Способ изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота

Авторы патента:

C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

A61P31/12 - противовирусные средства

A61K39/295 - поливалентные вирусные антигены (коровьей оспы или оспы A61K 39/285); смеси вирусных и бактериальных антигенов

Владельцы патента RU 2362585:

Белоусова Раиса Васильевна (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ включает культивирование штамма В-10 аденовируса в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 6-7 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена. Дополнительно осуществляют культивирование штамма Оригон вируса вирусной диареи в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 7-8 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена. После чего полученные антигены аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часов при рН 7,2-7,4. Концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем - 6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия. Смешивают в равных объемах. Добавляют официнальный адъювант гидроокись алюминия до 1,5-2,5% конечной концентрации в готовой вакцине. Способ обеспечивает получение безвредной вакцины, создающей в организме длительный и напряженный иммунитет одновременно против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Вирусная диарея и аденовирусная инфекция крупного рогатого скота - остро протекающие, контагиозные вирусные болезни, главным образом телят, характеризующиеся поражением органов респираторно-кишечного тракта. Болезни регистрируются во всех странах мира, в том числе и в России. Вирусы вызывают заболевания у крупного рогатого скота, поражая от 40 - 60% животных и обуславливая в 20-30% случаев вспышки респираторно-кишечных болезней. Как правило, данные вирусы вызывают заболевания в ассоциации в 80-85% случаях, при этом смертность телят достигает 27-30% (1).

Исходя из этого, профилактика данных инфекций в хозяйствах Российской Федерации является актуальной задачей и решение ее позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающий антигены аденовируса КРС штамм В-10, который инактивировали димером этиленимином (ДЭИ) в конечной концентрации 0,1% и в качестве адъюванта использовали аэросил (2)

Известен также способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи, включающий антигены вируса диареи КРС штаммы Оригон, С-24 V, Нью-Йорк, которые инактивировали формалином, и в качестве адъюванта была использована гидроокись алюминия (3).

В задачу наших исследований входило разработать способ получения безвредной вакцины на основе синергической ассоциации вируса вирусной диареи и аденовируса для специфической профилактики смешенной инфекции крупного рогатого скота, обеспечивающей создание в организме животных длительный, напряженный иммунитет против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Это достигается благодаря тому, что аденовирус первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД ₅₀/ мл инактивируют формалином до конечной концентрации 0,2-0,3% и концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10%, дополнительно вводят штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл, инактивацию проводят формалином 0,2-0,3% концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часа при рН 7,2-7,4, далее полученные антигены концентрируют 8% полиэтиленгликолем - 6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl, затем антигены смешивают 1:1 и добавляют официнальный адъювант ГОА до 1,5-2,0% конечной концентрации в готовой вакцине.

Пример 1. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с минимальными значениями параметров.

Приготовление нативной суспензии аденовируса, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

Аденовирус крупного рогатого скота (штамм первого серотипа В-10) размножают в монослойной перевиваемой культуре клеток почек теленка Taurus-1 (Т-1), выращенной в матрасах объемом 1,5 литра, на ростовой синтетической среде ИГЛА, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики. Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 300-400 тыс. клеток на 1 мл среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду ИГЛА в количестве 200-250 мл, в которую предварительно вносят вирус с инфекционным титром 6-7,0 lg ТЦД ₅₀/ мл из расчета 10 мл на 500 мл среды. Матрасы инкубируют при температуре 37°С, ЦПД наступает в течение 2-3-х дней после заражения. Цитопатическое действие характеризуется округлением клеток в виде гроздьев винограда и отделением их от стекла, с последующей полной дегенерацией. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта. Титр вируса должен составлять не ниже 6,0 lg ТЦД ₅₀/мл.

Освобождение вируса из клеток осуществляют путем трехкратного замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 минут.

Вирус КРС вирусной диареи штамма «Оригон» размножают в монослойной перевиваемой культуре клеток КСТ, выращенной на матрасах объемом 1,5 литра, на ростовой синтетической среде 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики. Культуру выращивают в течение 2-3 суток при посевной концентрации 100-200 тыс. клеток на 1 мл среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду 199 в количестве 200-250 мл, в которую предварительно вносят вирус с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл из расчета 1,5 мл на 500 мл среды. Матрасы инкубируют при температуре 37°С, ЦПД наступает в течение 1-2 дня. Цитопатическое действие характеризуется округлением клеток и отделением их от стекла, с полной последующей дегенерацией. Сбор культуральной жидкости проводят в период выраженного цитопатического эффекта. Инфекционный титр вируса должен составлять не ниже 7,0 lg ТЦД ₅₀/мл.

