Способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы
Владельцы патента RU 2359454:
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ заключается в том, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона. Причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз. Способ позволяет прогнозировать мясную продуктивность фенотипически невыраженных особей и осуществлять подбор пар в селекционной работе. 5 табл.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы.
Известно, что основным критерием, по которому можно прогнозировать продуктивные качества птицы, является порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Внешние (фенотипические) признаки не всегда четко проявляются. Классическим методом выяснения происхождения животных является генетическая экспертиза как непосредственная, основанная на анализе ДНК (заявка №2004126246/13), так и опосредованная - по иммунологическим реакциям (заявка №97121627/13). Но она может быть использована только в том случае, если известны маркеры. В этом ее основной недостаток. Определение по другим показателям (по продолжительности периода эмбрионального развития - заявка №96101232/13), возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.
В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт, что суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений (RNO+RNO2) в амниотической жидкости эмбрионов сельскохозяйственной птицы тесно связано со скоростью роста птенцов после вылупления. У быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно ниже, чем у исходных, а также яичных. Это позволяет использовать его для прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе.
Пример конкретного выполнения
Эксперименты проводились на амниотической жидкости эмбрионов птиц, полученных в ООО "Генофонд" (г.Сергиев Посад) - куры, перепела и цесарки, в парке птиц "Воробьи" (Калужская область) - страусы. Отборы амниотической жидкости брались на 7 и 11 сутки инкубации у куриных эмбрионов, на 10 - у перепелиных, на 9 и 15 - у цесариных и на 15 и 18 - у страусиных. В каждом случае было исследовано от 10 до 30 эмбрионов.
В амниотической жидкости определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO2)). Этот показатель был относительно (±10%) стабилен в течение всего периода развития эмбриона.
Определение содержания RNO+RNO2 осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Вестник Гродненского Государственного Университета им. Янки Купалы, 2007, серия 2, №2(52), с.93-100].
Порядок определения RNO+RNO2 и необходимые реактивы
40 мМ р-р КН2РО4 (или NaH2PO4);
1,5 М маточный раствор NaCl;
25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;
30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl3) - восстановитель нитросоединений в нитрозо-.
Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;
Перекись водорода (3% р-р).
Порядок проведения анализа
1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.
2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.
3. Образец амниотической жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VCl3. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO2 определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).
Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.
Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы.
Анализ амниотической жидкости указанных в таблице пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов и цесарок, считающиеся мясными, содержат многократно меньшую концентрацию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости, чем исходные и яичные - десятки и сотни микромоль против тысяч (таблицы 1-3).
| Таблица 1 | |
| Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости куриных эмбрионов на 11-й день инкубации (Х±mx) | |
| Породы, линии, кроссы | RNO+RNO2, мМ |
| Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) | |
| Русская белая | 6,8±1,5 |
| Юрловская (мясояичная) | 7,5±2,0 |
| Кросс "Радонеж" | 5,4±1,5 |
| Кросс "Хайсекс белый" | 5,5±1,5 |
| Его родительская линия Х3 | 5,5±1,5 |
| Г8 - родительская линия кросса "Смена" | 5,5±1,0 |
| Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) бройлеры и некоторые их родительские линии | |
| Кросс "Смена" | 0,2±0,05 |
| Его родительская линия Г6 | 0,02±0,005 |
| Кросс "Конкурент АК839" | 0,04±0,015 |
| Его родительская линия К3 | 0,06±0,02 |
| Его родительская линия К8 | 0,04±0,015 |
| Его родительская линия К9 | 0,06±0,02 |
| Кросс "Кобб-500" | 0,15±0,05 |
| Таблица 2 | |
| Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов цесарок различных пород и линий на 15-й день инкубации (Х±mx) |
|
| Цесарки (породы и линии) | RNO+RNO2, мМ |
| ИСХОДНЫЕ | |
| Серо-крапчатая | 7,5±1,2 |
| Кремовая | 8,4±2,0 |
| Загорская белогрудая (ЗБ) | 5,5±1,0 |
| Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) | |
| ЗБ-2 (линия ЗБ) | 5,5±1,0 |
| Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) | |
| ЗБ-1 (линия ЗБ) | 0,04±0,015 |
| Таблица 3 | |
| Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов перепелов различных пород на 10-й день инкубации (X±mx) |
|
| Породы | RNO+RNO2, мМ |
| Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) | |
| Японская серая | 5,5±1,0 |
| Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) | |
| Эстонская | 0,03±0,01 |
| Фараон | 0,2±0,05 |
Эта закономерность наблюдается и на страусах. В страусоводческих хозяйствах разводят две разновидности страусов: черношеяя и голубошеяя. Потомство, полученное в результате скрещивания этих разновидностей, отличается более высокой, чем родительские формы, скоростью прироста живой массы. Анализ содержания нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбрионов страусов показал ту же закономерность, которая наблюдалась у кур, перепелов и цесарок: эмбрионы гибридов содержали более чем на порядок меньше нитрозо- и нитросоединений, чем родительские формы (таблица 4).
| Таблица 4 | |
| Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов различных форм черного африканского страуса на 18-й день инкубации (Х±mх) | |
| ФОРМЫ | RNO+RNO2, мМ |
| ИСХОДНЫЕ | |
| Черношеяя (Ч) | 70±20 |
| Голубошеяя (Г) | 70±20 |
| Быстрорастущая (МЯСНАЯ) | |
| Потомство Ч Х Г | 5,0±1,0 |
В таблице 5 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.
| Таблица 5 | |||||
| Определение фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в амнионе | |||||
| Самец | Самка | Содержание RNO+RNO2 в амнионе, мМ |
Вывод | ||
| № | Формы | № | Формы | ||
| 1 | Черношеий | 1 | невыражена | 80 | Самка черношеяя |
| 2 | Голубошеий | 2 | невыражена | 5 | Самка черношеяя |
| Самец 2 или 3? неизвестно | Голубошеий или черношеий - необходимо определить | 3 | черная | 90 | Черношеий самец №3 |
| 3 | Черношеий | 4 | невыражена | 4-5 | Самка голубошеяя |
| 3 | Черношеий | 5 | невыражена | 6 | Самка голубошеяя |
| 3 | Черношеий | 6 | невыражена | 85 | Самка черношеяя |
Способ идентификации фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы, отличающийся тем, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона, причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз.
