Способ получения изображения повышенной разрешающей способности

Изобретение относится к микроскопии, а именно к способу получения изображения повышенной разрешающей способности, и может быть использовано для наблюдения биологических объектов, микро- или наноструктур, а также для контроля качества микролитографии. В способе получения изображения повышенной разрешающей способности, состоящем в наблюдении исследуемого объекта под оптическим микроскопом дальнего поля, согласно изобретению, на исследуемый объект наносят частицы или его помещают в жидкость, содержащую взвесь частиц, и при помощи частиц, которые оказываются в непосредственной близости от поверхности образца в области ближнего поля, получают информацию о распределении интенсивности ближнего поля над этой поверхностью посредством наблюдения частиц через оптический микроскоп, при этом определяют величину рассеяния или поглощения, соответствующую каждой отдельной частице, и координату этой частицы, на получаемом изображении повышенной четкости точке с координатой каждой частицы приписывают значение рассеиваемой или поглощаемой интенсивности. В качестве частиц используют микро- или наночастицы. Технический результат - увеличение скорости получения изображения, а также удешевление и упрощение процесса 11 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Изобретение относится к микроскопии, а именно к способу получения изображения повышенной разрешающей способности, и может быть использовано для наблюдения биологических объектов, микро- или наноструктур, а также для контроля качества микролитографии.

Известно, что классический предел разрешения идеальной оптической системы определяется дифракционным размером пятна как R=lambda/(2*NA), где R - размер пятна, lambda - длина волны используемого света, NA - числовая апертура линзы (объектива). Числовая апертура определяется телесным углом, в котором распространяется свет, захватываемый линзой. Она равна синусу максимального угла, который образует идущий от объекта луч, еще попадающий в объектив. Этот предел задается волновой природой света и рассматривается как непреодолимое препятствие для многих практических случаев. Тем не менее, этот предел разрешения определен при некоторых предположениях, таких как монохроматичность источника, неполяризованный свет, короткое время снятия изображения и так далее. Во многих случаях, при устранении этих ограничений, могут быть получены дополнительные степени свободы, которые позволят преодолеть данный предел. Так, благодаря неизменности количества информации, которая дается наблюдаемой системой, пространственное разрешение может быть увеличено за счет других степеней свободы.

Известен способ увеличения разрешения по одной координате (по глубине образца) (смотри - W.Lukosz, "Optical sytems with resolving powers exceeding the classical limits." J. Opt. Soc. Am. 56, 1463-1472 (1967)).

Также известны ортогональные поляризации, которые могут быть использованы для удвоения разрешения в случае поляризационно-симметричного образца (смотри - А.W.Lohmann and D.P.Paris, "Superresolution for nonbirefringent objects," Appl. Opt. 3, 1037-1043 (1964)).

Существует метод математической обработки изображения, заключающийся в экстраполяции пространственного спектра (смотри - A.J.den Dekker, A. van den Bos, "Resolution: a survey," J. Opt. Soc. Am. A 14, 547-557 (1997)).

Другая возможность получить больше информации об образце - это использование нескольких длин волн для наблюдений объекта. В этом случае объект не должен иметь окраску, т.е. выглядеть по-разному для разных длин волн (смотри - А.М.Tai, "Two-dimensional image transmission through a single optical fiber by wavelength-time multiplexing," Appl. Opt. 22, 3826-3832 (1983)).

Для систем со значительным пространственным разрешением наиболее широко используемыми являются способы, основанные на наклонном освещении образца (ссылка - Z.Zaievsky and D.Mendlovic, "Optical Super resolution," Springer, New York, (2004)).

Недостатками известных способов являются их применимость только к определенным типам исследуемых образцов, а также незначительное (не многократное) повышение разрешающей способности.

Одной из наиболее притягательных степеней свободы, которая может быть использована, является временная степень свободы, то есть возможность увеличения разрешения при наблюдении статического объекта при изменяющихся условиях за счет учета этих условий и при совместной обработке изображений, полученных в этих условиях. Существует метод, в котором наблюдаемый образец освещается меняющейся во времени спекл-картиной известной формы, что позволяет при помощи цифровой обработки накопленных данных получить изображение повышенного разрешения (ссылка - J.Garcia, Z.Zaievsky, and D.Fixler, "Synthetic aperture superresolution by speckle pattern projection," Optics Express Vol.13, No.16, 6073-6078 (2005)). Недостатком данного метода является необходимость предварительного получения информации о распределении интенсивности используемой спекл-картины с высокой точностью.

Известен способ получения изображения повышенной разрешающей способности (смотри патент US №6900435 В1, от 31.05.2005 г.), выбранный в качестве прототипа.

