группой, которая была иммунизирована трижды интраназально с использованием вируса PR8 дикого типа (Фиг.14).
Оба вектора вируса гриппа (PR8/NS-Nef и Aichi/NS-Nef) были полностью аттенуированы у мышей, поскольку в тканях дыхательных путей этих мышей не удавалось обнаружить вирусных титров. Такие аттенуированные фенотипы обоих рекомбинантных вирусов указывают на то, что введение дополнительных аминокислот вниз по течению от положения 125 белка NS1 может действовать на некоторую функцию белка NS1, поскольку вирус PR8/NS-124, кодирующий белок NS1 такого же размера, эффективно размножался в дыхательных путях мышей (Фиг.4). Низкая эффективность сайта 2А в отщеплении антигена Nef от N- концевой части белка NS1, особенно на поздней стадии инфекции, может быть ответственна за дополнительную аттенуацию, хотя нельзя исключить и возможности прямого эффекта взаимодействия полипептида Nef с некоторыми внутриклеточными компонентами.
Полученные данные указывают на то, что полностью аттенуированные рекомбинантные вирусы гриппа/NS-Nef способны индуцировать первичный иммунный ответ СD8+-Т-клеток, направленный против включенного полипептида Nef, в селезенках и в лимфатических узлах, дренирующих дыхательные пути мышей, интраназально иммунизированных без анестезии. В то же время, вектор(NP-пептид)-специфические СD8+-T-клеточные ответы в селезенках и в лимфатических узлах, дренирующих дыхательные пути мышей, интраназально иммунизированных вектором PR8/NS-Nef или Aichi/NS-Nef, были сравнимы с иммунными ответами индуцированными вирулентным вирусом PR8 дикого типа, хотя и наиболее сильный NP-пептид-специфический СD8+-T-клеточный ответ, зарегистрированный в дренирующих лимфатических узлах, был обнаружен у мышей, иммунизированных вирусом PR8/NS-124, эффективно реплицирующимся в легких.
Полученные результаты показывают, что возможно достичь подобного эффекта, используя векторы вируса, относящиеся к различным антигенным субклассам. Важно то, что векторы вируса гриппа способны индуцировать СD8+-T-клеточный ответ «в обход» предсуществующего иммунитета, вызванного различными подтипами вируса гриппа.
Иммуногенный потенциал аттенуированных векторов гриппа/NS-Nef может быть объяснен тем фактом, что вирусы, содержащие усеченные формы белка NS1, индуцируют высокий уровень продукции интерферонов типа 1 in vivo. Nef-экспрессирующие векторы, так же как и вирус PR8/NS-124, индуцировали, после иммунизации мышей, значительно более высокие уровни интерферонов типа 1 в сыворотке по сравнению с родительскими вирусами дикого типа (данные не представлены).
Пример 4: Метод уменьшения (снижения) бляшек
Клетки MDCK обрабатывали в течение 24 часов супернатантом клеток MDCK, инфицированных вирусом deINS (та же самая конструкция, что и описанная в международной заявке WO 99/64571, т.е. содержащая внутреннюю делецию NS1) в качестве известного мощного индуктора альфа/бета интерферона. (Фиг.8). Установленное содержание альфа/бета интерферона достигало 100 ед. после обработки рН 2 в течение ночи. Результаты, представленные на Фиг.8, даны в log бляшкообразующих единиц (PFU, отражающие различия в титрах вируса в клетках, обработанных альфа/бета интерфероном, и в необработанных клетках).
Пример 5: Индукция интерферона
Клетки MDCK инфицировали в течение 24 часов с использованием 5 MOI различных вирусов гриппа, как показано на Фиг.9. Супернатанты в течение ночи выдерживали при рН 2 и при 4°С для инактивации вирусов. рН обработанных супернатантов доводили до значения рН 7,4 с помощью 1 н NaOH. Двукратные серийные разведения этих супернатантов добавляли к монослоям MDCK на 24 часа, а затем к ним дабавляли по 50 PFU вируса везикулярного стоматита (VSV) в каждую лунку. Результаты представляют собой такое разведение супернатанта, при котором бляшкообразование VSV оказывается сниженным на 50%.
Пример 6: Способ ускоренной продукции рекомбинантных вирусов и противовирусных вакцин.
