Рекомбинантная плазмидная днк pet-ksi-buf2, кодирующая гибридный белок, содержащий антимикробный пептид буфорин-2, штамм escherichia coli bl21(de3)/pet-ksi-buf2 - продуцент указанного белка и способ получения антимикробного пептида буфорина-2

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к микробиальному продуцированию рекомбинантных белков, и может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pET-KSI-Buf2 размером 4066 п.о., кодирующую гибридный белок KSI-Buf2, содержащий антимикробный пептид буфорин-2. Путем трансформации клеток родительского штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2 получают штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - продуцент гибридного белка, содержащего антимикробный пептид буфорин-2. Затем проводят культивирование штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 с последующим разрушением клеток, выделением и отмывкой телец включения, содержащих гибридный белок KSI-Buf2, солюбилизацией гибридного белка и расщеплением его бромцианом в кислой среде по остатку метионина, растворением целевого пептида и его очисткой методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Изобретение позволяет получить идентичный природному буфорин-2 с высоким выходом и по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению буфорина-2 - антимикробного пептида жабы Bufo bufo gargarisans, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия.

Буфорин-2 (TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK) - фрагмент N-концевой части гистона Н2А жабы дальневосточной Bufo bufo gargarisans [U.S. Pat. No.5,936,063]. Буфорин-2 обладает широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, механизм которого состоит в образовании нестабильных тороидальных пор, быстрой транслокации антибиотика через мембрану и последующем связывании с нуклеиновыми кислотами. Пространственная структура буфорина-2 включает короткий неупорядоченный N-концевой участок (TRSS) и два спиральных участка (RAGLQF и VGRVHRLLRK), разделенных остатком пролина. Эксперименты с укороченными синтетическими производными буфорина-2 показали, что удаление неупорядоченного участка не приводит к снижению антимикробной активности пептида, а минимальным фрагментом, обладающим таковой, является α-спиральный участок VGRVHRLLRK. Среди производных буфорина-2 были найдены пептиды, сохраняющие, в отличие от природного буфорина-2, активность в растворах с высокой концентрацией солей. Запатентован ряд искусственных аналогов буфорина-2 на основе его α-спирального фрагмента, в том числе аналоги, включающие повторяющиеся тетрапептидные участки RLLR [U.S. Pat. No.6,531,446]. Кроме того, заявлен дополнительный набор аналогов [WO 03080652].

Активность в отношении метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus epidermidis создает предпосылки для использования препаратов на основе буфорина-2 в хирургии и трансплантологии. Эксперименты на животных моделях показали, что буфорин-2 способствует снижению концентрации бактериального эндотоксина и фактора некроза опухолей TNF-α в плазме крови, препятствуя, таким образом, развитию септического шока. При совместном применении буфорина-2 с традиционными антибиотиками наблюдается явление синергизма.

Известен способ получения модифицированного буфорина-2, состоящий в экспрессии в Е.coli гибридного белка, содержащего короткий отрицательно заряженный участок, нейтрализующий активность буфорина-2, и катионный участок, соответствующий зрелому пептиду [U.S. Pat. No. 6,183,992, C07K 14/435]. Отрицательно заряженный участок содержит 2 остатка цистеина, участвующих в образовании дисульфидных связей и, таким образом, стабилизирующих структуру телец включения, в которых накапливается белок. Конструируют ген, кодирующий мультимер гибридного белка, в составе которого чередуются указанные выше катионные и анионные участки. Буфорин-2 получают путем расщепления гибридного белка бромцианом по остаткам метионина, ограничивающим с двух сторон участки, соответствующие зрелому пептиду. В качестве метода очистки целевого пептида от основных примесей, в первую очередь от анионного фрагмента, используют ионообменную хроматографию.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения модифицированного буфорина-2, являющийся усовершенствованной разновидностью вышеописанного способа [Lee J.H., Kim M.S., Cho J.H., Kim S.C. Enhanced expression of tandem multimers of the antimicrobial peptide buforin II in Escherichia coli by the DEAD-box protein and trxB mutant // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - Vol.58 (6)]. Используют штаммы E.coli, мутантные по тиоредоксин-редуктазе (TrxB), промотор фага Т7 заменяют промотором tac, а также коэкспрессируют мРНК-стабилизирующий белок.

