Способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений цнс у новорожденных

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и касается способа ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных. Способ заключается в том, что в пуповинной крови при рождении ребенка определяют относительное содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов и при его значении, равном 7,1% или более, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС легкой степени тяжести, а при значении показателя, равном 4,4% или менее, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести. Использование способа позволяет при рождении ребенка выявить перинатальное гипоксическое поражение с высокой точностью. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии и детской неврологии, и может быть использовано для диагностики легкой и средней степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных.

Актуальность разработки способа определяется ростом частоты перинатальных поражений ЦНС (ПП ЦНС), высокой летальностью и инвалидизацией при них [1]. Диагностика перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных детей нередко бывает затруднена вследствие не всегда четкой и ясной картины неврологических симптомов [2]. Клинические проявления патологии нервной системы у новорожденных не всегда отражают истинную тяжесть состояния, степень поражения ЦНС и дальнейший прогноз развития ребенка [3]. Поэтому разработка способа ранней дифференциальной диагностики ПП ЦНС гипоксического генеза легкой и средней степени тяжести у новорожденных является актуальной. Способ позволит диагностировать перинатальные поражения ЦНС с определением их степени тяжести в первые сутки жизни, назначать адекватную терапию церебральных нарушений и предотвратить инвалидизирующие последствия.

Известен способ диагностики тяжелых перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных путем исследования в сыворотке периферической крови концентрации белка S-100 в динамике на 1-е, 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки жизни. При повышении содержания белка S-100 относительно исходного уровня, превышающего норму, диагностировались тяжелые перинатальные поражения ЦНС [Голосная Г.С., Петрухин А.С., Маркович К.А., Трифонова О.Е. Изменение уровня белка S-100 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС // Педиатрия. - 2004. - № 1. - С.10-15].

Недостатки способа:

1) уровень белка S-100 достоверно повышается только при тяжелых формах перинатальных поражений ЦНС, что не позволяет использовать его для диагностики перинатальных поражений ЦНС легкой и средней степени тяжести;

2) для осуществления метода требуется пятикратный забор крови, что наносит болевую травму новорожденному и может отрицательно сказаться на течении основного заболевания;

3) высокая экономическая стоимость способа (необходимость закупки дорогостоящих специальных наборов реактивов для определения уровня белка S-100 методом непрямого иммуноферментного анализа).

Известен способ диагностики степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС у новорожденных детей путем определения уровня нитритов в слюне новорожденных детей, по которому судят о содержании NO в слюне, и при значении NO на 1-2 день жизни 0,66±0,14 мкг/мл и NO в возрасте 28 дней 1,43±0,2 мкг/мл диагностируют гипоксию легкой степени тяжести, NO на 1-2 день жизни 1,17±0,26 мкг/мл и NO в возрасте 28 дней 2,0±0,23 мкг/мл диагностируют гипоксию средней степени тяжести и NO на 1-2 день жизни 1,9±0,3 мкг/мл и NO в возрасте 28 дней 4,2±0,8 мкг/мл диагностируют тяжелую гипоксию [Костылева А.В., Философова М.С., Шниткова Е.В. Способ диагностики степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС у новорожденных детей // БИПМ. - 2005. - № 21].

Недостатки способа:

1) NO не является специфичным показателем, т.к. его содержание может изменяться при различных патологических состояниях, в частности при гастродуоденальных заболеваниях [Краснова Е.Е., Чемоданов В.В., Егорова Е.Ю., Горнаков И.С., Томилова И.К., Алексахина Е.Л. Характеристика гемато-саливарного барьера у детей с гастродуоденальными заболеваниями // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 3. - С.13-16];

2) не регламентируется время суток для забора слюны, т.к. содержание NO в секрете слюнных желез может быть различным в зависимости от времени суток [Мячина О.В., Зуйкова А.А., Пашков А.Н., Парфенова Н.В., Чепрасова А.А., Трофимова О.Д. Асинхронный характер деятельности больших слюнных желез. Экскреция оксида азота // Буковинский медицинский вестник. - 2006. - Т.10. - № 4. - С.106-109];

3) не позволяет рано диагностировать перинатальные поражения ЦНС, т.к. требуется повторное исследование на 28 день жизни.

