Способ прогнозирования устойчивости клеток чумного микроба штамма ev к лиофилизации

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для прогнозирования устойчивости микробных клеток к экстремальным воздействиям в условиях лиофилизации. Способ предусматривает разведение в дистиллированной воде исследуемой суспензии клеток бактерий. Тестовое воздействие на разведенную в дистиллированной воде исследуемую суспензию клеток детергентом, в качестве которого используют додецилсульфат натрия в количестве, соответствующем концентрации детергента в пробе 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 ммоль. Экспонирование полученных проб в течение 5 минут с дальнейшей фотометрической регистрацией оптической плотности суспензии клеток. Определение показателя резистентности бактерий, соответствующего концентрации додецилсульфата натрия, вызывающего 50% лизис клеток бактерий (С₅₀) с последующим прогнозированием устойчивости бактерий к лиофилизации по уравнению линейной регрессии: В_р=9,7С₅₀+1,9, где В_р - прогнозируемая расчетная устойчивость (выживаемость) бактерий к лиофилизации, %; C₅₀ - показатель резистентности клеток к воздействию додецилсульфата натрия, соответствующий концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии; 9,7 и 1,9 - коэффициенты. Изобретение позволяет прогнозировать устойчивость бактерий к лиофилизации. 2 табл.

 

Изобретение относится к способам прогнозирования устойчивости микробных клеток к экстремальным воздействиям лиофилизации и может быть использовано в биотехнологии и прикладной микробиологии при приготовлении вакцинных препаратов на основе живых бактерий.

Наиболее важным показателем, определяющим кондиционность готовых вакцин, является устойчивость (выживаемость) микроорганизмов, т.е. сохранение их жизнеспособности после высушивания [Регламент производства №1368-03 «Вакцина чумная живая сухая»]. Однако прогнозирование устойчивости бактерий к лиофилизации, позволяющее значительно сокращать материальные и трудовые расходы, при получении вакцинных препаратов не применяется. Разработка способа прогнозирования предполагает определение, по экспериментальным данным, эмпирической формулы для предварительной оценки качества готового продукта. Формула должна быть выражением взаимосвязи между прогнозируемым показателем и показателем, характеризующим свойство полуфабриката на промежуточной стадии приготовления [Веденяпин Г.В. Общая методика экспериментального исследования и обработка опытных данных. - М.: Колос, 1965]. Микробная популяция на этапах приготовления посевных и нативных культур, микробной и вакцинной взвеси испытывает ряд неблагоприятных внешних воздействий и может содержать не только биологически неполноценные (незрелые), но и поврежденные бактерии, что является основной причиной массовой гибели клеток в процессе лиофилизации [Островский Д.Н., Капельянц А.С., Лукоянова М.И. // Прикладная биохимия и микробиология, 1983. - Т. 19 - Вып.1 - С.60-77]. Поэтому для осуществления прогноза устойчивости чумных микробов к лиофилизации необходимо тестирование микробной популяции до высушивания с помощью специальных методов, позволяющих выявлять наличие структурно-функциональных нарушений бактерий.

Ввиду того, что определение формулы для прогноза на основании устанавливаемых взаимосвязей осуществляется по известным алгоритмам, выбор метода тестирования, дающего возможность получать адекватную экспрессную оценку состояния популяции, является наиболее существенным в разработке способа прогнозирования.

Одним из методов определения повреждений клеток является метод, основанный на тестировании бактерий прогреванием в течение 60 минут при сублетальной температуре - плюс 45°С [Мунблит В.Я., Тальрозе В.Л., Трофилов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. М.: Наука. - 1985. - С.159-207]. Недостатком данного метода является длительность анализа, в ходе которого о количестве поврежденных бактерий, неспособных репарироваться в благоприятных условиях, судят по результатам высева на плотную питательную среду до и после воздействия.