а) Выработка рекомбинантных клеточных линий, продуцирующих модифицированный ген NS:
Плазмидный вектор конструировали в соответствии со схематическим представлением на Фиг.15. Ген NS клонировали в остов вектора pS65T-Cl (Clontech), используя промотор CMV для инициации транскрипции. Включение NS в обратной ориентации (от 3'-конца по направлению к промотору CMV) приводит к транскрипции антисмысловой РНК. Терминация транскрипции обусловлена последовательностью дельта-вируса гепатита (HDV), которая включает в себя саморасщепляющийся сайт РНК. Следовательно, этот вектор содержит ген NS вируса гриппа А, где кассета множественных стоп-кодонов интродуцирована в положение нуклеотида 140, таким образом, чтобы трансляция этого гена (рамка считывания 3) приводила к образованию усеченной формы белка NS1 (включающего в себя только 38 аминокислот). Было обнаружено, что вирусы гриппа А, экспрессирующие такие короткие протеины NS1, являются в высокой степени аттенуированными у животных (Egorov et al. 1998, J Virol. 72, 8, р.473).
Последовательность HDV (85 нуклеотидов):
Последовательность PR8NS38: (906 нуклеотидов)
Этот плазмидный вектор был использован для трансфекции, чтобы трансформировать клетки Vero. Перед трансфекцией клетки высевали в подходящих колбах (матрацах) для культивирования клеток (например, 25-сантиметровых) и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не достигалось состояние 50% конфлуэнтности. Для улучшения эффективности трансфекции катионные липидные реагенты (липофектин, липофектамин-2000) могут быть проинкубированы в бессывороточной среде перед их смешиванием с ДНК-плазмидой. Соответственно, 2-6 мкл катионного липидного реагента разводили в 100 мкл бессывороточной трансфекционной среды OPTI-MEM I и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Одновременно 1-2 мкг ДНК разводили в 100 мкл OPTI-MEM I, затем смешивали с липидным раствором и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Как только образовывались ДНК-липидные комплексы, клетки дважды промывали бессывороточной трансфекционной средой для удаления остаточных протеинов. Трансфекционный коктейль разбавляли трансфекционной средой до общего объема 1 мл и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 7% CO2 от 5 до 8 часов. После этого супернатант клеточной культуры удаляли, а к клеткам добавляли нормальную питательную культуральную среду. Через 24 часа после трансфекции стабильные трансфектанты отбирали путем добавления селекционной среды, содержащей генетицина сульфат G418 (400 мкг/мл). Через три недели появлялись стабильные трансфектанты, которые субклонировали методом ограниченных разведении. Несколько субклонов тестировали с точки зрения их способности «спасения» (способности выживания в них) термочувствительного хелперного вируса (мутант 25А-1, являющийся пересортированным вирусом, в котором ген NS, ответственный за термочувствительный фенотип, берет начало из адаптированного к холоду штамма гриппа A/Leningrad/134/47/57, а остальные гены происходят из вируса PR8; Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205) при температуре 40°С. Для достижения этой цели клетки инфицировали мутантом 25А-1 и инкубировали при 40°С в течение 72 часов. Те из продуцирующих потомство вирусов клонов, которые содержали вирусы гриппа, несущие рекомбинантный ген NS, отбирали и в дальнейшем размножали в условиях, способствующих эффективному росту клеток.
b) Продуцирование рекомбинантного вируса гриппа и вакцины:
Трансформированные клетки, экспрессирующие сегмент модифицированного гена NS, содержащий усеченный ген NS1, содержащий или не содержащий вставки, инфицировали предпочтительно так, как описано здесь выше - желаемым вирусом гриппа, в частности эпидемическим вирусом дикого типа, в условиях, описанных выше, и инкубировали с целью развития вирусного потомства, где ген NS дикого типа замещен рекомбинантным модифицированным геном NS, поставляемым трансформированными хозяйскими клетками. Получаемый в результате вирус может быть клонирован методами бляшкообразования (например, методом негативных колоний под агаровым покрытием) на нормальной линии клеток Vero, и каждая вирусная колония может быть подвергнута скринингу на присутствие модифицированного рекомбинантного гена NS с помощью метода ОТ-ПЦР и/или с помощью других методов (в зависимости от того, как был модифицирован ген). Позитивные вирусные бляшки затем очищали путем дальнейших стадий очистки методом бляшкообразования. В конце концов, рекомбинантные штаммы гриппа становятся высокоаттенуированными из-за усеченного белка NS. Они являются кандидатами на вакцины и их размножают предпочтительно с использованием интерферондефицитных субстратов, таких как клетки Vero, ранние куриные эмбрионы (моложе 10-дневных) и тому подобное, для быстрого производства высокоаттенуированных живых вакцин гриппа.