В известном способе-прототипе предлагается использовать сочетание ближнепольного микроскопа и обычного оптического микроскопа (оптического микроскопа дальнего поля). Посредством этого сочетания можно существенно повысить скорость работы системы получения изображения повышенной разрешающей способности, сканируя только необходимые участки поверхности.

В прототипе информация о мелких деталях образца получается при его сканировании зондом. Ближайшим по технической сущности к описываемому способу получения высокого разрешения оптического микроскопа является ближнепольный оптический сканирующий микроскоп. Основой данного микроскопа является зонд, представляющий обычно оптическое волокно, торец которого закрыт диафрагмой. Свет в волокне распространяется в его сердцевине и локализован в области (в цилиндре), радиус которой больше длины волны. На сердцевину волокна наносится пленка металла, в которой по центру сердцевины делается отверстие. Диаметр отверстия делается гораздо меньшим длины волны и, соответственно, меньшим дифракционного предела разрешения обычного оптического микроскопа. Со свободного торца волокна заводится излучение. С противоположного торца свет выходит через маленькое отверстие (диафрагму). Таким образом, получаем «точечный» источник света. Если подвести торец волокна вплотную к исследуемому образцу, то свет, отразившись от образца, зайдет обратно в волокно и выйдет с противоположного конца. Измеряя интенсивность света, вышедшего с противоположного конца, мы можем судить об отражающей способности точки поверхности образца, с которой соприкасается зонд, об ее цвете и прочих оптических свойствах. Перемещая зонд (торец волокна) по всей поверхности образца и регистрируя интенсивность света, отраженного поверхностью, для данной координаты, возможно построение изображения всего образца. При этом разрешение, с которым возможно это сделать, ограничено размером диафрагмы (отверстия, через которое свет выходит из волокна). Обычно эта величина составляет около 50 нанометров. Положение зонда обычно задается пьезоподвижками, точность позиционирования которых может составлять сотые доли нанометра.

Следует отметить, что практически затруднительно и нерационально подводить торец волокна вплотную к поверхности образца. При этом торец волокна и диафрагма будут неизбежно повреждаться. На самом деле в этом нет необходимости. Достаточно, если торец волокна находится в т.н. области ближнего поля. Эта область, в которой еще сохраняются мелкомасштабные (меньшие дифракционного предела) вариации интенсивности отраженного света.

В прототипе сочетание двух типов микроскопов (ближнепольного и дальнепольного) дает возможность при помощи зонда ближнепольного микроскопа создать «точечный» источник света, который освещает «точку» поверхности образца, а при помощи дальнепольного (обычного) микроскопа наблюдать свет, рассеянный данной точкой.

В известном способе возможен другой вариант - не освещение, а затенение точки поверхности и наблюдение обычным микроскопом изменения картины отраженного света.

Известное техническое решение-прототип обладает рядом недостатков, которые присущи основным недостаткам ближнепольного оптического микроскопа, а именно высокая стоимость, связанная с дорогостоящей системой точного позиционирования зонда, и все еще низкая скорость получения изображения.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, то есть увеличение скорости получения изображения, а также удешевление и упрощение самого процесса.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения изображения повышенной разрешающей способности, состоящем в наблюдении исследуемого объекта под оптическим микроскопом дальнего поля и обработке данных, согласно изобретению на исследуемый объект наносят частицы или его помещают в жидкость, содержащую взвесь частиц, при этом осуществляют перераспределение частиц по поверхности исследуемого объекта. В качестве частиц используют микро- или наночастицы.

Согласно изобретению используют поглощающие, или рассеивающие, или люминесцирующие частицы.

Задача также решается за счет использования отраженного поверхностью объекта света или посредством проходящего через объект света. При этом для перераспределения частиц используют броуновское движение, либо направленные потоки жидкости, либо магнитное поле.

Как видно из вышеизложенного, в способе по сравнению с прототипом предлагается использовать вместо зонда перемещающиеся или перемещаемые над поверхностью исследуемого объекта частицы. Поверхность образца с частицами при этом можно наблюдать при помощи обычного светового микроскопа. Частицы могут быть, например, взвешенными в тонком слое жидкости, наносимом для этого на поверхность исследуемого объекта или заполняющем пространство между объективом и образцом наподобие иммерсионной жидкости. При помощи частиц, которые оказываются в непосредственной близости от поверхности образца (в области ближнего поля), можно получить информацию о распределении интенсивности ближнего поля над этой поверхностью посредством наблюдения их через обычный оптический микроскоп.