К недостатку обоих способов можно отнести то, что получаемый пептид не является идентичным природному буфорину-2: после расщепления гибридного белка бромцианом в составе целевого пептида остается дополнительный (22-й) С-концевой остаток гомосерина.

Изобретение решает задачу получения антимикробного пептида буфорина-2, идентичного натуральному.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2 размером 4066 п.о., кодирующей гибридный белок KSI-Buf2, содержащий антимикробный пептид буфорин-2, состоящей из:

- Bg1II/XhoI-фрагмента ДНК, приведенного на фиг.1, содержащего промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность, кодирующую модифицированную кетостероид-изомеразу Pseudomonas testosteroni и буфорин-2, разделенные остатком метионина;

- Bg1II/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pET-KSI-Buf2 клеток Escherichia coli к ампициллину, в качестве генетического маркера;

за счет штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - продуцента гибридного белка, содержащего антимикробный пептид буфорин-2;

а также за счет способа получения антимикробного пептида буфорина-2, включающего культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2, разрушение клеток, выделение и отмывку телец включения, содержащих гибридный белок KSI-Buf2, солюбилизацию гибридного белка и расщепление его бромцианом в кислой среде по остатку метионина, растворение целевого пептида и его очистку методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Преимущество предлагаемого изобретения заключается, во-первых, в том, что в результате осуществления способа получается пептид, полностью идентичный природному буфорину-2. На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность гибридного белка KSI-Buf2, содержащего буфорин-2, и соответствующая ей нуклеотидная последовательность гена. Введение остатка метионина непосредственно перед N-концевым остатком буфорина-2 обеспечивает возможность избирательного химического расщепления полипептидной цепи бромцианом с высвобождением целевого пептида, не содержащего каких-либо дополнительных аминокислотных остатков по сравнению с природным буфорином-2. Использование бактериальной кетостероид-изомеразы в качестве партнера для рекомбинантной экспрессии позволяет нейтрализовать токсичность антимикробного пептида для штамма-продуцента и благодаря этому достичь высоких выходов гибридного белка (более 50% от суммарного клеточного белка). Достоинством способа является простота технологии очистки буфорина-2. Отсутствие внутренних остатков метионина в последовательности белка-носителя сводит к минимуму число индивидуальных полипептидных фрагментов, образующихся в результате реакции с бромцианом, и, таким образом, облегчает процесс очистки целевого пептида. Высокий уровень экспрессии KSI-Buf2 и его крайне низкая растворимость в воде позволяют опустить стадию хроматографической очистки гибридного белка и ограничиться отмывкой нерастворимой фракции суммарного клеточного белка. Для биосинтеза рекомбинантного белка применяются оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию: промотор и терминатор для высокопроцессивной РНК-полимеразы бактериофага Т7, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы, стартовый и стоп-кодоны.

Конструирование новой плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2, экспрессирующей гибридный белок KSI-Buf2, осуществляют на основе большого фрагмента Bg1II-XhoI плазмиды рЕТ20b(+). Искусственный ген, кодирующий модифицированную кетостероид-измеразу (KSI) и буфорин-2, фланкированный сайтами рестриктаз Bg1II и XhoI, получают химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Матрицей для амплификации последовательности KSI служит плазмида рЕТ-31b(+). Перед лигированием для получения липких концов очищенный ампликон и векторную плазмиду обрабатывают рестриктазами Bg1II и XhoI. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки Е.coli DH-10B или аналогичного штамма с выключенной системой рекомбинации и рестрикции ДНК. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров и последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК. Структуру гена, кодирующего гибридный белок, содержащий буфорин-2, определяют секвенированием по методу Сэнгера.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-KSI-Buf2, кодирующая гибридный белок KSI-Buf2, содержащий антимикробный пептид буфорин-2, характеризуется следующими признаками:

- имеет размер молекулы 4066 п.о.;

- кодирует гибридный белок KSI-Buf2, содержащий модифицированную последовательность бактериальной кетостероид-изомеразы (KSI) Pseudomonas testosteroni и буфорин-2;

- состоит из: Bg1II/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида KSI-Buf2, содержащего кетостероид-изомеразу и буфорин-2, и Bg1II/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы;

- имеет уникальную совокупность признаков: промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7; сайт связывания рибосомы; искусственный ген, кодирующий гибридный белок KSI-Buf2, содержащий бактериальную кетостероид-изомеразу и буфорин-2; ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pET-KSI-Buf2 клеток к ампициллину.