Далее освобождают вирус из клеток путем трехкратного замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 минут.

Инактивация вирусов

Вируссодержащие суспензии инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2%, при температуре 37°С в течение 72 часов с постоянным перемешиванием при рН 7,2.

Контроль полноты инактивации вирусов проводят на соответствующих культурах клеток, в трех последовательных пассажах. Вирусы считают инактивированными при отсутствии ЦПД в трех пассажах.

Далее инактивированные аденовирус штамма (Bovine-10) и вирус вирусной диареи штамма «Оригон» концентрируют в 5 раз исходного объема полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5 М NaCI. Затем полученные антигены смешивают в равных объемах 1:1 и добавляют официнальный адъювант ГОА до 1,5% конечной концентрации в готовой вакцине. После этого проверяют на бактериальную и грибковую контаминацию, делая посевы каждой серии вакцины на питательные среды МПБ, МПА, МППВ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по две пробирки. Посевы со средами выдерживают в термостате при температуре 37°С, а с агаром Сабуро - при температуре 20-22°С в течение 15 суток.

Для проведения на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 17-18 г, вводят вакцину в дозе 0,2 см³ подкожно. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0,4 см³двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител должны быть не ниже 1:128 к вирусу ВД и 1:256 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (проективный уровень антител).

Результаты контроля экспериментальных серий инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота показали, что все серии биопрепарата были стерильными, безвредными и антигенно активными (титры антител составили 1:1024-1:4096). Срок хранения не менее 12 месяцев (см. таблицу).

Пример 2. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с минимальными значениями параметров (см.табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7,5 lg ТЦД ₅₀/ мл, формалин в конечной концентрации 0,25%, инактивацию проводят при температуре 37,5°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в концентрации 9,0% в растворе 0,5 М NaCI, содержание ГОА 2,0% в готовой вакцине. Титр антител 1:64-1:128.

Пример 3. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с максимальными значениями параметров (см. табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 8,0 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,3%, инактивацию проводят при температуре 38°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в конечной концентрации 10,0% в растворе 0,6 М NaCI, содержание ГОА 2,5% в готовой вакцине. Титр антител 1: 1024-1:4096.

Пример 4. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота со значениями параметров ниже минимальных (см. табл.).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 6,0 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,1%, инактивацию проводят при температуре 36°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в конечной концентрации 7,0% в растворе 0,4 М NaCl, содержание ГОА 1,5% в готовой вакцине.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0.4 мл двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител 1:16 к вирусу ВД КРС и 1:64 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (непротективный уровень антител).

Пример 5. Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота со значениями параметров выше максимальных (табл.1).

Вакцину готовят по способу, описанному по примеру 1, за исключением того, что для проведения инактивации берут штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 8,5 lg ТЦД ₅₀/мл, формалин в конечной концентрации 0,35%, инактивацию проводят при температуре 39°С, концентрирование проводят полиэтиленгликолем в концентрации 11,0% в растворе 0,7 М NaCl, содержание ГОА 3,5% в готовой вакцине.

Антигенную активность вакцины контролируют на пяти кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 0.4 см³двукратно с интервалом 14-15 дней. Через 21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку для определения уровня специфических антител против аденовируса и вируса вирусной диареи. Титры антител 1:32-1:64 к вирусу ВД КРС и 1:64-1:128 к аденовирусу КРС в реакции нейтрализации (непротективный уровень антител).

Предложенный способ обеспечивает получение безвредной вакцины, создающей в организме длительный и напряженный иммунитет одновременно против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Вакцина, полученная предложенным способом, апробирована нами с положительным результатом с 2004-2007 гг. на кафедре ветеринарной вирусологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина и хозяйстве «ООО Аграрное» Орехово-Зуевского района.

Вакцина, полученная предложенным способом, позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации, и найдет применение в неблагополучных хозяйствах.

