Питательная среда для выделения микобактерий
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза. Питательная среда для выделения микобактерий содержит калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку лошадиную инактивированную, краситель малахитовый зеленый и воду дистиллированную. Введение α-аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель - малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерий. Изобретение обеспечивает повышение ростовых свойств питательной среды, ускоряет рост микобактерий, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза.
В последнее время наблюдается рост показателей заболеваемости туберкулезом. В этой связи значительное внимание уделяется лабораторной диагностике туберкулеза.
В настоящее время для выделения (культивирования) микобактерий и определения их чувствительности к лекарственным препаратам используется ряд плотных яичных питательных сред Левенштейна-Иенсена, Финн II [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., стр.266-270], среда Мордовского [Методические указания МЗ РСФСР "Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза", М. - 1972].
Недостатком плотных питательных сред являются длительные сроки роста микобактерий при посеве диагностического материала - 2,5-10 недель, а при пересевах культур и определении лекарственной чувствительности - 12-21 день, что затрудняет раннюю бактериологическую диагностику и своевременную коррекцию лечения.
Применение жидких питательных сред позволяет ускорить выявление микобактерий, что важно для раннего начала лечения больных туберкулезом. Известно использование для этих целей жидких сред, содержащих комплекс солей и L-аспарагин в качестве источника азотистого питания: Соттона (Sauton) [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.156], Школьниковой [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации". М., стр.270-271]. Недостатком этих сред является высокая степень проростов посторонней микрофлоры и использование дорогостоящих ингредиентов.
Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению является среда для выделения микобактерий туберкулеза Lebek [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.163], содержащая аспарагин, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, железо лимоннокислое аммиачное, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, глицерин, дистиллированную воду, краситель бромтимоловый синий, агар-агар и говяжью сыворотку крови. Однако эта среда используется в основном для дифференцировки атипичных микобактерий. Входящий в состав питательной среды бромтимоловый синий оказывает тормозящее действие на рост микобактерий туберкулеза, а под влиянием аспарагина возникает конгломеративный рост колоний микобактерий, что осложняет учет результатов исследований.
В основу изобретения поставлена задача повышения ростовых свойств питательной среды.
Поставленная задача решается тем, что в среду, содержащую калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, фактор роста, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду, дополнительно вводят в качестве ростового фактора натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты используют α-аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, а основным питательным веществом является инактивированная лошадиная сыворотка. Введение α-аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерии.
Состав питательной среды при следующих соотношениях, г/л:
| калий фосфорнокислый однозамещенный | 2,0-3,0 |
| натрий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0-2,0 |
| магний сернокислый | 0,25-0,75 |
| натрий лимоннокислый | 1,0-2,0 |
| железо лимоннокислое аммиачное | 0,03-0,07 |
| агар-агар | 2,0-4,0 |
| сыворотка лошадиная инактивированная | 150,0-250,0 |
| малахитовый зеленый | 0,04-0,06 |
| глицерин | 20,0-40,0 |
| α-аминоуксусная кислота | 0,5-1,5 |
| натрий пировинограднокислый | 0,1-0,2 |
| вода дистиллированная | до 1 л |
Среду получают следующим образом.
Пример 1.
1. В 20 мл горячего глицерина растворяют 0,04 г малахитового зеленого.
2. 150 мл лошадиной сыворотки инактивируют при 56°С 40 мин и соединяют с раствором малахитового зеленого.
3. Готовят солевой раствор, для чего в 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 2,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,25 г магния сернокислого, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,03 г железа лимоннокислого аммиачного, 0,5 г α-аминоуксусной кислоты, 0,1 г натрия пировинограднокислого.
Полученный раствор стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 1 мин и после охлаждения соединяют со смесью 2.
4,2 г агар-агара растворяют в оставшемся количестве дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм 30 мин, соединяют со смесью 3, тщательно перемешивают.
Контроль качества среды осуществляют при посеве тест-штаммов Mycobacterium tuberculosis H37Rv, B-5 и свежевыделенных культур от больных туберкулезом легких. Учет результатов проводят визуально по помутнению среды через 2-8 суток инкубации посевов при температуре 37°С.После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что для приготовления смеси 1 используют 30 мл глицерина и 0,05 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 200 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 2,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 г магния сернокислого, 1,5 г натрия лимоннокислого, 0,05 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,0 г α-аминоуксусной кислоты, 0,15 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 3 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примеру 1.
Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что для приготовления смеси 1 используют 40 мл глицерина и 0,06 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 250 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 3,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 2,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,75 г магния сернокислого, 2,0 г натрия лимоннокислого, 0,07 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,5 г α-аминоуксусной кислоты, 0,2 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 4 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примерам 1, 2.
После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.
Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.
Из таблицы видно, что сроки роста микобактерий туберкулеза на предлагаемой питательной среде сократились по сравнению с прототипом у лабораторного штамма H37Rv в 1,3-1,6 раза, у штаммов, выделенных от больных, в 1,3-1,7 раза и составили в среднем 6 суток. Выявляемость микобактерий туберкулеза из мокроты больных увеличилась при отрицательных результатах бактериоскопии с 27 до 33%, при положительной бактериоскопии с 66 до 78%, при сокращении сроков роста по сравнению с прототипом на 205 суток.
Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает рост микобактерий туберкулеза, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки.
| Таблица Характеристика ростовых свойств питательной среды на основании проведенных исследований (1500 пробирочных опытов) | ||||||||
| Исследуемый материал | Рост микроорганизмов на питательных средах | |||||||
| Прототип | Предлагаемая среда по составу | |||||||
| Минимальный | Средний | Максимальный | ||||||
| Сроки роста (сутки) | Количество колоний, % | Сроки роста (сутки) | Количество колоний, % | Сроки роста (сутки) | Количество колоний, % | Сроки роста (сутки) | Количество колоний, % | |
| Лабораторный штамм H37Rv | 8 | 98 | 6 | 98 | 6 | 100 | 5 | 100 |
| Штаммы, выделенные от больных | 10 | 95 | 8 | 98 | 7 | 98 | 6 | 100 |
| Мокрота больных при положительной бактериоскопии | 16 | 66 | 14 | 73 | 14 | 78 | 14 | 78 |
| Мокрота больных при отрицательной бактериоскопии | 21 | 27 | 16 | 29 | 16 | 32 | 16 | 33 |
| Проросты при иследовании мокроты | 6 | 32 | 7 | 4 | 8 | 2 | 8 | 2 |
Питательная среда для выделения микобактерий, содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты - α-аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, в качестве сыворотки - сыворотку лошадиную инактивированную при следующем соотношении компонентов, г/л:
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 2,0-3,0 |
| Натрий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0-2,0 |
| Магний сернокислый | 0,25-0,75 |
| Натрий лимоннокислый | 1,0-2,0 |
| Железо лимоннокислое аммиачное | 0,03-0,07 |
| α-аминоуксусная кислота | 0,5-1,5 |
| Натрий пировинограднокислый | 0,1-0,2 |
| Агар-агар | 2,0-4,0 |
| Сыворотка лошадиная инактивированная | 150,0-250,0 |
| Малахитовый зеленый | 0,04-0,06 |
| Глицерин | 20,0-40,0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
