Межвидовая линия гибридных клеток почки овцы (ovis aries) с лимфоцитами кролика (по-tk-×лк) для культивирования вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота
Владельцы патента RU 2306334:
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии. Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК-×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК- методом многошаговой селекции. Штамм обладает высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи. Изобретение может быть использовано в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов - диагностических исследований и в биотехнологии при производстве вакцин и диагностикумов. 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.
Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины и ветеринарии. Гибридные линии клеток используются при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяев.
Известен штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы (OVIS ARIES) со спленоцитами овцы (ПО-ТК-×СО) для культивирования вирусов и агента скрепи.
Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм представлен преимущественно клетками эпителиоподобного типа. Наряду с этим до 10-20% клеточной популяции составляют клетки лимфоидного типа, округлой формы, лежащие группами, с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы. Пик митотической активности - 32-35%0, наблюдается через 72 часа культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,2. Интервал изменчивости хромосом составил от 13 до 72 хромосом, модальный класс представлен 48 хромосомами.
Культуральные свойства: межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл.
Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до - 30°С, а далее до - 70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры - 70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %:
ДМSO - 10
Сыворотка эмбрионов - 40-30
Среда Игла MEM - до 100
Гибридный штамм ПО ТК-×СО чувствителен к вирусу ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпес-вирусу крупного рогатого скота (1).
В задачу исследований входило - получить гибридный штамм лимфоцитов кролика, обладающий высокой чувствительностью к патогенным вирусам крупного рогатого скота.
Предложенный штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК-×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК- методом многошаговой селекции.
Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика назван ПО-ТК-×ЛК депонирован 20 мая 2004 г. в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №62.
Предложенный штамм обладает следующими свойствами:
Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм состоит из 2 популяций клеток: эпителиоподобных, напоминающих клетки исходной мутантной культуры, и лимфоцитоподобных, округлых с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы, характерных для лимфоцитов. Полученная культура обладает высокой митотической активностью - 50-54%0, наблюдающейся на вторые сутки культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,0. Число хромосом в метафазных пластинках составило от 88 до 120.
Культуральные свойства: клетки активно растут и размножаются на синтетических питательных средах с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл.
Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до -30°С, а далее до -70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры -70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %:
ДМSO - 10
Сыворотка эмбрионов - 40-30
Среда Игла MEM - до 100
Чувствительность к патогенным вирусам крупного рогатого скота отражена в таблице 1.
Из приведенных примеров таблицы 1 видно, что новый межвидовой гибридный штамм ПО-ТК-×ЛК обладает более высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, чем исходная мутантная линия ПО-ТК- и внутривидовой гибрид почки и спленоцитов овцы ПО-ТК-×СО. Гибридный штамм ПО-ТК-×СО чувствителен к вирусам ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпесу вируса крупного рогатого скота.
Результаты исследований по чувствительности к вирусам клеток ПО-ТК-×ЛК коррелируют с ранее опубликованными данными по культивированию вируса ринопневмонии в гибридной культуре ПО ТК-×СО. Таким образом, предлагаемый штамм клеток ПО-ТК-×ЛК может служить в качестве резервного для выращивания вирусов.
Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в Лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ с ноября 2002 года по октябрь 2004 года.
Гибридный штамм ПО-TK-×ЛК найдет широкое применение в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов - диагностических исследований при производстве вирус-вакцин и диагностикумов, например, для накопления вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи крупного рогатого скота.
Источники информации
1. Патент RU №2203318, С12N 5/06, 2003 г.
| Таблица 1 | ||||||
| Сравнительная чувствительность штаммов гибридных клеток ПО-ТК-×ЛК, ПО-ТК-×СО и перевиваемых мутантных клеток почки овцы ПО-ТК- к различным патогенным вирусам крупного рогатого скота | ||||||
| Вирус | Культуры клеток | |||||
| Гибридная ПО-ТК-×ЛК | ПО-ТК- | Гибридная ПО-ТК-×СО | ||||
| Проявление ЦПД вируса (час) | Титр вируса ТЦД, 50/мл | Проявление ЦПД вируса (час) | Титр вируса ТЦД, 50/мл | Проявление ЦПД вируса (час) | Титр вируса ТЦД, 50/мл | |
| Латентный герпесвирус, "Movar" крупного рогатого скота | Не чувствительна | Не чувствительна | Не чувствительна | Не чувствительна | 52 | 105 |
| Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (BHV-1) | 24 | 107 | 24 | 106,0-6,7 | 24 | 106 |
| Вирусная диарея - болезнь слизистых (ВД-БС) крупного рогатого скота | 48 | 105 | Не чувствительна | Не чувствительна | Не чувствительна | Не чувствительна |
| Парагрипп-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота | Не чувствительна | Не чувствительна | 72 | 105,5 | 16 | 105,5 |
Линия межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика (ПО-TK-×ЛК) депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под №62 для культивирования вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.