ТАБЛИЦА
Технологические показатели параметров изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
Технологические показатели	Изготовление вакцины
Технологические показатели	С минимальными значениями параметров	С оптимальными значениями параметров	С максимальными значениями	Со значениями параметров
ниже миниальных	выше максимальных
Штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром	7 lg ТЦД ₅₀/мл	7,5 lg ТЦД ₅₀/мл	8 lg ТЦД ₅₀/мл	6 lg ТЦД ₅₀/мл	8,5 lg ТЦД ₅₀/мл
Инактивацию проводят формалином концентрации	0,2%	0, 25%	0,3%	0,1%	0,35%
при температуре	37°С	37,5°С	38°С	36°С	38°С
Полученный антиген штамма «Оригон» концентрируют полиэтиленгликолем в растворе 0,5-0,6 М NaCl	8% 0,5 М	8,5% 0,5 5 М	9% 0,6 М	7,5% 0,4 М	9,5% 0,7 М
адъювант ГОА в концентрации	до 2%	до 2,5%	до 3%	до 1,5%	до 3,5%
Стабильность вакцины при хранении	Не менее 12 месяцев	Не менее 12 месяцев	Не менее 12 месяцев	Менее 12 месяцев	Не менее 12 месяцев
Антигенная активность вакцины	Титр антител 1:64-1:128	Титр антител 1:1024-1:4096	Титр антител 1:1024-1:4096	Титр антител 1:16-1:32	Титр антител 1:32-1:128
Безвредность	безвредная	безвредная	безвредная	безвредная	безвредная
Стерильность	стерильная	стерильная	стерильная	стерильная	стерильная
Иммуногенность	85-90%	85-90%	85-90%	60%	74%

Источники информации

1. Автореф. дисс. к.в.н. Курбанбекова З.Д. Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана. М. - 2007 гг. - с.9.

2. Дисс. к.б.н. Литвинов О.Б. Экспериментальные исследования по разработке инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. М. - 1984 гг. - с.39.

3. Книга. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных. М. - ВНИТИБП. - 1998 гг. - с.139.

Способ изготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающий культивирование штамма В-10 аденовируса в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 6-7 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют культивирование штамма Оригон вируса вирусной диареи в культуре клеток, сбор культуральной жидкости с инфекционным титром вируса 7-8 lg ТЦД₅₀/мл и получение антигена, после чего полученные антигены аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 ч при рН 7,2-7,4 и концентрируют в 5 раз полиэтиленгликолем-6000 в конечной концентрации 10% и 8% соответственно в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия, смешивают в равных объемах, добавляют официнальный адъювант гидроокись алюминия до 1,5-2,5% конечной концентрации в готовой вакцине.

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии. .

Штамм вируса гриппа птиц a/chicken/kurgan/05/2005 субтип h5n1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа // 2361917

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. .

Оптимизированная экспрессия l1 hpv45 в дрожжах // 2360001

Изобретение относится к области вирусологии и медицины. .

Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки heliothis armigera hbn, используемый для получения инсектицидного препарата // 2359031

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии. .

Универсальная вакцина против вируса гриппа птиц // 2358981

Изобретение относится к области генной инженерии и вирусологии. .

Способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц и вакцина инактивированная эмульгированная против гриппа птиц // 2358760

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая hpv31 l1, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, вирусоподобная частица и способ ее получения, вакцина, фармацевтическая композиция и способы с их использованием // 2356943

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. .

Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/краснодар/101/59/35 (h2n2) для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины // 2354695

Изобретение относится к медицинской вирусологии. .

Рекомбинантные векторы на основе "живого" вируса оспы домашней птицы и их применение в фармацевтических композициях против вируса гепатита с // 2353651

Изобретение относится к вирусологии и генетической инженерии. .

Штамм туляремийного бактериофага гал // 2352633

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителя туляремии, выделяемого из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

Применение вируса миксомы для терапевтического лечения рака и хронической вирусной инфекции // 2362584

Изобретение относится к области медицины и касается применения вируса миксомы для терапевтического лечения рака. .

Гомеопатические композиции доктора л.в. космодемьянского для лечения и профилактики респираторных воспалительных заболеваний и их осложнений, а также способы их применения // 2362575

Изобретение относится к созданию комплексных гомеопатических средств для профилактики и лечения респираторных воспалительных заболеваний. .

