Способ изготовления отраслевого стандартного образца (осо) поверхностного антигена вируса гепатита в (hbsag) для контроля качества тест-систем и определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ифа

Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации. Заявлен способ изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА и набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА. Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение длительности хранения и обеспечение возможности неоднократного использования препарата. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.

 

Отраслевой стандартный образец (ОСО) - вещество синтетического происхождения, применяемое для контроля медицинских иммунобиологических препаратов, используемых для диагностики болезней человека.

Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации и может быть использовано для определения чувствительности диагностических тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), а также для определения количественного содержания HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Сущность изобретения:

1. Набор OCO-HBsAg, включающего препарат OCO-HBsAg, который изготовлен из плазменного или рекомбинантного HBsAg разных субтипов и лиофилизирован в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA); 0,75% растворе глицина; 0,01% растворе тимеросала и имеет концентрацию 20 МЕ/мл.

Каждый компонент, входящий в состав раствора для лиофилизации антигена, добавляется из расчета необходимого объема данного раствора.

Например, на 100 мл раствора потребуется: 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA); 0,75 г глицина; 0,1 мл 10% раствора тимеросала; 100 мл дистиллированной воды.

Набор ОСО-HBsAg включает также 9 флаконов с лиофилизированной негативной сывороткой (Реагент 1), используемой для разведения ОСО.

2. Способ изготовления препарата ОСО-HBsAg, при котором препарат можно использовать неоднократно и хранить в течение длительного времени.

Преимущества изобретения:

1. Возможность приготовления необходимого количества разведений OCO-HBsAg в различных концентрациях, например 0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 МЕ/мл. Для этой цели в комплект включены 9 флаконов с Реагентом 1, использовать которые можно постепенно, готовя по две-три концентрации для одной постановки ИФА.

2. Неоднократное использование препарата OCO-HBsAg благодаря возможности длительного хранения регитратированного концентрата, предварительно розлитого по аликвотам, при температуре минус 20°С в течение месяца или при минус 70°С - до конца срока годности препарата (3 года).

3. Изобретение обеспечивает возможность сравнения результатов оценки чувствительности тест-систем для выявления HBsAg различных производителей, а также результатов количественного определения HBsAg в лабораториях.

Описание изобретения

Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации и может быть использовано в биотехнологии и медицине для определения чувствительности диагностических тест-систем, предназначенных для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), а также для определения количественного содержания HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА.

Вирус гепатита В является возбудителем одной из наиболее опасных для человека инфекцией. Современные методы выявления позволяют обнаруживать HBsAg в низких концентрациях. В настоящее время активно ведутся работы по созданию и внедрению в практическое здравоохранение тест-систем, обладающих более высокой чувствительностью. В связи с этим возрастает необходимость в доступном количественном стандарте.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявленному изобретению является способ приготовления «Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, «NIBSC», United Kingdom, code number 00/588", содержащей 33IU/vial, заключающийся в следующем: плазменный антиген, выделенный из пула плазмы человека, содержащей HBsAg (негативной по анти-HCV, анти-HBs, анти-HIVI+2) в определенной концентрации растворяется в неиммунной плазме человека и лиофилизируется (Instructions for Use (Version 1, 24 February 2004)).

Недостатки данного способа:

1. Отсутствует раствор для приготовления разведений. Следовательно, каждая лаборатория вынуждена использовать для приготовления разведений имеющуюся в наличии плазму, что может повлиять на результаты и эффективность проведения анализа. Для обеспечения достоверной и объективной оценки чувствительности тест-систем необходимо для приготовления разведений использовать унифицированный раствор, прошедший надежный контроль.

2. Флакон стандарта до использования необходимо хранить при минус 20°С, а после регидратации хранение препарата не предусмотрено.

Задачей настоящего изобретения является способ изготовления OCO-HBsAg для определения чувствительности диагностических тест-систем и для определения количественного содержания поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом иммуноферментного анализа, предусматривающий длительный срок хранения и возможность неоднократного использования.

Задача решается разработанным способом изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, заключающегося в том, что в 1% водный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 0,75% глицина, 0,01% тимеросала, вносят плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В HBsAg до концентрации 20 МЕ/мл, пипетируют, перемешивают, не допуская вспенивания, в течение 30-60 минут и лиофилизируют. Данный полученный препарат OCO-HBsAg включают в набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что он включает отраслевой стандартный образец (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), полученный по п.1, и реагент 1, представляющий собой сыворотку крови человека негативную, лиофильно высушенную.

Реагент 1 готовят путем центрифугирования отобранных негативных сывороток крови человека, пулирования, добавления тимеросала до 0,01%, причем в обработанный пул добавляли 20-30% от его общего объема смеси для разведения, включающей: 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН₂PO₄; 17,28 г (0,12 М) Na₂HPO₄·12H₂O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА - этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,1 мл 10% раствора тимеросала, с последующей лиофилизацией готового раствора до величины остаточной влажности не более 3%.