Они могут служить либо «точечным» источником света, в случае использования люминесцирующих частиц, либо затеняющим «зондом», в случае использования частиц поглощающих свет. При этом в предлагаемом способе есть возможность избежать использования системы позиционирования благодаря тому факту, что координату точечного источника, либо рассеивателя, либо поглощающего центра можно определить с помощью обычного оптического микроскопа гораздо точнее, чем разрешающая способность данного микроскопа.

Таким образом, имеется возможность точно определить координату частиц, а построчное или какое-либо другое сканирование заменить хаотичным или любым другим движением частиц.

При этом можно «отсканировать» выше указанными «зондами» (частицами) всю поверхность, а поскольку есть возможность наблюдать одновременно достаточно большое количество частиц, то скорость такого «сканирования» существенно выше, чем у ближенепольного микроскопа, что подтверждено проведенными экспериментами.

В настоящее время на рынке существует широкий выбор как видов частиц (поглощающих, рассеивающих, люминесцирующих от 10 нанометров до десятков микрон), так и фирм, их производящих. Стоимость этих микро- и наночастиц относительно невысока - до 100 долл. за 10 мл взвеси наночастиц.

Следует отметить, что для того, чтобы была возможность по изображению микрочастицы в оптическом микроскопе точно определить ее координату, необходимо, чтобы размытое изображение этой микрочастицы не перекрывалось с таким же изображением другой частицы. Поэтому, чтобы не затруднить анализ получаемых изображений, необходимо использовать достаточно разреженную взвесь частиц.

Заявляемый способ получения изображения повышенной разрешающей способности имеет отличия от прототипа (смотри патент US №6900435 В1, от 31.05.2005 г.), следовательно, соответствует критерию "новизна", не следует явным образом из изученного уровня техники, то есть имеет изобретательский уровень.

Способ получения изображения повышенной разрешающей способности может быть получен и использован в промышленности, следовательно, соответствует критерию "промышленная применимость".

Сущность предлагаемого технического решения поясняется чертежами, где:

- на фиг.1 изображена схема анализа изображений в проходящем свете;

- на фиг.2 изображена схема анализа изображений в отраженном свете;

- на фиг.3 изображена схема анализа изображений с применением иммерсионного объектива;

- на фиг 6 и 9 - изображение тестового объекта, полученное экспериментально, с использованием оптического микроскопа дальнего поля4

- на фиг.4 - экспериментально полученное, видимое в оптический микроскоп дальнего поля распределение интенсивности вдоль отрезка А, показанного на фиг.6;

- на фиг.5 - экспериментально полученный график зависимости яркости точки, соответствующий центру (светлому месту) микрочастицы от координаты частицы вдоль отрезка А, показанного на фиг.6;

- на фиг.7 - экспериментально полученное, видимое в оптический микроскоп дальнего поля распределение интенсивности вдоль отрезка В, показанного на фиг 9;

- на фиг.8 - экспериментально полученный график зависимости яркости точки, соответствующий центру (светлому месту) микрочастицы, от координаты частицы вдоль отрезка В, показанного на фиг.9.

Пример конкретного выполнения.

Пример 1.

Возможную последовательность действий в процессе получения изображения можно представить следующим образом, смотри фиг.1 и фиг.2:

Образец 1 помещают под объектив 2 микроскопа. На образец 1 наносится капля прозрачной жидкости 3, содержащая взвесь наночастиц или микрочастиц 4. В качестве жидкости возможно использование воды.

Для того чтобы сделать поверхность жидкости 3 плоской, на каплю как можно ближе к поверхности образца помещается покровное стекло 5. Чтобы не повредить образец покровным стеклом и не выдавить всю жидкость с его поверхности, вокруг образца на стекло (или вокруг интересующей области образца) помещается кольцо из тонкой пленки или другие ограничители, не позволяющие покровному стеклу приблизиться вплотную к образцу (не показано). Плоская поверхность жидкости (вместе с покровным стеклом) позволит избежать возможных искажений при наблюдении поверхности образца через микроскоп. Следует заметить, что доля «полезных» частиц, находящихся в непосредственной близости к поверхности образца (в области ближнего поля), напрямую зависит от толщины слоя жидкости, заключенной между образцом и покровным стеклом. Перемещение частиц в данной жидкости может осуществляться за счет хаотического (броуновского) движения, либо за счет перемещения самой жидкости, либо возбуждения вибраций в образце. Далее объектив 2 микроскопа подводится к образцу на расстояние, дающее резкое изображение поверхности образца.

Наблюдение образца может производиться как в проходящем свете 6 (фиг.1) (в случае если образец способен пропускать свет), так и в отраженном (рассеянном) свете 6 (фиг.2).