Следует, однако, подчеркнуть, что способы, описанные выше в Примерах, являются всего лишь одним из путей, иллюстрирующих лежащую в основе общую концепцию получения и установления стабильных линий клеток млекопитающих, в частности, иммортализованных или стабильных клеточных линий, которые после трансформации последовательностями желаемого вирусного гена стабильно интегрируют и экспрессируют эти последовательности и, таким образом, дают возможность относительно просто и быстро сформировать и произвести пересортированные рекомбинантные вирусы любой природы.
Список сокращений
| aa | аминокислота |
| CMV | цитомегаловирус |
| CTL | цитотоксический Т-лимфоцит |
| gp | гликопротеин |
| НА | гемагглютинин |
| IFN | интерферон |
| lg | иммуноглобулин |
| IL | интерлейкин |
| i.n. | интраназально |
| mAb | моноклональное антитело |
| МНС | главный комплекс гистосовместимости |
| NA | нейраминидаза |
| nef | негативный фактор ВИЧ |
| NP | нуклеопротеин |
| NS | не-структурный |
| ORF | открытая рамка считывания |
| RNP | рибонуклеопротеин |
| SIV | вирус иммунодефицита обезьян |
| ts | термочувствительный |
| v | вирусный |
| VSV | вирус везикулярного стоматита |
| wt | дикий тип |
1. Способ получения аттенуированного рекомбинантного штамма вируса гриппа А, который имеет интерферониндуцирующий, но при этом интерфероннечувствительный природный фенотип, что подтверждается его способностью индуцировать ответ в виде продукции интерферона в клетках MDCK и оплодотворенных куриных яйцах и расти на указанных клетках MDCK и на указанных оплодотворенных куриных яйцах, где указанный способ включает в себя получение рекомбинантного сегмента гена NS вируса гриппа А, который содержит функциональный РНК-связывающий домен и модификацию его генной последовательности ниже нуклеотида в положении 400 гена NS1, рассчитанном на основе вируса гриппа A/PR/8/34, причем указанная модификация препятствует трансляции остальной части гена NS1, отличающийся тем, что указанная модификация находится между нуклеотидами в положении 400 и 525 гена NS1, рассчитанном на основе вируса гриппа A/PR/8/34, причем указанная модификация содержит вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген или патоген, для индукции B-клеточного и/или T-клеточного иммунного ответа против указанного антигена или патогена.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вставка кодирует последовательность по меньшей мере из 80 аминокислот.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что модификация содержит вставку по меньшей мере одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ауторасщепляемого сайта 2А, гена nef из ВИЧ-1 или его части, последовательностей, кодирующих эпитопы ELDKWA или ELDKWAS gp41 ВИЧ-1, последовательности, кодирующей IL-1β или его часть, лидерной последовательности и якорной последовательности.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя следующие стадии: трансформацию клетки млекопитающего ДНК-вектором, содержащим указанный модифицированный сегмент гена NS вируса гриппа А, отбор трансформированных клеток, которые экспрессируют сегмент вирусного гена, инфицирование отобранных клеток соответствующим (желаемым) вирусом гриппа, предпочтительно эпидемичным штаммом дикого типа, инкубирование инфицированных клеток, чтобы образовалось потомство вирусов, содержащих указанный сегмент вирусного гена, и селекцию и сбор потомства вирусов, содержащих указанный сегмент вирусного гена, при этом трансформация клетки млекопитающего, включающая в себя смешивание указанного ДНК-вектора с липидами, завершена, с тем, чтобы произошла самоассоциация липида и ДНК с образованием ДНК-липидных комплексов, и инкубацию клеток млекопитающего в присутствии указанных ДНК-липидных комплексов, приводящую в результате к поглощению ДНК-липидных комплексов клеткой, а предпочтительно клеточным ядром,
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что ДНК-вектор представляет собой транскрипционную систему для антисмысловой РНК гриппа.
