Способ диагностики атопической формы бронхиальной астмы у детей

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии и аллергологии, и касается способа диагностики атопической формы бронхиальной астмы у детей. Сущность способа: из пробы венозной крови выделяют лимфоциты, добавляют к ним одновременно моноклональные антитела CD23 и CD19, инкубируют смесь при комнатной температуре, подсчитывают на проточном цитометре количество клеток с меткой (CD19) и клеток с двойной меткой (CD19 CD23), рассчитывают индекс аллергического воспаления по формуле: ((CD19 CD23)/(CD19))×100%, и при индексе, большем 70%, диагностируют атопическую форму бронхиальной астмы. Использование способа позволяет произвести достоверную диагностику атопической формы бронхиальной астмы у детей уже на начальном этапе, когда клинические признаки выражены незначительно. 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для диагностики бронхиальной астмы.

Известен способ диагностики тяжелой формы бронхиальной астмы (БА) (патент РФ №2120635, опубл. в 1998 г.) по клиническим признакам и определению вентиляционной функции легких, в котором производят исследование венозной крови больного с определением количества теофиллинрезистентных лимфоцитов, соотношения количества теофиллинрезистентных лимфоцитов к количеству теофиллинчувствительных лимфоцитов в нагрузочном тесте с теофиллином и концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов М, А и G в реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини, после чего вычисляют индекс аллергического воспаления по формуле

где И - индекс аллергического воспаления;

0,06, 10, 4, 10 - показатели, нормирующие величины учитываемых признаков;

IgG, IgA, IgM - концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов G, А, М, г/л;

ТФР - абсолютное значение величины теофиллинрезистентных лимфоцитов в 1 мкл венозной крови;

ИРИ - соотношение количества теофиллинрезистентных лимфоцитов к количеству теофиллинчувствительных лимфоцитов, и при наличии соответствующей клинической картины повторяющихся приступов бронхиальной астмы и превышении индекса аллергического воспаления порогового значения, установленного для атопической бронхиальной астмы на уровне 0,130, для инфекционно-зависимой бронхиальной астмы - на уровне 0,80, а при затруднении дифференциальной диагностики атопической и инфекционно-зависимой бронхиальной астмы - на уровне 0,10, диагностируют тяжелую бронхиальную астму.

Недостатком способа является то, что с его помощью можно определять только тяжелую форму астмы.

Известен способ диагностики обострения бронхиальной астмы, заключающийся в определении цитокинов (ИЛ-5) в сыворотке крови и при значении его более 92 пг/мл диагностируют обострение, менее 92 пг/мл - ремиссию, менее 60 пг/мл - норму (патент РФ №2202111, опубл. в 2003 г.).

Недостатком способа является то, что способ не является достаточно достоверным для диагностики бронхиальной астмы в периоде ремиссии.

Известно, что иммуноглобулин (IgE) ассоциируется с аллергическими болезнями и макро-паразитарными инвазиями.

У детей с аллергическими заболеваниями отмечается в периоде обострения повышение не только IgE в плазме крови, но и повышение экспрессии низкоафинной субъединицы рецептора к IgE CD23 (FcepsilonRII).

Известен способ диагностики бронхиальной астмы у детей (авт. свид. SU №1413532, БИ №28 от 30.07.88 г.), который заключается в определении уровня общего сывороточного иммуноглобулина Е, путем определения титра комлементсвязующих антител к вирусам парагриппа и респираторно-синцитальному, при его значении 1/40 и более диагностируют неатопическую форму бронхиальной астмы, а при титре 1/10-1/20 диагностируют атопическую форму.

Этот способ выбран нами за прототип, как сходный по назначению и имеющий признаки, общие с признаками заявляемого изобретения.

Недостатком способа является то, что он подходит для диагностики бронхиальной астмы в период обострения и не дает точной оценки заболевания в период ремиссии, тогда как повышение концентрации рецептора к IgE отмечается только в периоде обострения, а в период ремиссии данный показатель не повышается.

Задачей данного изобретения является разработка достоверного и более точного способа диагностики бронхиальной астмы.

Поставленная задача решается тем, что разработан способ диагностики атопической формы бронхиальной астмы, включающий исследование крови, для чего из пробы венозной крови выделяют лимфоциты, добавляют к ним одновременно моноклональные антитела CD23 и CD 19, инкубируют смесь при комнатной температуре, подсчитывают на проточном цитометре количество клеток с меткой (CD 19) и клеток с двойной меткой (CD 19 CD23), рассчитывают индекс аллергического воспаления по формуле:

((CD19 CD23)/(CD19))×100%,

при индексе, большем 70%, диагностируют атопическую форму бронхиальной астмы.

Существенным отличием заявляемого способа является то, что добавление моноклональных антител CD23 и CD19 проводят одновременно.

Кроме этого проводят подсчет количества клеток с меткой CD19 и клеток с двойной меткой CD19 и CD23.

Затем рассчитывают индекс аллергического воспаления по формуле:

((CD19 CD23)/(CD19))×100%,

при индексе, большем 70%, диагностируют атопическую форму бронхиальной астмы.

Эти признаки не известны из уровня техники до даты приоритета изобретения, т.е. изобретение соответствует критерию «новизна». Расчет индекса аллергического воспаления по предлагаемой формуле и определение нормативных показателей индекса аллергического воспаления явным образом не следует из уровня техники, т.е. новое решение не является производным прежних решений, что соответствует критерию «изобретательский уровень». Кроме того, предлагаемое изобретение может быть успешно использовано в медицине для диагностики бронхиальной астмы, т.е. соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор крови из вены в количестве 5-8 мл и помещают в пробирку с антикоагулянтом. Содержимое пробирок разводят буферным раствором в 2 раза. Выделение лимфоцитов осуществляют центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³ (ПанЭко) при 1500 об/мин в течение 30 мин при t 4°C. Выделенные лимфоциты дважды отмывают в буферном растворе при 1200 об/мин при t 4°С в течение 10 мин. После этого к 100 мкл взвеси лимфоцитов добавляют 5 мкл моноклональных антител CD 23, как рецептор к Ig E красного цвета (РЕ), и CD 19, как маркер В лимфоцитов зеленого цвета (FITS). Клетки инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, затем отмывают центрифугированием с 2 мл буферного раствора и ресуспензируют в 0.5 мл буферного раствора. Анализ образцов проводят на проточном цитометре.

Для подсчета положительных меток используют программу Cell Quest. Затем исследовали лимфоцитарное окно, согласно типичному расположению популяций лимфоцитов, выявленной по светорассеянию и флюоресцентной метке LeukoGate (CD 45/14).

Подсчитывают количество клеток с меткой CD 19 и клеток с двойной меткой CD 19 CD 23. Затем рассчитывают индекс аллергического воспаления по формуле:

((CD19 CD23)/(CD19))×100%,

и при индексе, большем 70%, диагностируют атопическую форму бронхиальной астмы.

Примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1.

Девочка К., 8 лет, поступила в отделение впервые, с жалобами на сухой кашель, одышку при физической нагрузке.

Наследственность по аллергическим заболеваниям отягощена: у ближайших родственников: атопический дерматит, поллиноз (риноконъюнктивальный синдром), бронхиальная астма. С 5 лет ежегодно в апреле-мае у ребенка отмечаются приступы затрудненного дыхания с периодичностью до 2-3 раз в месяц, купирующиеся ингаляцией вентолина. С 7 лет у девочки отмечались приступы затрудненного дыхания до 1 раза в месяц и при физической нагрузке, был выставлен диагноз «бронхиальная астма». В течение последних 3-х месяцев девочка получала противовоспалительную терапию кромонами (тайледом). На этом фоне отмечалось 2 эпизода бронхообструкции при физической нагрузке, симптомы купировались ингаляциями вентолина.

Определение в составе В лимфоцитов популяции клеток с рецептором к Ig E проводили следующим образом.

Для получения взвеси лимфоцитов из вены бралось 5-8 мл крови в пробирку с антикоагулянтом. Содержимое пробирок разводили буферным раствором в 2 раза. Выделение лимфоцитов проводили с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³ при 1500 об/мин в течение 30 мин при t 4°C. Выделенные лимфоциты дважды отмывали в буферном растворе при 1200 об/мин при t=4°C в течение 10 мин. После этого к 100 мкл взвеси лимфоцитов добавлялось 5 мкл моноклональных антител (CD 23 (РЕ) и CD 19 (FITS)). Клетки инкубировались в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, затем отмывались центрифугированием с 2 мл буферного раствора и ресуспензировались в 0,5 мл буферного раствора. Анализ образцов проводился на проточном цитометре. Для подсчета положительных меток использовалась программа Cell Quest. Исследовалось лимфоцитарное окно, согласно типичному расположению популяции лимфоцитов, выявленной по светорассеянию и флюоресцентной метке LeukoGate (CD 45/14).

Таблица 1
В лимфоциты - CD 19	CD 19 и CD 23
14	12

Расчет в составе В лимфоцитов популяции клеток с рецептором к Ig E по формуле

((CD19 CD23)/(CD19))×100%=12/14×100%=86%.

Данный клинический пример показывает, что у ребенка отмечается повышение в составе В лимфоцитов популяции клеток с рецептором к Ig E. Диагноз: Атопическая форма бронхиальной астма.

Пример 2.

