Плотная питательная среда для культивирования микобактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для исследования микобактерий туберкулеза. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, пируват натрия, агар, гумивит и водный раствор желтка куриного яйца (1:1). Изобретение позволяет удешевить питательную среду и упростить бактериологические исследования. 4 табл.

 

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности.

Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Технология изготовления этих сред предусматривает их свертывание, что исключает возможность их использования в качестве компонента двухслойной среды для изучения биологической активности микобактерий.

Цель изобретения - плотная питательная среда для культивирования микобактерий, пригодная для использования в качестве наслаиваемого компонента двухслойных сред.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
кадий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
пируват натрия	0,5 г
глицерин	40,0 г
агар	30,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
водный раствор желтка куриного яйца (1:1)	250,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО "Агропром") представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /2/. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до, 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 250,0 мл полученного раствора,добавляли в расплавленную агаровую среду, перемешивали, разливали по пробиркам по 3,0 мл и скашивали.

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1
Состав разных вариантов плотных питательных сред
Состав	Вариант новой среды
1-й	2-й	3-й	4-й
L-аспарагин, г	4,0	4,0	4,0	4,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Сернокислый магний, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Лимонная кислота, г	2,0	2,0	2,0	2,0
Лимоннокислое аммиачное железо, г	0,05	0,05	0,05	0,05
Пируват натрия, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Глицерин, г	40,0	40,0	40,0	40,0
Агар, г	30,0	30,0	30,0	30,0
Гумивит, мл	85,0	90,0	95,0	100,0
Водный раствор желтка куриного яйца (1:1), мл	250,0	250,0	50,0	250,0
Дистиллированная вода, мл	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia, H₃₇Ra), M.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), M.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста, относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2
Сроки появления первичного роста микобактерий на средах разных вариантов
Штаммы	Сроки появления роста, дней
	Среда в соответствии с изобретением	Среда Левенштейна - Йенсена
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4
M.bovis (шт.Vallee)	15	13	12	12	14
M.bovis (шт.BCG)	15	15	15	15	15
M.tuberculosis (шт.Academia)	13	11	10	10	9
M.tuberculosis (шт.H37Ra)	13	11	10	10	9
M.avium (шт.ГИСК)	9	7	7	7	7
M.avium (шт.44)	12	10	9	9	7
M.avium (шт.659)	11	10	10	10	8
M.phlei	4	3	2	2	2
M.smegmatis (шт.53)	4	3	2	2	2

Таблица 3
Массивность роста микобактерий на средах разных вариантов
Среда	Штаммы микобактерий
	M.bovis Vallee	M.bovis BCG	M.tub. Academia	M.tub. H37Ra	М.avium ГИСК	М.avium 44	М.avium 659	М.phlei	M.smegmatis 53
	Массивность роста
3 недели роста	1 неделя роста
Вариант 1	±	±	±	+	±	±	±	+	+
Вариант 2	+	+	+	++	+	+	+	++	++
Вариант 3	+	+	+	++	++	+	++	++	++
Вариант 4	+	+	+	++	++	+	++	++	++
Среда Левенштейна Йенсена	+	+	+	++	++	+	++	++	++

Пример 4. В таблице 4 приведены результаты исследования антагонистической активности пробиотика «Колибактерин» по отношению к микобактериям с использованием среды в соответствии с изобретением, которую наслаивали на засеянный пробиотическими штаммами мясопептонный агар.

Таблица 4
Антагонистическая активность пробиотика «Колибактерин» по отношению к микобактериям
Доза колибактерина, КОЕ/мл суспензии, при засеве 10 мкл	Интенсивность роста
M.tuberculos is Н37Ra	M.tuberculos is Academia	M.bovis Vallee	М. avium 44	M.smegmatis 53
1-5×103	+	+	+	+	+
1-5×104	+	+	+	+	+
1-5×105	±	±	±	±	+
1-5×106	±	±	±	-	+
1-5×107	±	-	-	-	+
1-5×108	-	-	-	-	±
Примечание: + средний рост, ± слабый рост, - отсутствие роста

Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий. Заявленная плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София, 1971. - С.146-175.

2. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит.//Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

3. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

4. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа.//Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Плотная питательная среда для культивирования микобактерий, содержащая солевую и яичную основу, отличающаяся тем, что она содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
двузамещенный фосфорно-кислый калий	0,5 г
серно-кислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимонно-кислое аммиачное железо	0,05 г
пируват натрия	0,5 г
глицерин	40,0 г
агар	30,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
водный раствор желтка куриного яйца (1:1)	250,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл