Способ твердофазного получения препарата

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способу твердофазного получения биопрепарата. Выращивают посевной материал, инокулюм и биомассу гриба Gliocladium catenulatum с дальнейшим твердофазным выращиванием указанной биомассы, причем выращивание проводят на предусмотренных изобретением средах. Полученную биомассу просушивают и измельчают. Изобретение позволяет получить биопрепарат, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к широкому ряду вредителей. 4 табл.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а непосредственно к способу твердофазного получения биопрепарата, который может быть использован против грибных возбудителей овощных, зерновых, технических и цветочных культур, а также саженцев деревьев и кустарников.

Известен способ получения препарата Триходермин-4 из штамма триходермы [1].

Недостатком известного способа является то, что сухой препарат триходермин вследствие образования огромной массы спор сильно "пылит", вызывая подчас аллергическую реакцию, поэтому стремятся получить аспорогенные формы гриба или используют триходерму в виде пасты и суспензии.

Кроме того, триходерма имеет оптимум действия при рН 5 или ниже, что сужает диапазон ее действия.

Степень антагонизма триходермы зависит от наличия органического вещества в почве, поэтому для эффективного действия триходермы необходимо внесение органики, что усложняет и ограничивает ее использование.

Известен способ получения биопрепарата против грибных возбудителей картофеля из штамма гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43, который принимается за прототип [2].

Для размножения штамм культивировали в пробирках на картофельно-глюкозном или сусловом агаре в течение 2-3 недель при температуре 25°С.

Препарат используют в виде суспензии спор. Для этого в пробирку с культурой гриба добавляют стерильную воду до верхнего уровня среды и встряхивают до образования суспензии. Подсчет конидий в полученной суспензии проводят в счетной камере Горяева, после чего доводят концентрацию до 10⁶ конидий в 1 мл воды. Титр биопрепарата 6,5×10⁶ конидий в 1 мл.

При хранении штамма в холодильнике при температуре 5-10°С в пробирках на картофельно-глюкозном агаре пересев требуется раз в год. Приготовленный биопрепарат (суспензия штамма) используется в течение 24 часов. Норма расхода 10 мл на 1 кг картофеля.

Недостатками известного способа получения биопрепарата из штамма Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 являются ограниченное использование штамма против возбудителей заболеваний, а именно грибных фитопатогенов картофеля, отсутствие биопрепарата в сухой форме, непродолжительный срок использования приготовленного из штамма биопрепарата (суспензии штамма) - в течение 24 часов.

Решаемая изобретением "Способ твердофазного получения биопрепарата" задача - получение нового биопрепарата, обладающего широким спектром антагонистической активности по отношению к ряду грибов, возбудителей вертициллеза, фузариоза, корневых гнилей в почве и ризосфере растений, возможность получения его в виде порошка без запаха, содержащего 250...500×10⁶ конидий в 1 г препарата.

Поставленная задача решена тем, что способ твердофазного получения биопрепарата, включающий выращивание гриба Gliocladium catenulatum путем выращивание посевного материала инокулюма и биомассы гриба Gliocladium catenulatum с дальнейшим твердофазным выращиванием указанной биомассы, причем выращивание посевного материала осуществляют на косяках среды Чапека с 0,4...0,6% кукурузного экстракта в течение 10...14 суток при температуре 24...26°С, состав среды, г/л:

сахароза	30
NaNO3	2
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
FeSO4	следы
кукурузный экстракт	5
Агар	20,

выращивание инокулюма осуществляют на качалке не менее 200 об./мин при температуре 24...26°С в течение 2...3 суток до образования густой суспензии мицелия гриба, состав инокулятной среды, г/л:

меласса	40
(NH4)2SO4	2,3
CaCO3	5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5,

выращивание биомассы гриба осуществляют сначала в малом ферментере емкостью 10...20 л, а потом в ферментере 100...300 л в ферментационной среде, г/л:

кукурузная мука	40
(NH4)2SO4	0,65
CaCO3	0,5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
рН натуральный	6,0;

засев ферментера производят из расчета 5% инокулята по объему ферментера, выращивание биомассы гриба ведут при температуре 24...26°С в течение 72 часов, первые 24 часа роста проводят аэрацию - 0,5 об./мин, оставшийся период выращивания - 1 об./мин, а твердофазное выращивание биомассы осуществляют путем выращивания 900 мл нефильтрованной биомассы гриба на субстрате, включающем:

- 2 кг мелкого вермикулита марки 200,

- 0,5 кг отрубей,

и увлажненном одним литром солей следующего состава, г/л:

(NH4)2SO4	0,65
CaCO3	5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5,

выращивание производят в течение 5...7 суток при температуре 24...26°С, после чего субстрат, включающий споры и мицелий, подсушивают и измельчают с получением препарата, титр которого составляет 200...500×10⁶ конидий в 1 г препарата.