Мальчик С., 10 лет, поступил в отделении впервые для обследования. Наследственность по аллергическим заболеваниям отягощена: у отца бронхиальная астма. Первый приступ затрудненного дыхания развился в 6 лет, в апреле-месяце купирован эуфиллином. В момент поступления в стационар наблюдались приступы затрудненного дыхания до 1 раза в неделю, которые купировались вентолином.

Для получения взвеси лимфоцитов из вены бралось 5-8 мл крови в пробирку с антикоагулянтом. Содержимое пробирок разводили буферным раствором в 2 раза. Выделение лимфоцитов проводили с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³ (ПанЭко) при 1500 об/мин в течение 30 мин при t 4°C. Выделенные лимфоциты дважды отмывали в буферном растворе при 1200 об/мин при t 4°С в течение 10 мин. После этого к 100 мкл взвеси лимфоцитов добавлялось 5 мкл моноклональных антител CD 23 (РЕ) и CD 19 (FITS). Клетки инкубировались в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, затем отмывались центрифугированием с 2 мл буферного раствора и ресуспензировались в 0,5 мл буферного раствора. Анализ образцов проводился на проточном цитометре. Для подсчета положительных меток использовалась программа Cell Quest. Исследовалось лимфоцитарное окно, согласно типичному расположению популяции лимфоцитов, выявленной по светорассеянию и флюоресцентной метке LeukoGate (CD 45/14).

Таблица 2
В лимфоциты CD 19	CD 19 и CD 23
17	15,5

Расчет в составе В лимфоцитов популяции клеток с рецептором к Ig E по формуле:

((CD19 CD23)/(CD19))×100%=15,5/17×100%=91%

Диагноз: Сезонная бронхиальная астма.

Данный клинический пример показывает, что несмотря на то, что ребенок поступил вне периода цветения, в состоянии клинической ремиссии, у него сохраняется повышение в составе В лимфоцитов клеток, несущих на своей поверхности рецептор к IgE, что говорит об атопической природе заболевания.

Пример 3.

Мальчик Н., 12 лет, проходил диспансеризацию.

Наследственность по аллергическим заболеваниям не отягощена.

У ребенка никогда не отмечается клинических проявлений атопических заболеваний.

Для получения взвеси лимфоцитов из вены бралось 5-8 мл крови в пробирку с антикоагулянтом. Содержимое пробирок разводили буферным раствором в 2 раза. Выделение лимфоцитов проводили с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³ (ПанЭко) при 1500 об/мин в течение 30 мин при t 4°C. Выделенные лимфоциты дважды отмывали в буферном растворе при 1200 об/мин при t 4°С в течение 10 мин. После этого к 100 мкл взвеси лимфоцитов добавлялось 5 мкл моноклональных антител (CD 23 (РЕ) и CD 19 (FITS)). Клетки инкубировались в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, затем отмывались центрифугированием с 2 мл буферного раствора и ресуспензировались в 0,5 мл буферного раствора. Анализ образцов проводился на проточном цитометре. Для подсчета положительных меток использовалась программа Cell Quest. Исследовалось лимфоцитарное окно, согласно типичному расположению популяции лимфоцитов, выявленной по светорассеянию и флюоресцентной метке LeukoGate (CD 45/14).

Таблица 3
В лимфоциты CD 19	CD 19 и CD 23
11	7,7

Расчет в составе В лимфоцитов популяции клеток с рецептором к Ig E по формуле:

((CD19 CD23)/(CD19))×100%=7,7/11×100%=70%

Данный клинический пример показывает, что у детей, не склонных к атопии органов дыхания, в составе В лимфоцитов меньше клеток, несущих рецептор к IgE по сравнению с детьми, у которых в основе заболевания лежит атопический процесс.

Заявленное изобретение позволяет произвести достоверную диагностику атопической формы бронхиальной астмы в более короткий срок в связи с тем, что проточную цитометрию проводят с одновременным вводом двух моноклональных антител CD 23 и CD 19, что сокращает время проведения анализа. Кроме этого заявляемый способ позволяет определять наличие атопической формы бронхиальной астмы в самом начале заболевания, когда клинические признаки выражены незначительно.

Способ диагностики атопической формы бронхиальной астмы у детей, включающий исследование крови, отличающийся тем, что из пробы венозной крови выделяют лимфоциты, добавляют к ним одновременно моноклональные антитела CD23 и CD19, инкубируют смесь при комнатной температуре, подсчитывают на проточном цитометре количество клеток с меткой (CD19) и клеток с двойной меткой (CD19 CD23), рассчитывают индекс аллергического воспаления по формуле

((CD19 CD23)/(CD19))·100%,

при индексе большем 70% диагностируют атопическую форму бронхиальной астмы.