Посредством цифровой камеры (не показано) производится регистрация изображения, которое заносится в компьютер. Запись изображений повторяется многократно, через некоторые интервалы времени, за которые находящиеся в жидкости частицы успевают переместиться. В результате в памяти компьютера накапливается набор изображений образца, полученных через жидкость с частицами, соответствующих различным распределениям частиц над поверхностью образца. На фиг.2 схематически показано изображение 7 образца 1 (амплитудной решетки), видимое через оптический микроскоп для различных типов используемых частиц (слева для поглощающих, справа для рассеивающих). Поглощающая частица не видна, если она находится над поглощающим элементом образца (в области ближнего поля поглощающего элемента образца), и видна, если она находится над рассеивающим элементом образца. Аналогичным образом схема работает с рассеивающими частицами.

Массив полученных изображений обрабатывается с помощью компьютера. Причем для каждого отдельного изображения выделяется свет, рассеянный, поглощенный или излученный подвижными частицами (распределение интенсивности, даваемое частицами или соответствующее частицам). При этом определяется величина рассеяния (или поглощения), соответствующая каждой отдельной частице, и координата этой частицы.

На получаемом изображении повышенной четкости точке с координатой каждой частицы ставится в соответствие (приписывается) значение рассеиваемой (поглощаемой) интенсивности. Полученные значения от всех частиц и от всего набора записанных изображений суммируются, из полученного изображения вычитаются фоновая и медленно меняющаяся по пространству составляющие. В результате получаем изображение повышенной четкости, с разрешением деталей, гораздо меньше разрешающей способности используемого в микроскопе объектива.

Описанная выше последовательность действий не является строгой, особенно это относится к математической обработке накопленных изображений.

Фиг.1 схематически иллюстрирует принцип получения изображения повышенной четкости в случае освещения образца 1 проходящим светом. Для примера, образец представляет собой амплитудную периодическую решетку, и используются поглощающие частицы в прозрачной жидкости. На получаемом в такой схеме изображении образца частицы не видны, если находятся над поглощающим элементом образца (в области отбрасываемой им тени 8).

На фиг.6 и 9 для примера представлены экспериментально полученные изображения образца по схеме, показанной на фиг.1. В качестве образца использовалась амплитудная маска с тремя группами чередующихся полос. В каждой группе по три полосы, расстояние между полосами составляло 1,5 мкм для группы 1, 2,1 мкм для группы 2 и 3 мкм для группы 3. По распределению интенсивности (смотри фиг.4 и 7) вдоль отрезков А и В, показанных на фиг.6 и 9, видно, что используемый в эксперименте объектив микроскопа не способен дать необходимое разрешение для четкого наблюдения групп 1 и 2. Но, как видно из фиг.5 и 8, использование поглощающих микрочастиц диаметром 1,5 мкм в воде позволило существенно повысить разрешающую способность полученного изображения.

Пример 2.

Вместо использования покровного стекла 5, накладываемого на образец 1 с каплей взвеси частиц 3, может использоваться иммерсионный объектив 2 (фиг.3). При этом в качестве иммерсионной жидкости между объективом и образцом помещается жидкость, содержащая взвесь частиц.

Пример 3

Частицы можно наносить прямо на образец без использования какой-либо жидкости, и осуществляется перераспределение частиц по поверхности образца при помощи встряхивания посредством возбуждения ультразвуковых волн в образце или при помощи воздействия магнитного поля.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ получения изображения повышенной разрешающей способности обеспечивает увеличение скорости получения изображения, а также удешевление и упрощение самого процесса.

1. Способ получения изображения повышенной разрешающей способности, состоящий в наблюдении исследуемого объекта под оптическим микроскопом дальнего поля, отличающийся тем, что на исследуемый объект наносят частицы или его помещают в жидкость, содержащую взвесь частиц, и при помощи частиц, которые оказываются в непосредственной близости от поверхности образца в области ближнего поля, получают информацию о распределении интенсивности ближнего поля над этой поверхностью посредством наблюдения частиц через оптический микроскоп, при этом определяют величину рассеяния или поглощения, соответствующую каждой отдельной частице, и координату этой частицы, на получаемом изображении повышенной четкости точке с координатой каждой частицы приписывают значение рассеиваемой или поглощаемой интенсивности.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют микро- или наночастицы.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют поглощающие частицы.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют рассеивающие частицы.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют люминесцирующие частицы.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют рассеянный (отраженный) поверхностью объекта свет.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют проходящий через объект свет.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для перераспределения частиц используют броуновское движение.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что для перераспределения частиц используют направленные потоки жидкости.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что для перераспределения частиц используют встряхивание образца.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют магнитные частицы.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что для перераспределения частиц используют магнитное поле.