Для получения штамма-продуцента гибридного белка KSI-Buf2 препаратом плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2 трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) и проводят отбор клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Наличие и уровень экспрессии рекомбинантных белков контролируют с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза.

Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде pET-KSI-Buf2 гена β-лактамазы (bla).

Преимущества штамма Е.coli BL21(DE3) в качестве основы для создания штамма-продуцента заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого рекомбинантного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е.coli. В хромосомную ДНК BL21 (DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, что, совместно с использованием Т7 промотора и Т7 терминатора в плазмиде pET-KSI-Buf2, обеспечивает быструю и эффективную продукцию белка клетками Е.coli при индукции изопропилтио-β-D-галактозидом или лактозой.

Клетки Е.coli BL21(DE3)/pE-KSI-Buf2 являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка KSI-Buf2, содержащего буфорин-2, который накапливается в клетках в количестве 50-70% от суммарного белка бактерии.

Биосинтез продукта проводят следующим образом: клетки штамма Е.coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 выращивают в богатой среде (например, LB) с добавлением 100-200 мкг/мл ампициллина до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 0,5-1,0 при температуре 37°С, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез белка изопропил-β-D-галактозидом в концентрации 0,1-1,0 мМ или лактозой и растят еще 6-12 часов при температуре 25-37°С. Увеличение выхода рекомбинантного белка может быть достигнуто с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и использования обогащенных питательных сред (например, с добавлением глюкозы).

Получение антимикробного пептида буфорина-2 из клеток продуцента включает следующие стадии: отделение бактерий от культуральной среды с помощью центрифугирования, их разрушение одним из обычно применяемых способов (ультразвуковой дезинтеграцией, химическим лизисом с использованием детергентов и хаотропных агентов), отмывку буферными растворами телец включения от водорастворимых компонентов клетки, солюбилизацию телец включения, обработку полученной белковой массы бромцианом, разделение продуктов реакции, очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:

1. Тельца включения подвергают двукратной отмывке 25-100 мМ фосфатным или трис-HCl буфером (рН 6,5-8,5) с добавлением 1% неионогенного детергента Triton Х-100 и 4М мочевины.

2. Отмытые тельца включения растворяют в 80% трифторуксусной кислоте, либо в 70% муравьиной кислоте, либо в 6М гуанидине-HCl с добавлением 0,1М HCl и добавляют равную массу бромциана. Реакционную смесь инкубируют в темноте 16-20 ч при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают добавлением трех-пятикратного объема воды, после чего упаривают образец под вакуумом при температуре 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют несколько раз.

3. Продукты реакции растворяют в 0,2-0,5 М аммоний-ацетатном буфере (рН 9-10) или другом буфере, обеспечивающем высокую растворимость буфорина-2 и плохо растворяющем гибридный белок KSI-Buf2 и белок-носитель KSI. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием. Раствор диализуют против 1% уксусной кислоты через мембрану с порогом задержки 1000 Да, после чего лиофильно высушивают.

4. Навеску препарата растворяют в 5% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты и подвергают очистке методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации ацетонитрила. Фракцию, содержащую рекомбинантный буфорин-2, лиофильно высушивают.

5. При необходимости может быть проведена дополнительная очистка целевого пептида методом ВЭЖХ.

6. Идентичность полученного буфорина-2 природному пептиду устанавливают методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе, MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, а также тестированием антимикробной активности методом радиальной диффузии в агаризованной питательной среде либо методом серийных разведении в жидкой питательной среде. Степень очистки буфорина-2 определяют методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе и MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии. Выход буфорина-2, полученного заявленным способом, с чистотой не менее 95% составляет не менее 5 мг/л культуры.