Наиболее близким по техническому решению является способ диагностики степени тяжести перинатальных поражений ЦНС у новорожденных детей путем определения содержания малонового диальдегида (МДА) в ликворе и венозной крови путем расчета отношения первого показателя ко второму и при его значении от 0,6 до 0,9 диагностируют легкую, от 1,0 до 1,7 - среднетяжелую, от 1,8 и более - тяжелую степень поражения ЦНС [Авторское свидетельство № 1516984. Способ диагностики степени тяжести перинатальных поражений ЦНС у новорожденных / Резник Б.Я., Пасенюк Т.А., Ефименко Н.И. (СССР) // Открытия. Изобретения. - 1989. - №39. - С.217].

Недостатки способа:

1) высокая травматичность способа;

2) необходим забор ликвора и венозной крови;

3) не указывается день жизни, на который проводится исследование;

4) не указывается точность данного метода.

Данный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога (прототипа). Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим решением заявляемого способа является ранняя диагностика перинатальных гипоксических поражений ЦНС легкой и средней степени тяжести у доношенных новорожденных путем определения в пуповинной крови при рождении относительного содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов, при значении показателя, равном 7,1% или более, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС легкой степени тяжести, а при значении показателя, равном 4,4% или менее, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести с точностью 87,5%.

Новизна способа

Впервые предлагается ранняя (при рождении ребенка) диагностика перинатальных гипоксических поражений ЦНС легкой и средней степени тяжести у доношенных новорожденных по определению относительного содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови. Известно, что популяция CD56+ лимфоцитов обладает слабовыраженным цитотоксическим действием, но является источником разнообразных цитокинов, таких как GM-CSF, IFNγ, TNFα, IL-2, LIF, и такого важного регулятора роста, как TGF-β [4]. Кроме того, TGF-β обладает иммуносупрессивным действием [5; 6]. FasL, экспрессирующийся на поверхности эффекторных клеток, защищает их от запуска программы апоптоза [7]. По литературным данным, одним из возможных механизмов повреждения нервной ткани при перинатальных гипоксических поражениях ЦНС является синтез аутоантител против антигенов нервной ткани [8].

Учитывая эти данные, можно предположить, что высокое содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови новорожденных детей с ПП ЦНС легкой степени тяжести снижает риск развития аутоиммунных реакций в ткани мозга. При этом у детей с ПП ЦНС средней степени тяжести этот механизм не реализуется, т.к. относительное содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови у них значительно снижено.

Высокий уровень CD56+ лимфоцитов ассоциируется с противовирусным ответом [9]. Значительное повышение CD56+ лимфоцитов в периферической крови было выявлено у новорожденных с малыми аномалиями развития сердца [10]. Снижение относительного содержания CD56+лимфоцитов в периферической крови было выявлено у детей с впервые диагностированным сахарным диабетом 1-го типа [11]. Однако изменения содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови для определения степени тяжести ПП ЦНС используется впервые.

Отличительные признаки способа:

установлен диагностический параметр относительного содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов пуповинной крови, при значении которого, равном 7,1% или более, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС легкой степени тяжести, а при значении показателя, равном 4,4% или менее, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести.

Способ осуществляется следующим образом.

1. При рождении ребенка производят забор в пробирку 0,5 мл пуповинной крови.

2. Выделение лимфоцитов из пуповинной крови осуществляется стандартным методом - центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина [8].

3. В 1 пробирку, содержащую 100 мкл лимфоцитов в концентрации 1×10⁶ кл/мл, добавляют 20 мкл моноклональных анти-СD56 AT, меченных FITC или РЕ, и 20 мкл моноклональных анти-СD95L AT, меченных FITC или РЕ (в зависимости от первой метки). Клетки инкубируют с моноклональными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего отмывают 1 раз 1 мл физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут. Клетки в пробирках ресуспендируют в 500 мкл физиологического раствора [9].

4. Учет реакции проводят на проточном цитофлуориметре, определяя в лимфоцитарном гейте процентное (относительное) содержание CD56+CD95L+ клеток.

5. Способ осуществляется в течение 1 часа 10 минут.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Ребенок Л. родился от III беременности, осложнившейся ОРВИ в 6-7 недель, угрозой прерывания в 25 и 36 недель, гестозом легкой степени тяжести. Своевременные III роды в 38-39 недель. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Масса тела при рождении 3000 г., рост 50 см. Большой родничок 1,5×1,5 см. В первые сутки жизни состояние ребенка удовлетворительное.

