Способ определения гемоглобина в биологических жидкостях

Изобретение относится к области медицине, а именно к лабораторным методам определения гемоглобина. Способ осуществляют путем введения в контрольную и опытную кюветы смеси концентрированных уксусной и азотной кислот при соотношении кислот в смеси 1:1 по объему, добавления пробы биологической жидкости, в качестве которой исследуют пробу цельной крови или ее сухого образца, мочи или слюны, затем введения раствора яичного альбумина и перекиси водорода в опытную кювету, добавления раствора хлорпромазина в концентрации 2,5 мг на 100 мл раствора в обе кюветы. Далее регистрируют прирост оптической плотности раствора в опытной кювете против плотности в контрольной кювете на длине волны в диапазоне 530-550 нм. Использование способа позволяет повысить чувствительность и точность определения гемоглобина в биологических жидкостях, снижение расхода применяемых реактивов и степени токсичности определения за счет использования микроколичеств химически агрессивных реагентов. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к клинической медицине, медицине катастроф, акушерству и гинекологии, пренатальной медицине, нормальной и патофизиологии, ветеринарии.

Известен способ определения концентрации гемоглобина в пробах крови гемихромным методом [патент RU №02159442, G01N 33/72, 33/52, опубл. 20.11.2000. Бюл. №32; патент РФ №1386901, G01N 33/48, опубл. 15.01.90. Бюл. №2; патент РФ №2054173, кл G01N 33/48, опубл. 10.02.96. Бюл. №4; US 95 524128. 31.08.95, G01N 33/52; US 94275466. 14.07.94, G01N 33/72] путем добавления к 20 мкл крови 5 мл трансформирующего раствора и перевода нормального гемоглобина в гемихромную форму. Оптическую плотность раствора измеряют при λ=540 нм на поверенном, калиброванном приборе (фотоэлектроколориметре) в кювете толщиной 10 мм, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной.

К недостаткам данного способа следует отнести невысокую чувствительность и, как следствие сказанному, невозможность осуществления анализа в образцах крови незначительного объема, а также в образцах сухой крови, что, как показал опыт, требуется для оперативной постановки своевременных диагнозов в условиях дефицита времени, свойственных медицине и ветеринарии чрезвычайных ситуаций, физиологии спорта и идентификации пятен крови при проведении криминалистических экспертиз. Кроме того, определение гемоглобина гемихромным методом из-за низкой чувствительности ограничено в условиях анализа крови в других биологических жидкостях (моче, слюне), что также ограничивает использование данного метода в медицине чрезвычайных ситуаций.

Также известен способ определения концентрации гемоглобина в пробах крови [патент RU №2145715, G01N 33/72, G01N 33/49] путем измерения спектров поглощения растворов крови. Из пробы крови пациента получают взвесь эритроцитов, которую помещают в кювету спектрофотометра, и определяют оптическую плотность взвеси эритроцитов (D) при трех длинах волн: 635 нм; 805 нм; 1025 нм, для способа [патент RU №2140083, G01N 033/52 G01N 033/72] процедуру проводят на спектрофотометре при шести аналитических длинах волн в диапазоне 450-650 нм. Далее определяют фактор эффективности рассеяния (р) и коэффициент рассеяния К(р), а концентрацию гемоглобина в крови рассчитывают по формуле: Нв=128·D₈₀₅·p/К(р), где Нв - концентрация гемоглобина в крови; D₈₀₅ - оптическая плотность взвеси при 805 нм; р - фактор эффективности рассеяния; К(р) - коэффициент рассеяния. Кроме того, для способа [патент RU №2140083, G01N 033/52 G01N 033/72] по измеренным оптическим плотностям судят о концентрации основных производных гемоглобина.