Заявленный способ является новым, так как он неизвестен из уровня техники.

Заявленный способ имеет изобретательский уровень, так как он для специалиста явным образом не следует из уровня техники.

Заявленный способ является промышленно применимым, так как он может быть использован для получения нового биопрепарата, обладающего широким спектром антагонистической активности по отношению к ряду грибов, возбудителей вертициллеза, фузариоза, корневых гнилей в почве и ризосфере растений и т.д.

Способ твердофазного получения биопрепарата включает выращивание гриба Gliocladium catenulatum путем выращивания посевного материала инокулюма и биомассы гриба Gliocladium catenulatum с дальнейшим твердофазным выращиванием указанной биомассы, причем выращивание посевного материала осуществляют на косяках среды Чапека с 0,4...0,6% кукурузного экстракта в течение 10...14 суток при температуре 24...26°С, состав среды, г/л:

сахароза	30
NaNO3	2
KH2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
FeSO4	следы
кукурузный экстракт	5
Агар	20,

выращивание инокулюма осуществляют на качалке не менее 200 об./мин при температуре 24...26°С в течение 2...3 суток до образования густой суспензии мицелия гриба, состав инокулятной среды, г/л:

меласса	40
(NH4)2SO4	2,3
CaCO3	5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5,

выращивание биомассы гриба осуществляют сначала в малом ферментере емкостью 10...20 л, а потом в ферментере 100...300 л в ферментационной среде, г/л:

кукурузная мука	40
(NH4)2SO4	0,65
CaCO3	0,5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
рН натуральный	6,0;

засев ферментера производят из расчета 5% инокулята по объему ферментера, выращивание биомассы гриба ведут при температуре 24...26°С в течение 72 часов, первые 24 часа роста проводят аэрацию - 0,5 об./мин, оставшийся период выращивания - 1 об./мин, а твердофазное выращивание биомассы осуществляют путем выращивания 900 мл нефильтрованной биомассы гриба на субстрате, включающем:

- 2 кг мелкого вермикулита марки 200,

- 0,5 кг отрубей,

и увлажненном одним литром солей следующего состава, г/л:

(NH4)2SO4	0,65
CaCO3	5
KH2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5,

выращивание производят в течение 5...7 суток при температуре 24...26°С, после чего субстрат, включающий споры и мицелий, подсушивают и измельчают с получением препарата, титр которого составляет 200...500×10⁶ конидий в 1 г препарата.

В полевых условиях препарат вносится в почву перед посевом или при посеве через удобрительный барабан в смеси с минеральными удобрениями в норме 5...10 кг/га.

В условиях закрытого грунта препарат вносится вручную при закладке грунта в норме 50 г/м². Возможно внесение методом пролива под вегетирующие растения.

Способ внесения биопрепарата на семена предполагает опудривание увлажненных семян препаратом в дозе 300...500 г на гектарную норму высева семян мелких и средних размеров и до 4-х кг/га для хлопчатника. Для лучшей удерживаемости препарата рекомендуется семена увлажнять 0,2% раствором прилипателя карбоксиметилцеллюлозы или другого (в количестве 2...3% от веса семян).

Гриб глиокладин продуцирует биологически активные вещества, в частности этилен, антибиотики, миколитические ферменты.

Заявленный способ позволяет получить биопрепарат, который способствовал повышению урожайности хлопчатника, снижению заболеваемости, заметному снижению инфицированности почвы.

Действие биопрепарата и триходермина на рост, развитие, урожай и заболеваемость вертициллезным вилтом хлопчатника, высеваемого после распашки люцерны, показано в таблице 1.

Таблица 1
Варианты	Высота растений, см	Число ветвей на 1-м растении	Число коробочек на 1-м растении	Заболеваемость, %	Урожай хлопка-сырца, ц/га	Прибавка урожая
ц/га	%
Контроль	76,7	12,5	8,5	46,5	35		0
Биопрепарат 15 кг/га	82,0	13,4	11,4	19,0	43	8	22,8
Триходермин	77,2	12,0	9,5	41,0	38	3	8,6

Приводим другие примеры положительного влияния полученного предложенным способом нового биопрепарата на рост растений, устойчивость к болезням и урожай. В табл.2 показано влияние предпосевной обработки семян подсолнечника биопрепаратом на рост растений, устойчивость к болезням и урожай.

Таблица 2 Влияние предпосевной обработки семян подсолнечника новым биопрепаратом на рост растений, устойчивость к болезням и урожай Агрофирма "Россия", Краснодарский край, площадь участка 200 га, 1995 г.
Варианты	Длина стебля растения,	% больных септориозом	Урожай, ц/га	Прибавка урожая
4.7	10.8	ц/га	%
Контроль	153	210	19	18,4	-	0
Биопрепарат, суспензия гриба 1 л/т семян	192	250	2	27,7	9,3	50,5

В табл.3 показано влияние биопрепарата на урожай и пораженность болезнями льна-долгунца сорта К-6.

Таблица 3 Влияние биопрепарата на урожай и пораженность болезнями льна-долгунца сорта К-6, 1992 г. Учхоз "Украина", Житомирская обл. Размер делянки 50 м2. Трехкратная повторность.
Вариант	Пораженность растений, %	Урожай соломы, ц/га	Прибавка урожая соломы	Урожай семян, ц/га	Прибавка урожая семян
Антракноз	Ржавчина	Полиспороз	ц/га	%	ц/га	%
Контроль	28	8	15	54,5	-	0	5,4	-	0
Биопрепарат, 20 кг/га	12	2	3	60,9	6,4	10	7,0	1.6	29,6

В табл.4 показано действие биопрепарата и агрофила на урожай, выход сахара и заболеваемость сахарной свеклы.

Таблица 4 Действие нового биопрепарата и агрофила на урожай, выход сахара и заболеваемость сахарной свеклы. Размер делянки 1 га, трехкратная повторность. Житомир, СХИ, 1990 г.
Варианты	Заболеваемость	Урожай корнеплодов, ц/га	% сахара в корнеплодах	Выход сахара, ц/га	Прибавка сахара
Церкоспороз	Фомоз	ц/га	%
Контроль	31,4	20,8	328	16,5	43,8	-	0
Биопрепарат, 0,5 кг/га на семена	20,8	11,1	369	16,7	49,8	6,0	13,7
Агрофил 0,5 кг/га на семена	18,5	9,4	379	15,6	44,9	1,1	2,5

Биопрепарат экологически чист и безопасен для человека и животных.

Заявленный способ позволяет получить биопрепарат, обеспечивающий ограничение и подавление роста и развития фитопатогенных грибов (возбудителей вертициллеза, фузариоза, корневых гнилей) в почве и ризосфере растений, для чего биопрепарат вносится в почву или на увлажненные семена. Гриб антагонист активно развивается в почве, сохраняясь длительное время (до 2-х лет). В результате действия биопрепарата снижается заболеваемость растений, снимаются острые формы поражения, ускоряется развитие растений, возрастает урожай и качество продукции.

Источники информации

1. Сейкетов Г. Некоторые особенности биологии гриба триходерма и препарат триходермин. Труды Института микробиологии и вирусологии, г.Алма-Ата, т.12, 1969, с.3-10.

2. Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott для получения препарата против грибных возбудителей картофеля. Авторское свидетельство СССР №1836907, опубликовано 30.08.93. Бюл. №32.

Способ твердофазного получения биопрепарата, включающий выращивание гриба Gliocladium catenulatum путем выращивания посевного материала, инокулюма и биомассы гриба Gliocladium catenulatum с дальнейшим твердофазным выращиванием указанной биомассы, причем выращивание посевного материала осуществляют на косяках среды Чапека с 0,4...0,6% кукурузного экстракта в течение 10...14 суток при температуре 24...26°С, состав среды, г/л:

сахароза	30
NaNO3	2
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
FeSO4	следы
кукурузный экстракт	5
агар	20

выращивание инокулюма осуществляют на качалке не менее 200 об/мин при температуре 24...26°С в течение 2...3 суток до образования густой суспензии мицелия гриба, состав инокулятной среды, г/л:

меласса	40
(NH4)2SO4	2,3
CaCO3	5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5

выращивание биомассы гриба осуществляют сначала в малом ферментере емкостью 10...20 л, а потом в ферментере 100...300 л в ферментационной среде, г/л:

кукурузная мука	40
(NH4)2SO4	0,65
CaCO3	0,5
КН2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5
рН натуральный	6,0

засев ферментера производят из расчета 5% инокулята по объему ферментера, выращивание биомассы гриба ведут при температуре 24...26°С в течение 72 ч, первые 24 ч роста проводят аэрацию - 0,5 об/мин, оставшийся период выращивания - 1 об/мин, а

твердофазное выращивание биомассы осуществляют путем выращивания 900 мл нефильтрованной биомассы гриба на субстрате, включающем 2 кг мелкого вермикулита марки 200 и 0,5 кг отрубей и увлажненном 1 л солей следующего состава, г/л:

(NH4)2SO4	0,65
CaCO2	5
KH2PO4	1
MgSO4	0,5
KCl	0,5

выращивание производят в течение 5...7 суток при температуре 24...26°С, после чего субстрат, включающий споры и мицелий, подсушивают и измельчают с получением препарата, титр которого составляет 200...500×10⁶ конидий в 1 г препарата.