Широко применяется осмооптический метод, основанный на регистрации светорассеяния бактериальной суспензии в процессе осмотической реакции клеток при увеличении осмотического давления среды [Патент РФ №2037805, 19.06.1995. Способ определения содержания живых микробов в биопрепарате]. Недостатком данного способа является то, что изменение оптической плотности бактериальной суспензии при осмотических реакциях отражает состояние только барьерных (механических) свойств цитоплазматической мембраны микроорганизмов [Говорунов И.Г., Пучков Е.О.// Прикладная биохимия и микробиология, 1986. - Т.23. - №2. - С.260-265]. Данный метод не позволяет четко разграничить стойкие повреждения микробных клеток, которые отражаются на их жизнеспособности, от временных - репарирующихся, благодаря способности микробов к саморегуляции [Говорунов И.Г. Нефелометрический и флуорометрический анализ бактериальных свойств мембран Е. coli после низкотемпературного воздействия: Дис. канд. биол. наук. Оболенск: ВНИИПМ, 1985].

Наиболее близким к заявляемому в изобретении методу тестирования клеток, необходимого для осуществления прогноза, является флуорометрический метод, характеризующий повреждения бактерий по появлению чувствительности к бромистому этидию после прогревания на водяной бане в течение 10 минут [Патент РФ №2117291, 10.08.1998. Способ определения количества бактерий в биопрепарате], а также под воздействием тритона Х-100 [Говорунов И.Г., Косарев Н.В., Евдотенко Ю.В., Пучков Е.О. // Микробиология, 1982. - Т.51 - Вып.5 - С.731-735]. Этот способ основан на том, что у интактных бактерий внешняя мембрана непроницаема для флуоресцентного красителя нуклеиновых кислот бромистого этидия. При наличии повреждений, прогревание или воздействие тритона Х-100 нарушает мембрану клетки, бромистый этидий связывается с нуклеиновыми кислотами, что сопровождается приростом интенсивности флуоресценции красителя регистрируемым флуориметром. При этом показатель барьерной функции характеризует долю микробов с неповрежденными поверхностными структурами.

Общим с методом тестирования, входящим в заявляемый способ для прогноза, является возможность количественного определения повреждений клеточной оболочки.

Недостатками флуориметрического метода является использование нескольких дорогостоящих приборов (флуориметра, концентрационного фотоэлектрического колориметра и иономера), дополнительное экстремальное воздействие (прогреванием либо детергентом тритоном Х-100), дополнительное приготовление для анализа трис-буфера, раствора бромистого этидия, раствора бромистого этидия в трис-буфере, натрия хлорида и соляной кислоты, что снижает точность метода и значительно увеличивает его продолжительность.

Задачей изобретения является разработка способа тестирования клеток перед высушиванием, обеспечивающего нетрудоемкое и экспрессное прогнозирование устойчивости бактерий к лиофилизации при изготовлении вакцины чумной живой сухой.

Поставленная задача достигается тем, что в заявляемом способе с целью прогнозирования устойчивости бактерий к лиофилизации предусмотрено тестовое воздействие 346,7 ммоль раствором додецилсульфата натрия (ДСН) на разведенную в дистиллированной воде вакцинную взвесь для создания в пробах 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 ммоль концентрации ДСН с последующей фотометрической регистрацией оптической плотности суспензии бактерий и определением показателя резистентности клеток, соответствующего концентрации ДСН, вызывающей 50% лизис клеток.

Заявленный в изобретении способ для прогноза включает разработанный авторами литический метод, основанный на тестировании бактериальной популяции воздействием специфической литической добавки ДСН, способного к солюбилизации белково-липидных комплексов мембран клеток и к разрушению (лизису) бактерий. Метод представляет собой фотометрическую регистрацию изменения оптической плотности в процессе литической реакции клеток на воздействие ДСН. Способность ДСН проникать через повреждения внешних слоев клеточной оболочки и лизировать клетки дает возможность не только определять неустойчивые структурно-функциональные элементы микробной клетки, но и дифференцировать структурные повреждения. Нарастание лизиса свидетельствует о наличии в суспензии бактерий с нарушенной защитной функцией оболочек, не устойчивых к экстремальным воздействиям процесса лиофилизации.