При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось относительное содержание CD56+CD95L+, равное 11,2%, что выше заявляемого (7,1%) уровня, как критерия ранней диагностики перинатального гипоксического поражения ЦНС легкой степени тяжести.

На 2 сутки жизни состояние ребенка ухудшилось до средней тяжести, появилась гипервозбудимость, тремор подбородка и рук, акроцианоз. На основании клинической картины и данных нейросонографии поставлен диагноз: хроническая внутриутробная гипоксия плода, перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия I степени гипоксически-ишемического генеза, гипертензивный синдром, синдром нейрорефлекторной возбудимости, что соответствует легкой степени тяжести.

Таким образом, способ ранней диагностики легкой степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС у новорожденных по предложенному методу подтвердился.

Пример 2. Ребенок Т. родился от I беременности, протекавшей без осложнений. Своевременные I роды в 38-39 недель. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Масса тела при рождении 3150 г., рост 49 см. Состояние ребенка при рождении удовлетворительное.

При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось относительное содержание CD56+CD95L+, равное 7,1%, что соответствует заявляемому (7,1%) уровню, как критерию ранней диагностики перинатального гипоксического поражения ЦНС легкой степени тяжести.

На 2 сутки жизни - тремор подбородка и рук, мышечная дистония. Большой родничок 2,5×2,5 см. На основании клинической картины и данных нейросонографии поставлен диагноз: перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия I степени гипоксически-ишемического генеза, гипертензивный синдром, синдром нейрорефлекторной возбудимости, что соответствует легкой степени тяжести.

Таким образом, способ ранней диагностики легкой степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных по предложенному методу подтвердился.

Пример 3. Ребенок Г. родился от IV беременности, протекавшей на фоне ожирения II, анемии I степени, осложнившейся гестозом средней степени тяжести. Своевременные I роды в 40 недель. Оценка по шкале Апгар 5-6 баллов. Масса тела при рождении 3600 г., рост 56 см. При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось относительное содержание CD56+CD95L+, равное 2,6%, что ниже заявляемого (4,4%) уровня.

Общее состояние ребенка при рождении средней степени тяжести. Двигательная активность снижена, крик громкий. В динамике наблюдения появилась мышечная дистония, больше в дистальных отделах конечностей, вздрагивания, акроцианоз. Большой родничок 2×2 см, напряженный.

На третьи сутки жизни проведена нейросонография. На основании полученных данных и с учетом клинической картины был поставлен диагноз: хроническая внутриутробная гипоксия плода, перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия II степени гипоксически-ишемического генеза, гипертензивно-гидроцефальный синдром, синдром угнетения. Заключение: диагностируется перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести.

Таким образом, способ ранней диагностики средней степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных по предложенному методу подтвердился.

Пример 4. Ребенок П. родился от VI беременности, протекавшей на фоне анемии II степени, гипертонической болезни и осложнившейся гестозом средней степени тяжести. Своевременные IV роды в 40 недель. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Масса тела при рождении 3600 г., рост 56 см. Общее состояние при рождении удовлетворительное.

При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось относительное содержание CD56+CD95L+, равное 4,4%, что соответствует заявляемому (4,4%) уровню. Заключение: диагностируется перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести.

На 2-е сутки жизни состояние ребенка ухудшилось. Появилась вялость, гиподинамия, общая мышечная гипотония, гипорефлексия, отмечалось снижение рефлексов сосания. Большой родничок 2×2 см.

На третьи сутки жизни проведена нейросонография. На основании полученных данных и с учетом клинической картины был поставлен диагноз: хроническая внутриутробная гипоксия плода, перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия II степени гипоксически-ишемического генеза, синдром угнетения. Заключение: диагностируется перинатальное гипоксическое поражение ЦНС средней степени тяжести.

Таким образом, способ ранней диагностики средней степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных по предложенному методу подтвердился.