К недостаткам данного способа следует отнести техническую сложность исполнения процедуры, связанную измерением взвести эритроцитов при трех и при шести длинах волн, что увеличивает общее время проведения одного анализа. Также к существенному недостатку следует отнести снятие со спектрофотометра двух измерительных показателей светорассеяния, что, с одной стороны, увеличивает расчетные операции, приводящие к возрастанию погрешностей измерения концентрации гемоглобина, с другой стороны, увеличивает временные траты. Кроме того, максимум поглощения раствора гемоглобина находится при длине волны 540 нм, что для способа [патент RU №2140083, G01N 033/52 G01N 033/72] не выполняется. Последнее снижает чувствительность предлагаемого метода, что ограничивает его использование в медицине катастроф, спортивной физиологии, ветеринарии.

Также известен способ определения концентрации гемоглобина в пробах крови [патент US №2062465, G01N 033/48] путем помещения пробы цельной крови в капиллярную трубку с пластмассовым поплавком. Концентрация гемоглобина в уплотненных после центрифугирования красных клетках крови измеряется путем определения глубины, на которую поплавок погружается в слой красных клеток, и затем рассчитывается его концентрация в крови. Концентрация гемоглобина в цельной крови рассчитывается путем умножения средней корпускулярной концентрации гемоглобина в уплотненных красных клетках крови на объемный процент уплотненных клеток (гематокрит) в цельной крови.

К недостаткам данного способа следует отнести высокую погрешность в измерении концентрации гемоглобина предлагаемого способа. Так как процент уплотненных клеток (гематокрит) в цельной крови зависит также от функционального состояния пациента (болен или здоров, после сна или бодрствование, возбужденное или подавленное эмоциональное состояние, беременность и т.п.), а не только от содержания гемоглобина в эритроцитах, то можно предположить невысокую точность определения концентрации гемоглобина в пробах крови. Кроме того, предлагаемый способ зависит от объема анализируемой крови и разведения крови, что также снижает точность измерительных процедур.

Наиболее близким к заявленному способу является способ определения гемоглобина в пробах крови и мочи с помощью чувствительной реакции на хлорпромазин [Chalmers A.H., Lesley E.S. Оценка гемоглобина в плазме и моче спектрофотометрическим методом /статья/. Clinical Chemistry, Vol.39, No.8, 1993, p.1679-1682] путем добавления в контрольную и опытную кюветы следующих реактивов: 1. Кислотная смесь (КС): концентрированная уксусная кислота - 28 мл; концентрированная фосфорная кислота - 4 мл.; 2. Раствор яичного альбумина (ЯА): ЯА - 200 мг; вода дистиллированная - 10 мл (срок хранения: 6 часов при t=4°С); 3. Раствор хлорпромазина: хлорпромазин - 250 мг; вода дистиллированная - 25 мл (срок хранения: 8 суток при t=4°С); 4. Перекись водорода: перекись водорода (30%) - 1 мл; дистиллированная вода - 9 мл (срок хранения: 6 часов при t=4°С). Далее, в опытную кювету спектрофотометра добавляют неразведенную плазму или мочу в объеме 20 мкл и фотометрируют при длине волны 528 нм и определяют прирост оптической плотности против контрольной пробы. При этом для каждого определения проводят три параллельных замера оптической плотности с последующим нахождением средней величины.

К недостаткам данного способа следует отнести:

1) длительность исполнения процедуры (10-15 минут на один анализ);

2) техническую сложность в исполнении, заключающуюся в подготовке, для повышения точности измерений, трех параллельных проб суспензии эритроцитов, что приводит к длительности проведения одного анализа и снижает точность самого определения концентрации гемоглобина;

3) токсичность применяемых реактивов (хлорпромазина, концентрированных кислот);

4) низкую сохранность качества применяемых реактивов (не более одной недели со дня их приготовления);

5) невысокую чувствительность к следовому присутствию гемоглобина в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна).

Основными задачами изобретения являются: повышение специфичности и чувствительности способа определения концентрации гемоглобина (Hb), упрощение технической процедуры исполнения, снижение расхода реактивов и степени токсичности применяемых реактивов.