Технический результат заключается в увеличении длительности хранения и обеспечении возможности неоднократного использования препарата.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1.

Для изготовления препарата OCO-HBsAg может быть использован плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Данный вид сырья может быть выделен и очищен по методике Ананьева В.А. (очистка HBsAg из сыворотки крови), или получен по оригинальной методике НПО «Диагностические системы».

План изготовления рекомбинантного HBsAg:

1. Получение дрожжевого лизата клеток-продуцентов HBsAg.

2. ПЭГ-рН осаждение осветленного лизата.

3. Получение экстракта HBsAg - обогащенной фракции.

4. Диализ полученной HBs-Ag - обогащенной фракции в буфер для НАР.

5. Адсорбционная хроматография.

6. Гель-фильтрация.

7. Ультрафильтрация.

Сырье для препарата OCO-HBsAg может быть как коммерческого, так и собственного производства.

Очищенный плазменный или рекомбинанатный HBsAg титровали на разводящем растворе одновременно с Международным стандартом (МС) на одном планшете тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg». Совместная обработка кривых титрования HBsAg и МС позволяет подобрать коэффициент разведения для получения HBsAg в концентрации 20 МЕ/мл. Если полученная концентрация не соответствует заданной, допускается корректировка в сторону увеличения введением дополнительного количества HBsAg, или в сторону уменьшения с помощью разводящего раствора. Затем готовый раствор разливали во флаконы вместимостью 3 см³.

Реагент 1 готовили следующим способом: отбирали сыворотку (плазму) крови, не содержащую HBsAg, антитела к HBsAg; антитела к ВИЧ-1,2; Treponema pallidum, HCV. Отбор исследуемых сывороток проводили с использованием иммуноферментных тест-систем. Метод отбора позволяет выбрать только те сыворотки для объединения в пул, которые адекватно взаимодействуют с антигеном, т.е. не дают реакции «гашения», подавления HBsAg.

Пример 2.

Каждую сыворотку вносили в две лунки иммуносорбента тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg», затем в одну из лунок добавляли 10 мкл препарата OCO-HBsAg (20 МЕ/мл), дальнейшую постановку проводили в соответствии с инструкцией по применению. Результат анализа оценивали по ОП сыворотки в лунке (без добавления препарата ОСО-HBsAg) и по ОП сыворотки (с внесенным препаратом ОСО-HBsAg). Критерии отбора сывороток:

1. ОП в лунке с сывороткой без добавления препарата OCO-HBsAg не должна превышать двукратное значение ОП К-тест-системы.

2. ОП в лунке каждой сыворотки с внесенным препаратом ОСО-HBsAg должна соответствовать средней ОП (исследуемых сывороток) ±20%; или ±20% значения 1 МЕ/мл OCO-HBsAg.

Отобранные сыворотки пулировали, центрифугировали, добавляли тимеросал до 0,01%. В обработанный пул добавляли 20-30% (от общего объема приготовленного пула) смеси для разведения. Для приготовления 1 л смеси для разведения пула потребуется: 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН₂PO₄; 17,28 г (0,12 М) Na₂HPO₄·12H₂O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; 0,1 мл 10% раствора тимеросала. Затем готовый раствор разливали по 1,0 мл во флаконы вместимостью 3 см³ (погрешность розлива не более 1%) и лиофилизировали (величина остаточной влажности не более 3%).

Комплект (набор) "OCO-HBsAg" включает:

1. Препарат OCO-HBsAg 20 МЕ/мл, лиофильно высушенный - 1 флакон.

2. Реагент 1 - сыворотка крови человека негативная, лиофильно высушенная - 9 флаконов.

Новым по сравнению с прототипом является:

- использование как плазменного, так и рекомбинанатного HBsAg;

- введение в состав комплекта разводящего раствора (Реагент 1) для приготовления разведений.

Основными аттестуемыми характеристиками ОСО являются: специфическая активность, однородность, стабильность и срок годности.

Согласно основному принципу ВОЗ, активность биологических препаратов не может быть адекватно измерена физическими методами. Эта активность определяется только в сравнении со стандартом. Количественную оценку тестируемого ОСО проводили методом параллельных линий в соответствии с методическими рекомендациями ГИСК им. Л.А.Тарасовича «Статистическая обработка результатов количественного ИФА (оценка линейности, параллельности, определение активности препарата и доверительных интервалов активности» [В.Г.Петухов, «Биопрепарат», № 1 (13), с.19-23, 2004]). Ввиду сложности расчетов и во избежание ошибок при вычислениях использовали компьютерную программу. В данном конкретном случае концентрацию препарата ОСО HBsAg определяли в сравнении с международным стандартом (Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, «NIBSC», United Kingdom, cod number 00/588) - 20±0,5 МЕ/мл при доверительной вероятности 0,95.