Пример 5. Ребенок Б. родился от II беременности, осложнившейся угрозой прерывания в 12 недель. Своевременные II роды в 38 недель. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Масса тела при рождении 3200 г., рост 51 см. Состояние ребенка при рождении оценено как удовлетворительное. При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов, равное 5,6%, что ниже заявляемого при диагностике ПП ЦНС легкой степени (7,1%) и выше заявляемого для диагностики ПП ЦНС средней степени тяжести (4,4%) уровня. Заключение: здоровый новорожденный.

На протяжении неонатального периода при осмотре неонатолога и невролога ребенок здоров.

Таким образом, способ ранней диагностики перинатальных поражений ЦНС у новорожденных по предложенному методу подтвердился.

Преимущества способа.

1. Возможность ранней (при рождении) диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных.

2. Высокая точность - 87,5%.

3. Простота, быстрота (1 час 10 минут) и доступность выполнения методики.

4. Исследуется малый объем крови (0,5 мл).

5. Предлагаемый способ нетравматичен.

6. Дает возможность своевременно провести лечебные мероприятия и скорректировать тактику лечения в зависимости от степени тяжести поражения ЦНС, что позволит предупредить тяжелые последствия перинатальной патологии ЦНС.

Указанным способом обследовано 40 новорожденных детей.

Группа обследованных	Общее количество обследованных	Количество обследованных с подтвердившимся диагнозом	Точность способа (%)	Коэффициент достоверности
Новорожденные дети с ПП ЦНС со значением CD56+CD95L+≥7,1 или ≤4,4%	40	35	87,5	Р<0,01

Использованная литератуза

1. Скворцов И.А., Руденская Г.Е., Осипенко Т.Н и др. // Журнал невропатологии и психиатрии. - 1990. - Т.90, № 8. - С.5-10.

2. Барашнев Ю.И. Гипоксическая энцефалопатия: гипотезы патогенеза церебральных расстройств и поиск методов лекарственной терапии // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2002. - № 1. - С.6-13.

3. Баканов М.И. Алатырцев В.В., Подкопаев В.Н. Новые биохимические критерии диагностики и прогноза перинатальных поражений ЦНС у новорожденных детей // Педиатрия. - 1999. - № 6. - С.33-37.

4. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. - М.: РГМУ, 2001. - 158 с.

5. Ярилин А.А. Коррекция эндогенной выработки гормонов тимуса // Anternational J. Immunorehabil. - 1998. - Vol.10. - P.8-18.

6. Reinhold D, Biton A, Pieper S, Lendeckel U, Faust J, Neubert K, Bank U, Täger M, Ansorge S, Brocke S. Dipeptidyl peptidase IV (DP IV, CD26) and aminopeptidase N (APN, CD 13) as regulators of Т cell function and targets of immunotherapy in CNS inflammation // Int Immunopharmacol. - 2006. - Dec 20; 6(13-14). - P.1935-42.

7. Фильченков А.А., Степанов Ю.М., Липкин В.М., Кушлинский Н.Е. Участие системы Fas/Fas-лиганд в регуляции гомеостаза и функционирования клеток иммунной системы // Аллергология и иммунология. - 2002. - Т.3, № 1. - С.24-35.

8. Грудень М.А., Шерстнев В.В. Антитела к специфическим антигенам нервной ткани в биологических жидкостях детей как маркеры перинатальных нарушений функций мозга // В кн. «Моноклональные антитела в нейробиологии» / Под ред. М.Б.Штарка, М.В.Старовстиной. - Новосибирск: АО «Офсет», 1995. - 228 С.

9. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: Руководство для врачей. - СПб, 1998. - 113 с.

10. Вторушина В.В. Иммунные аспекты формирования малых аномалий развития сердца: Автореферат дис. канд. мед. наук. - М., 2006. - 20 с.

11. Зак К.П., Грузнов М.А., Афанасьева В.В., Малиновская Т.Н., Попова В.В., Куликовская А.В., Семионова Т.А., Захарченко Т.Ф. Ультраструктура и функции лимфоцитов крови у детей с впервые выявленным нелеченным сахарным диабетом 1-го типа // Проблемы эндокринологии. - 2005. - № 5. - С.8.

Способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что в пуповинной крови определяют относительное содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов и при его значении, равном 7,1% или более диагностируют легкую, а при значении показателя, равном 4,4% или менее среднетяжелую степень перинатального гипоксического поражения ЦНС.