Замещенные дигидрохиназолины с противовирусными свойствами // 2360912

Изобретение относится к новым замещенным дигидрохиназолинам формулы (I) и его фармацевтически приемлемым солям, обладающим противовирусным действием. .

Применение мелоксикама для лечения респираторных заболеваний у свиней // 2360680

Изобретение относится к применению мелоксикама или его фармацевтически приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики респираторных заболеваний у свиней.

Бициклические производные имидазола в качестве средства против вирусов семейства flaviviridae // 2355687

Изобретение относится к области фармацевтической химии, в особенности к соединениям, композициям и способам лечения вирусных инфекций у млекопитающих, опосредованных, по меньшей мере частично, вирусом из вирусов семейства Flaviviridae.

Антисептическое средство профилактики гриппа животных и птиц // 2355391

Изобретение относится к области сельского хозяйства, преимущественно к ветеринарии, и может быть использовано при возникновении и угрозе распространения гриппа животных и птиц.

Полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид вируса папилломы человека, ее применение, а также содержащие ее вектор и фармацевтическая композиция // 2354701

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. .

Гетероциклилэфирзамещенные имидазохинолины // 2351598

Изобретение относится к имидазохинолинам, имеющим формулу (I) и (II), а также тетрагидроимидазохинолинам, имеющим формулу (III), в которых радикалы и символы имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Производные тетрагидрохинолина и фармацевтическая композиция на их основе для лечения и профилактики вич-инфекции // 2351592

Производные тетрагидрохинолина, демонстрирующие защитное от вич-инфекции действие // 2350604

Изобретение относится к соединениям общей формулы где t равен 0, 1 или 2; каждый R независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, циклоалкил, -RaAy, -Ra OR5; n равен О; R2 выбран из группы, состоящей из Н, возможно замещенного алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, -RaAy, -RaOR5, причем R 2 не является амином или алкиламином, или не замещен амином или алкиламином; R3 представляет собой Н, возможно замещенный алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, -RaAy, -Ra OR5, где, когда p равен 0, R 3 не является амином или алкиламином, или не замещен амином или алкиламином; каждый R4 независимо представляет собой галоген, галогеналкил, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, -Ay, -NHAy, -Het, -NHHet, -NR6 R7, -RaNR 6R7, -RaC(O)R 10, -C(O)R10, -СО 2R10, -RaCO 2R10, -C(O)NR6 R7, -C(O)Ay, -C(O)Het; m равен 0, 1 или 2; каждый R5 независимо представляет собой Н, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, -Ra Ay или -Ау; p равен 0 или 1; Y представляет собой -NR 10-, -C(O)NR10-, -NR 10C(O)-, -C(O)-, -С(O)O-, -NR10C(O)N(R 10)2-; Х представляет собой -N(R 10)2, -RaN(R 10)2, -AyN(R10 )2, -RaAyN(R 10)2, -AyRa N(R10)2, -R aAyRaN(R10) 2, -Het, -RaHet, -HetN(R 10)2, -RaHetN(R 10)2, -HetRa N(R10)2, -R aHetRaN(R10 )2, -HetRaAy или HetRaHet, где, когда p равен 0, тогда X не является -N(R10)2 ; каждый Ra независимо представляет собой возможно замещенный алкилен, циклоалкилен, алкенилен, циклоалкенилен или алкинилен; каждый R10 независимо представляет собой Н, алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, циклоалкенил, -R aциклоалкил, -RaOH, -R aOR5, -RaNR 6R7 или -Ra Het; каждый из R6 и R7 независимо выбран из Н, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, циклоалкенила, группы -Raциклоалкил, -R aOH, -RaOR5 , -Het, -RaHet; каждый Ay независимо представляет собой возможно замещенную арильную группу; и каждый Het независимо представляет собой возможно замещенную 4-, 5-или 6-членную гетероциклильную или гетероарильную группу, где гетероатомы выбраны из N и О; к фармацевтической композиции для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции, к применению соединений формулы I, в изготовлении лекарственного средства, а также к способам получения соединения формулы I.

Композиции, включающие антигены neisseria meningitidis из серогрупп в и с и дополнительный антиген // 2361609

Изобретение относится к способу производства композиции по изобретению, включающей смешивание компонентов (а), (b) и (с). .