Активность кандидата в ОСО HBsAg (с.5) определяли в сравнении с международным стандартом, содержащим 33IU/vial. Для этого приготовили пять разведений международного стандарта и испытуемого кандидата в ОСО с.5 в трех повторностях:

Приготовление разведений международного стандарта:

Доза	Приготовление разведения
1,6 ме	1/20,6 раз
0,8 ме	1/41,2 раз
0,4 ме	1/82,5 раз
0,2 ме	1/165 раз
0,1 ме	1/330 раз

Каждый образец исследовали в тест-системе «ИФА HBsAg/M» в соответствии с инструкцией по применению. С помощью компьютерной программы «Паралайн» определили наличие линейности и параллельности. Затем построили уравнение зависимости логарифмов ОП ср от логарифмов соответствующих концентраций HBsAg.

Зависимость LN(ОП) от LN активности международного стандарта:

- 1,98	-2,3
- 1,27	-1,6
- 0,57	-0,91
0,124	-0,223
0,813	0,47

Зависимость LN(ОП) от разведения кандидата в ОСО с.5 (Фиг.1):

Развед.	ОП канд	LN (ОП канд)	Ln (сод HBsAg)	сод HBsAg (МЕ)/мл
1\12,5	2,271	0,82	0,47142	1,601915339
1\25	1,148	0,138	-0,204442	0,815462371
1\50	0,576	-0,551	-0,887241	0,41188957
1\100	0,283	-1,26	-1,58986	0,204129639
1\200	0,139	-1,97	-2,29347	0,100963118
у=0,991Х-0,3412

Исходя из полученного содержания HBsAg (ME) в приготовленных разведениях кандидата в ОСО с.5, определили содержание HBsAg во флаконе исследуемого препарата:

Развед.	сод HBsAd (МЕ)/мл	Содерж. HBsAg (МЕ)/мл
1\12,5	1,601915339	20,114
1\25	0,815462371	20,356
1\50	0,41188957	20,47
1\100	0,204129639	20,201
1\200	0,100963118	20,017
20,237 среднее значение

В результате произведенных сравнительных исследований ОСО-HBsAg с.5 и международного стандарта установлено, что содержание HBsAg во флаконе ОСО с.5 соответствует 20±0,5 МЕ/мл.

Препарат ОСО-HBsAg исследовали на однородность, коэффициент вариации составил 11% (количество проверенных флаконов составило 1% от серии). Метод заключается в следующем.

Для исследования на однородность отобрали некоторое количество флаконов (1% от серии), из каждого флакона ОСО-HBsAg приготовили одну концентрацию (например, 1 МЕ). Затем на одном планшете с помощью ИФА исследовали каждый флакон этой концентрации в трех повторах. Получив результат, рассчитали Х среднее, сигму, коэффициент вариации.

После контроля качества лиофильно высушенных компонентов проводили определение стабильности OCO-HBsAg методом ускоренного теста в соответствии с требованиями методических рекомендаций ГИСК им. Л.А.Тарасовича «Определение стабильности отраслевых стандартных образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом» (Автор - В.Г.Петухов, Москва, 2002 г.). Срок годности ОСО - 3 года.

Пример 3.

ОСО-HBsAg с.5	концентрация 0,5 ME
Время (сут)	65°С	55°С	44°C
0	100%	100%	100%
2	98%
6	89%
9	73%	92%
16	65%	89%
23	59%	81%
28		68%	99%
35			96%
45			92%
50			89%

Логарифмы падения активности (Фиг.2):

0	4,6		4,6	4,6
2	4,585
6	4,4886
9	4,2905		4,5218
16	4,1744		4,4886
23	4,0775		4,3944
28	4,2195		4,5951
35			4,5643
45			4,5218
50			4,4886

Константы скоростей дезактивации при выбранных температурах (Фиг.3):

Вывод: срок годности ОСО HBsAg с.5 составляет 3 года.

Подготовка и условия применения стандартного образца

При работе с OCO-HBsAg все измерительные приборы и устройства должны быть аттестованы и проверены.

Приготовление регидратированного Реагента 1: во флакон с сухим Реагентом 1 внести 1,0 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать до полного растворения содержимого флакона. Регидратированный раствор Реагента 1 представляет собой прозрачный бесцветный или светло-желтого цвета раствор, без осадка, допускается опалесценция. Хранить при (6±2)°С не более 1 недели.