6. Генно-инженерный штамм вируса гриппа А, получаемый способом по п.1, который содержит ген NS, содержащий функциональный РНК-связывающий домен и модификацию генной последовательности ниже нуклеотида в положении 400 гена NS1, рассчитанном на основе вируса гриппа A/PR/8/34, где указанная модификация препятствует трансляции остальной части гена NS1, отличающийся тем, что указанная модификация находится между нуклеотидами в положении 400 и 525 гена NS1, рассчитанном на основе вируса гриппа A/PR/8/34, и придает вирусу интерферониндуцирующий, но при этом интерфероннечувствительный природный фенотип, что подтверждается его способностью индуцировать ответ в виде продукции интерферона в клетках MDCK и оплодотворенных куриных яйцах и расти на указанных клетках MDCK и на указанных оплодотворенных куриных яйцах, и где указанная модификация включает в себя вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген или патоген, для индукции B-клеточного и/или T-клеточного иммунного ответа против указанного антигена или патогена.
7. Генно-инженерный штамм вируса гриппа А по п.6, отличающийся тем, что гетерологичная вставка кодирует последовательность по меньшей мере из 80 аминокислот.
8. Генно-инженерный штамм вируса гриппа А по п.6 или 7, отличающийся тем, что длина гетерологичной вставки прямо пропорциональна степени аттенуации результирующего вирусного штамма.
9. Генно-инженерный штамм вируса гриппа А по пп.6-8, отличающийся тем, что модификация включает в себя вставку по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ауторасщепляемого сайта 2А, гена nef из ВИЧ-1 или его части, последовательностей, кодирующих эпитопы ELDKWA или ELDKWAS gp41 ВИЧ-1, последовательности, кодирующей IL-1β или его часть, лидерной последовательности и якорной последовательности.
10. Вакцина, содержащая по меньшей мере один полученный генно-инженерным путем штамм вируса гриппа А, определяемый в любом из пп.6-9, в виде соответствующей фармацевтической композиции для профилактического или терапевтического применения против вирусной инфекции.
11. Вакцина по п.10, отличающаяся тем, что вирусный штамм является живым, аттенуированным, предпочтительно адаптированным к холоду.
12. Вакцина по п.10 или 11, отличающаяся тем, что ее используют для индукции сильного иммунного ответа, предпочтительно ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), против антигена или патогена, кодируемого гетерологичной вставкой указанного штамма вируса гриппа А, полученного генно-инженерным путем.
13. Вакцина по любому из пп.10-12, отличающаяся тем, что ее используют для профилактического или терапевтического применения против гриппа или ВИЧ-1-инфекции.
14. Рекомбинантный сегмент гена NS вируса гриппа А для индукции B-клеточного и/или T-клеточного иммунного ответа против антигена или патогена, отличающийся тем, что он содержит функциональный РНК-связывающий домен и модификацию генной последовательности между нуклеотидами в положении 400 и 525 гена NS1, рассчитанном на основе вируса гриппа A/PR/8/34, причем указанная модификация содержит вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген или патоген, где вставка препятствует трансляции остальной части гена NS1 и придает вирусу гриппа свойство индуцировать интерферон, но при этом делает его интерфероннечувствительным по природе, что подтверждается его способностью индуцировать ответ в виде продукции интерферона в клетках MDCK и оплодотворенных куриных яйцах и расти на указанных клетках MDCK и на указанных оплодотворенных куриных яйцах.
15. Рекомбинантный сегмент гена NS по п.14, отличающийся тем, что модификация содержит вставку, кодирующую последовательность по меньшей мере из 80 аминокислот.
16. Рекомбинантный сегмент гена NS по п.14 или 15, отличающийся тем, что модификация содержит вставку по меньшей мере одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ауторасщепляемого сайта 2А, гена nef из ВИЧ-1 или его части, последовательностей, кодирующих эпитопы ELDKWA или ELDKWAS gp41 ВИЧ-1, последовательности, кодирующей IL-1β или его часть, лидерной последовательности и якорной последовательности.
17. Рекомбинантный сегмент гена NS по любому из пп.14-16, отличающийся тем, что его используют для получения рекомбинантного вируса гриппа, который имеет интерферониндуцирующий, но при этом интерфероннечувствительный и предпочтительно аттенуированный фенотип.