Это достигается за счет того, что в способе определения гемоглобина в биологических жидкостях путем фотометрирования их проб, предусматривающем введение в контрольную и опытную кюветы смеси двух концентрированных кислот, одна из которых уксусная, добавление раствора яичного альбумина, введение пробы биологической жидкости в опытную кювету и раствора хлорпромазина в обе кюветы, добавление раствора перекиси водорода и регистрацию прироста оптической плотности раствора в опытной кювете против плотности в контрольной кювете, предлагается в качестве второй концентрированной кислоты использовать азотную кислоту при соотношении кислот в смеси 1:1 по объему, раствор яичного альбумина и раствор перекиси водорода добавлять только в опытную кювету, раствор хлорпромазина вводить в концентрации 2,5 мг на 100 мл дистиллированной воды и регистрировать оптическую плотность на длине волны в диапазоне 530-550 нм.

В качестве биологической жидкости вводят пробу цельной крови или ее сухого образца или слюны в объеме от 5 мкл до следовых количеств, при этом пробу цельной крови предварительно разводят в 2000 раз.

Используют фотометрические кюветы толщиной 2,5 мм с вкладышами из стекла или оргстекла для уменьшения их объема.

Для фотометрирования используют фотоэлектроколориметр.

А также выявляют линейную зависимость между концентрацией гемоглобина и приростом оптической плотности раствора в опытной кювете для разных концентраций и вычисляют уравнение регрессии для расчета концентрации гемоглобина в растворе:

Hb(мг/л)=-9,84+(2409,94×ΔD),

где ΔD - разность оптической плотности между опытной пробой и контролем.

Разработка предлагаемого способа направлена на минимизацию вводимых реактивов, позволяющую повысить точность и экспрессность определений.

Уменьшение концентрации раствора хлорпромазина с 250 мг на 25 мл дистиллята до 2,5 мг на 100 мл дистиллированной воды значительно снижает расход реактивов и, в отличие от прототипа, не требует проведения трех параллельных замеров, тем самым существенно упрощая процедуру измерения и повышая точность определения концентрации гемоглобина.

Смесь концентрированных кислот в указанных объемах создают с опытной минипробой стабильный буферный раствор с более длительным поддержанием величины рН фотометрируемой жидкости на физиологическом уровне, по сравнению с прототипом.

Для анализа применялась длина волны в диапазоне 530-550 нм, что повышает точность определения содержания гемоглобина в пробах крови, так как максимальное поглощение раствора гемоглобина находится именно в этом диапазоне [Козинец Г.И., Арустамян А.Ю., Ашуров Г.Д. Исследования системы крови в клинической практике. - М.: Триада X, 1997. - 480 с.].

В опытную кювету добавляли стандартный раствор Hb с раствором яичного альбумина с целью предотвращения слипания стандартного раствора Hb со стенками пробирки и кюветы.

В контрольную кювету вместо раствора яичного альбумина добавляли дистиллированную воду (как более дешевый и доступный материал).

Объем разбавленной цельной крови и других биологических жидкостей необходим в количестве 5 мкл и ниже (вплоть до следов присутствия и сухих проб), что может найти применение в криминалистике.

Использование фотоэлектроколориметра позволяет достичь ряд преимуществ: его небольшие размеры делают его более транспортабельным, что необходимо в ряде случаев, он не требует квалифицированного персонала при эксплуатации, он менее дорогостоящий по сравнению со стационарным спектрофотометром, используемым в прототипе.

Способ определения гемоглобина выглядит следующим образом: в контрольную и опытную фотометрические кюветы толщиной 2,5 мм с вкладышами из оргстекла вносят по 0,8 мл кислотной смеси (смесь равных объемов концентрированных уксусной и азотной кислот). В опытную кювету вводят раствор яичного альбумина в дистиллированной воде в объеме 10 мкл и 5 мкл биологической жидкости (цельная кровь, разведенная в 2000 раз, или ее сухой образец, моча, слюна) и 0,25 мл раствора хлорпромазина (с концентрацией 0,0025%), который в таком же объеме вводят и в контрольную кювету. Далее в опытную кювету с целью запуска реакции хлорпромазина с гемсодержащими соединениями добавляют 0,5 мл перекиси водорода трехпроцентной и строго через 2-3 мин регистрируют прирост оптической плотности раствора при длине волны 530-550 нм против контрольной пробы.