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность Bg1II/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид KSI-Buf2; приведена соответствующая аминокислотная последовательность KSI-Buf2. На фиг.2 представлена физическая карта плазмиды pET-KSI-Buf2. На фиг.3 показаны картины ПААГ-электрофореза гибридного белка и буфорина-2 на разных стадиях очистки. На фиг.4 представлена хроматограмма очистки буфорина-2 методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. На фиг.5 приведен масс-спектр очищенного буфорина-2.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2.

Нуклеотидную последовательность, содержащую промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид KSI-Buf2, получают химико-ферментативным синтезом. Химический синтез олигонуклеотидов, используемых для сборки нуклеотидной последовательности, выполняют твердофазным фосфоамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Фрагмент, кодирующий белок-носитель KSI, получают методом ПЦР-амплификации с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы ген KSI в плазмиде рЕТ-31b(+). Остальные участки последовательности получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз Bg1II и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 576 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и лигируют с фрагментом ДНК размером 3,5 тыс. п.о., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ20b(+) рестриктазами Bg1II и XhoI. В результате лигазной реакции образуется кольцевая ковалентно замкнутая ДНК размером 4066 п.о. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки E.coli DH-10B, приготовленные по стандартному протоколу с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов». Отобранные клоны используют для подращивания в жидкой среде и выделения плазмидной ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестриктного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают ту плазмиду, у которой нуклеотидная последовательность лигированной вставки полностью идентична первоначально запланированной (фиг.1).

Пример 2.

Получение штамма-продуцента E.coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2, вырабатывающего рекомбинантный белок KSI-Buf2, и определение его продуктивности.

Проводят трансформацию клеток Е.coli BL21(DE3) плазмидой pET-KSI-Buf2, как описано в примере 1. Петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, подращивают до оптической плотности OD₆₀₀ 0,7 на термостатируемой качалке со скоростью вращения 200 мин^-1 при температуре 37°С, отбирают аликвоту культуры для последующего анализа, добавляют индуктор - изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают инкубацию при температуре 37°С в течение 5 ч, отбирая каждый час пробы по 0,3 мл для определения оптической плотности OD₆₀₀ и последующего электрофоретического анализа. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях. Для этого образцы лизируют буфером, содержащим 1% SDS, 1% β-меркаптоэтанола, 8М мочевину на водяной бане в течение 5 мин. Электрофорез проводят в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают 0,025% кумасси G-250 по стандартной методике. Появление отчетливой полосы в районе 16 кДа в образцах, отобранных после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать KSI-Buf2. Относительное содержание рекомбинантного белка определяют путем сканирования и денситометрического анализа окрашенных гелей.

Пример 3.

Получение рекомбинантного антимикробного пептида буфорина-2.

Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 проводят следующим образом.

Клетки штамма BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 выращивают в жидкой среде LB с добавлением 150 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 1,0 при температуре 37°С. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропил-β-D-галактозида в концентрации 1,0 мМ, после чего инкубируют 10 часов при температуре 37°С. Уровень экспрессии гибридного белка, а также содержание гибридного белка и целевого пептида в препарате на разных стадиях очистки определяют с помощью SDS-ПААГ в трис-трициновой буферной системе (фиг.3).

По окончании ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в лизирующем буфере (100 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (рН 7,8), 0,5М NaCl, 4M мочевина, 1% Triton X-100) и разрушают с помощью ультразвукового гомогенизатора. Все работы по выделению гибридного белка проводят при температуре 4°С. Нерастворимую фракцию клеточного белка (тельца включения), содержащую 70% гибридного белка, отделяют центрифугированием. Тельца включения дважды ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) и центрифугируют, после чего лиофильно высушивают.

Очищенный гибридный белок растворяют в 80% трифторуксусной кислоте в концентрации 2%, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте при постоянном встряхивании в течение 20 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего упаривают образец при 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.

Продукты реакции растворяют в 200 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 9,5). Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием. Раствор диализуют против 1% уксусной кислоты через мембрану с порогом задержки 1 кДа, после чего лиофильно высушивают и перерастворяют в концентрации 10 мг/мл в 5% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Очистку буфорина-2 проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративных колонках в системе, состоящей из буфера А (5% ацетонитрил, 0,1% ТФУ) и буфера В (80% ацетонитрил, 0,1% ТФУ) (фиг.4). Буфорин-2 элюируют линейным градиентом буфера В от 0 до 30% в течение 50 мин. Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию элюата, содержащую буфорин-2, собирают и лиофильно высушивают.