Приготовление раствора ОСО-HBsAg, концентрация 20 МЕ/мл: во флакон с ОСО-HBsAg внести 0,8 мл рабочего раствора Реагента 1 и тщательно перемешать до полного растворения содержимого флакона. Регидратированный препарат OCO-HBsAg представляет собой прозрачный бесцветный или желтоватого цвета раствор, без осадка, допускается опалесценция. Возможно хранение раствора OCO-HBsAg, предварительно разлитого по аликвотам, при температуре не выше минус 20°С в течение 1 месяца или при минус 70°С - до конца срока годности препарата. Допускается однократное оттаивание-замораживание препарата.

Приготовление разведений OCO-HBsAg: для определения чувствительности диагностических наборов, предназначенных для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В или количественного содержания HBsAg в испытуемых образцах, готовят ряд разведений ОСО-HBsAg на регидратированном Реагенте 1 с концентрацией антигена, например, 0,05; 0,1; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 МЕ/мл. Таких разведений готовят не менее 4-х и каждое разведение не менее чем в 3-х повторностях.

Приготовление разведений исследуемого образца: для определения количественного содержания HBsAg величина оптической плотности образца (ОП) при используемых длинах волн должна находиться строго в диапазоне от 0,1 до 2,5 оптических единиц (о.е.). Если ОП исследуемого образца выходит за рамки указанного диапазона, подбирают эмпирическим путем разведение образца, например 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000.

Готовят последовательные разведения так, чтобы оптические плотности приготовленных разведений (не менее 3-х повторностей) лежали в линейной области данного прибора.

Каждое разведение стандартного/исследуемого образца следует готовить в отдельном флаконе или пробирке. При этом каждую повторность готовят отдельно из исходного стандартного образца, чтобы оценить разброс результатов анализа при разведении стандартного/исследуемого образца.

Постановка иммунологических тестов

При определении чувствительности иммуноферментной тест-системы и количества HBsAg в исследуемом образце ИФА проводят в соответствии с требованиями, изложенными в инструкции по применению используемой тест-системы.

Для определения чувствительности иммуноферментной тест-системы разведения ОСО-HBsAg вносят не менее чем в 3 лунки иммуносорбента.

Для оценки количественного содержания HBsAg в пробе в лунки иммуносорбента исследуемый образец необходимо вносить не менее чем в 3-х повторностях, на этом же планшете параллельно аналогично исследуется каждое разведение ОСО-HBsAg.

Учет и обработка результатов

При оценке чувствительности тест-системы этот показатель соответствует среднему наименьшему количеству HBsAg, которое определяется данной тест-системой.

Для ориентировочной оценки количественного содержания HBsAg строят график, на оси абсцисс которого откладывают логарифмы концентраций ОСО-HBsAg, на оси ординат - значения логарифмов ОПср., соответствующее этим концентрациям HBsAg, и получают кривую, по которой вычисляют концентрацию HBsAg в исследуемом образце, исходя из величины логарифма его оптической плотности. Если образец предварительно разводился, то в этом случае значение концентрации, полученной на оси абсцисс, умножают на кратность разведения. При этом надо иметь в виду, что погрешность данной оценки может достигать значительных величин (до 20% и более).

Для точного количественного определения концентрации HBsAg в исследуемых образах необходимо использовать метод серийных разведений этих образцов параллельно с серийными разведениями ОСО. При этом для расчета концентрации HBsAg и ее 95%-го доверительного интервала следует использовать метод дисперсионного анализа [В.Г.Петухов, «Биопрепарат», №1 (13), с.19-23, 2004]. Ввиду сложности расчетов и во избежание ошибок при вычислениях рекомендуется использовать компьютерную программу.

1. Способ изготовления отраслевого стандартного образца (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для контроля качества тест-систем, а также для определения количественного содержания антигена в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что в 1%-ный водный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 0,75% глицина, 0,01% тимеросала, вносят плазменный или рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В HBsAg до концентрации 20 МЕ/мл, перемешивают, не допуская вспенивания, в течение 30-60 мин и лиофилизируют.

2. Набор для контроля качества тест-систем, служащих для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также для определения количественного содержания антигена HBsAg в сыворотке (плазме) и препаратах крови человека методом ИФА, отличающийся тем, что он включает отраслевой стандартный образец (ОСО) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), полученный по п.1, и реагент 1, представляющий собой сыворотку крови человека негативную, лиофильно высушенную, приготовленную путем центрифугирования отобранных негативных сывороток крови человека, пулирования, добавления тимеросала до 0,01%, причем в обработанный пул добавляли 20-30% от его общего объема смеси для разведения, включающей 23,36 г (0,4 М) NaCl; 0,16 г (0,002 М) KCl; 0,16 г (0,001 М) КН₂PO₄; 17,28 г (0,12 М) Na₂HPO₄·12H₂O; 10 г (1%) бычьего сывороточного альбумина; 0,5 мл (0,05%) ЭДТА-этилендиаминтетрауксусной кислоты; 0,1 мл 10% раствора тимеросала, с последующей лиофилизацией готового раствора до величины остаточной влажности не более 3%.