Между концентрацией гемоглобина (Hb) и приростом оптической плотности в растворе выявляется линейная зависимость, что позволило вычислить уравнение регрессии для расчета концентрации Hb в растворе:

где ΔD - разность оптической плотности между опытной пробой и контролем.

Для перевода концентрации гемоглобина из мг/л в применяемые в медицине г/л и с учетом разведения предлагается формула пересчета:

Для рутинных фотометрических определений применялся фотоэлектроколориметр КФК-3. Для выведения уравнения регрессии использовался стандартный раствор Hb разной концентрации. На основании этих данных был построен калибровочный график для цельной крови (Фиг.1) и калибровочный график для мочи и слюны (Фиг.2), при этом был получен высокий коэффициент корреляции (r), равный 0,984, что позволило считать предлагаемую модификацию валидной. Из-за высокой чувствительности хлорпромазинового метода по калибровочному графику Hb измеряется в мг/л в разведенной крови. Соответственно по этому графику или по формулам (1) и (2) определяют концентрацию Hb.

Таким образом, предлагаемый способ, основанный на использовании хлорпромазинового мини-метода, обладает:

1) специфичностью и высокой чувствительностью, то есть реагирует исключительно на гемсодержащие (гемоглобин) соединения и способен определить количественное содержание гемоглобина в микроскопических дозах (следах);

2) экспрессностью (с 10-15 минут до 2-3 минут на один анализ);

3) технической простотой в исполнении;

4) экономичным расходом реактивов;

5) сниженной степенью токсичности реактивов путем приготовления более разбавленного раствора хлорпромазина;

6) более длительным хранением разбавленного раствора хлорпромазина (с одной недели до нескольких месяцев);

7) высокой чувствительностью и точностью к следовому присутствию гемоглобина в биологических жидкостях (сухая кровь, моча, слюна).

Пример 1. Точность хлорпромазинового микро-метода контролировали путем воспроизводимых параллельных анализов образцов крови 34-х лиц, находящихся на лечении в ожоговом центре г.Кемерово и профилактории КемГУ гемиглобинцианидным, модифицированным хлорпромазиновым методами и расчетным методом анализатора. Статистические показатели вариации результатов приведены в таблице 1. Видно, что наиболее точно и с меньшим вариационным разбросом отражает содержание гемоглобина в разных обследуемых группах хлорпромазиновый метод. Увеличенный уровень Hb у ожоговых больных можно объяснить повышением вязкости крови во время ожога, на что организм отвечает повышением количества Hb в крови.

Пример 2. Приведенный в таблице 1 пример 2 осуществляют аналогично примеру 1, только в качестве обследуемых групп были взяты 10 сизых голубей г.Кемерово и 7 голубей г.Мариинска. Видно, что концентрация гемоглобина у голубей выше, чем у людей. Это можно объяснить наличием ядер в эритроцитах голубей, что сильно повлияло на оптическую плотность раствора. Высокая концентрация Hb у голубей г.Кемерово объясняется неблагоприятными с позиции экологии условиями их обитания.

Пример 3. Чувствительность хлорпромазинового метода тестировали, используя рекомендации В.В.Меньшикова (Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. - М., 1987), путем нахождения такой концентрации исследуемого вещества (в данном случае гемоглобина), которая соответствовала бы наименьшему результату измерения, еще отличному от значения холостой пробы (см. фиг.2). Для этого, в пяти параллельных определениях измеряем оптическую плотность холостой пробы, чему соответствует определенная усредненная концентрация гемоглобина. Далее, усредненное значение концентрации гемоглобина, согласно В.В.Меньшикову, подставляем в формулу: х+3S, где х - среднее значение холостой пробы, S - среднеквадратичное отклонение, получаем значение, которое должно примерно соответствовать минимальному значению Hb в моче и слюне (см. фиг.2), так как в гемолизате цельной крови заведомо более высокий уровень гемоглобина. Действительно, в таблице 2 находим, что минимальное значение концентрации Hb (в г/л) второй пробы укладывается в значение холостой пробы, что свидетельствует о высокой чувствительности метода к следовому присутствию вещества. Таким образом, чувствительность метода составляет 0,5 г/л, тогда как чувствительность гемихромного метода 25 г/л.