Для определения N-концевой аминокислотной последовательности буфорина-2 применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (PE Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems, США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющий последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов и идентифицировать отщепленные производные аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. В результате автоматического микросеквенирования установлена полная идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного буфорина-2 (TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK).

Для определения молекулярной массы буфорина-2 используют MALDI-времяпролетный масс-спектрометрический анализ на приборе Reflex III (Bruker Daltonics). В качестве матрицы используют 0,15М 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 25% метанол и 0,1% трифторуксусную кислоту. Образец облучают УФ-лазером с длиной волны 337 нм. Полученный пик с m/z 2433,00 (фиг.5) соответствует молекулярному иону природного буфорина-2 (расчетная молекулярная масса составляет 2434,79 Да). Выход буфорина-2 составляет 10 мг/л клеточной культуры.

Пример 4.

Тестирование антимикробной активности буфорина-2.

Антимикробную активность буфорина-2 определяют методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле с тест-культурами микроорганизмов: Escherichia coli, штамм С600 (грамотрицательная бактерия); Bacillus subtilis, штамм L1 (грамположительная бактерия); Staphylococcus aureus, штамм 209Р (грамположительная бактерия). Тест-культуры пересевают из консерва на чашку Петри с LB-агаром и выращивают в течение ночи. Выросшие колонии переносят в 3 мл 1/2 LB и инкубируют на роторной качалке при 37°С до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 1,0-1,5. Аликвоту клеточной суспензии (1-4·10⁶ КОЕ) добавляют к 12 мл расплавленной и охлажденной до 40°С обедненной среды (9 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, 1 мМ цитрат натрия, 0,03% TSB, 1% агароза). Конечная концентрация бактерий составляет 2·10⁵ КОЕ/мл. Полученной смесью заливают чашки диаметром 90 мм. В слое агарозы высверливают лунки диаметром 2 мм и вносят по 5 мкл раствора образца (буфорина-2 или стрептомицина, используемого в качестве контрольного антибиотика) в 10% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. Чашки инкубируют, не переворачивая, в течение 3 часов при 37°С. На первый слой агарозы наслаивают 12 мл обогащенной среды (2LB с 1% агарозы). Чашки переворачивают и инкубируют в течение 18 ч при 37°С. Антимикробное действие пептида определяют по диаметру зон ингибирования роста тест-культуры. Результаты тестирования активности буфорина-2 представлены в таблице.

Таблица. Антимикробная активность буфорина-2
кол-во образца (мкг на лунку)	диаметр зоны ингибирования роста тест-культуры, мм (±0,5 мм)
	Escherichia coli С600	Bacillus subtilis L1	Staphylococcus aureus 209P
20,0	12,5	11,5	6,5
10,0	11,0	10,5	5,0
5,0	9,0	9,5	4,0
2,5	8,5	8,5	3,5
1,25	7,0	7,5	3,0
контроль (0,4 мкг стрептомицина)	15,5	9,5	12,0

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-KSI-Buf2 размером 4066 п.о., кодирующая гибридный белок KSI-Buf2, содержащий антимикробный пептид буфорин-2, состоящая из

BglII/XhoI-фрагмента ДНК, приведенного на рис.1, содержащего промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность, кодирующую модифицированную кетостероид-изомеразу Pseudomonas testosteroni и буфорин-2, разделенные остатком метионина;

BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pET-KSI-Buf2 клеток Escherichia coli к ампициллину, в качестве генетического маркера.

2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - продуцент гибридного белка, содержащего антимикробный пептид буфорин-2, полученный путем трансформации клеток родительского штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2 по п.1.

3. Способ получения антимикробного пептида буфорина-2, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2, разрушение клеток, выделение и отмывку телец включения, содержащих гибридный белок KSI-Buf2, солюбилизацию гибридного белка и расщепление его бромцианом в кислой среде по остатку метионина, растворение целевого пептида и его очистку методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.