Пример 4. На тех же образцах цельной крови, количественные характеристики которых приведены в таблице 1, тестировали чувствительность хлорпромазинового метода (таблица 2). Те же самые образцы цельной крови разводили в 100 раз и получали концентрации гемоглобина соответственно в 100 раз меньше, чем приводятся в таблице 1 и отражены в скобках в таблице 2. Во всех образцах цельной крови хлорпромазиновый метод давал незначительно завышенные результаты, тогда как унифицированный гемиглобинцианидный метод давал во всех случаях отрицательную реакцию (не наблюдалось окрашивание раствора), то есть не обнаруживал присутствия следов гемоглобина в исследуемых образцах. Исходя из полученных результатов, можно констатировать высокую чувствительность хлорпромазинового метода.

Таблица 1.
Сравнение результатов определения гемоглобина (М±m) тремя независимыми методами
Примеры	Обследуемые группы (n)	Методы определения гемоглобина, г/л
Расчетный метод	Гемиглобинцианидный	Хлорпромазиновый
1	Здоровые люди, n=14	138±8	127±16	141±6
Ожоговые больные, n=20	134±7	141±10	156±4
2	Голуби, n=10 (г.Кемерово)	132±7	157±9	176±5
Голуби, n=7 (г.Мариинск)	130±9	156±9	172±6
Таблица 2.
Тестирование чувствительности хлорпромазинового метода (М±m)
Название пробы	Оптическая плотность (D, %)	Концентрация Hb в мг/л	Концентрация Hb в г/л
Холостая проба	9±0,15	0,89±0,06	0,56±0,02
Проба, соответствующая минимальному значению оптической плотности измерения Hb в моче и слюне (см. фиг.2)	14±0,2	1,09±0,02	0,57±0,01
Здоровые люди, n=14	-	2,42±0,07 (1,41±0,06)	1,271±0,07 (1,686±0,06)
Ожоговые больные, n=20	-	3,12±0,05 (2,971±0,04)	1,638±0,05 (1,56±0,04)
Голуби, n=10 (г.Кемерово)	-	3,67±0,06 (3,352±0,05)	1,923±0,06 (1,76±0,05)
Голуби, n=7 (г.Мариинск)	-	3,42±0,07 (3,276±0,06)	1,80±0,07 (1,72±0,06)

1. Способ определения гемоглобина в биологических жидкостях путем фотометрирования их проб, предусматривающий введение в контрольную и опытную кюветы смеси двух концентрированных кислот, одна из которых уксусная, добавление раствора яичного альбумина, введение пробы биологической жидкости в опытную кювету и раствора хлорпромазина в обе кюветы, добавление раствора перекиси водорода, и регистрацию прироста оптической плотности раствора в опытной кювете против плотности в контрольной кювете, отличающийся тем, что в качестве второй концентрированной кислоты используют азотную кислоту при соотношении кислот в смеси 1:1 по объему, раствор яичного альбумина и раствор перекиси водорода добавляют только в опытную кювету, раствор хлорпромазина вводят в концентрации 2,5 мг на 100 мл дистиллированной воды и регистрируют оптическую плотность на длине волны в диапазоне 530-550 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости вводят пробу цельной крови или ее сухого образца, мочи или слюны в объеме от 5 мкл до следовых количеств, при этом пробу цельной крови предварительно разбавляют в 2000 раз.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для размещения пробы биологической жидкости используют фотометрические кюветы толщиной 2,5 мм с вкладышами из стекла или оргстекла.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения оптической плотности используют фотоэлектроколориметр.

5. Способ по одному из п.1 или 7, отличающийся тем, что выявляют линейную зависимость между концентрацией гемоглобина и приростом оптической плотности раствора в опытной кювете для разных концентраций и вычисляют уравнение регрессии для расчета концентрации гемоглобина в растворе

Hb(мг/л)=-9,84+(2409,94·ΔD),

где ΔD - разность оптической плотности между опытной пробой и контролем.