Заявляемый способ, включающий тестирование вакцинной взвеси литическим методом, пригодный для прогнозирования устойчивости бактерий Y.pestis штамм EV при получении вакцины чумной живой сухой, предполагает выполнение следующих этапов:

- определение показателя резистентности бактерий к действию ДСН;

- прогнозирование устойчивости чумного микроба штамма EV в составе готовой формы препарата по эмпирической формуле.

Определения показателя резистентности бактерий в составе вакцинной взвеси проводят в следующем порядке:

- подготавливают к работе концентрационный фотоэлектрический колориметр по инструкции, прилагаемой к прибору. В работе используют кюветы с длиной оптического пути 20 мм и длиной волны проходящего света (590±10) нм;

- готовят раствор ДСН с концентрацией 346,7 ммоль в дистиллированной воде;

- разводят дистиллированной водой исследуемую суспензию клеток до 0,6-0,8 ед. оптической плотности относительно дистиллированной воды;

- разливают подготовленную суспензию клеток по 7,5 см³ в два ряда пробирок;

- в первый ряд пробирок вносят раствор ДСН с концентрацией 346,7 ммоль (опытная проба) в количествах: 0,07; 0,125; 0,250; 0,375 см³, что соответствует концентрации ДСН в пробе: 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 ммоль;

- во второй ряд пробирок вносят дистиллированную воду (контрольная проба) в тех же количествах;

- полученные пробы экспонируют 5 минут при температуре 18-22°С, затем замеряют оптическую плотность;

- для каждой концентрации ДСН по формуле рассчитывают литический показатель

где L_i - литический показатель, %;

E_опi - оптическая плотность опытной пробы с данной концентрацией ДСН, ед. оптической плотности;

Е_кi - оптическая плотность соответствующей контрольной пробы, ед. оптической плотности;

- определяют показатель резистентности (C₅₀) из уравнения линейной регрессии, характеризующего зависимость «доза-эффект»:

где Д_i - концентрация ДСН, ммоль;

А и В - коэффициенты уравнения линейной регрессии;

- используя метод наименьших квадратов и систему пробитов находят коэффициент В уравнения [Ашмарин И.П., Воробьев А.А Статистические методы микробиологических исследования. - Л.: Медгиз, 1962];

В=С₅₀,

где С₅₀ - показатель резистентности клеток к воздействию ДСН, соответствующий концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии.

Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют общепринятыми методами [Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980].

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутыми результатами представлены в таблице 1.

Для определения характера и степени связи между значениями показателей резистентности клеток к ДСН в вакцинной взвеси до лиофилизации и устойчивостью бактерий после лиофилизации были проведены опытные исследования на 20 сериях вакцины чумной живой сухой. Устойчивость (выживаемость) бактерий к лиофилизации определяли культуральным методом по формуле:

где В - выживаемость бактерий после лиофилизации, %;

A_CB, A_BB - концентрация живых микробов, определенная культуральным методом в сухой вакцине (А_CB) и в вакцинной взвеси (А_BB), млрд. живых микробов · г^-1 (см^-3);

ρ - плотность микробной культуры, г·см^-3;

СО - сухой остаток микробной культуры, отн. ед.

Анализ результатов, полученных в ходе исследований, указывал на наличие связи между показателем резистентности в вакцинной взвеси до лиофилизации и выживаемостью клеток после лиофилизации. Для количественной оценки степени установленной связи рассчитан коэффициент корреляции. Установлено, что связь между показателями сильная (r=0,89) и носит прямой характер с вероятностью 99%. [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы микробиологических исследований. - Л.: Медгиз, 1962].

Было установлено, что зависимость показателя резистентности бактерий в составе вакцинной взвеси и устойчивость бактерий к лиофилизации носит линейный характер, и может быть описана уравнением линейной регрессии.

По экспериментальным данным (на 20 сериях вакцины) с использованием метода наименьших квадратов определены коэффициенты уравнения линейной регрессии. В результате эмпирическая формула для прогноза устойчивости клеток к лиофилизации приобрела следующий вид:

где В_P - прогнозируемая (расчетная) устойчивость бактерий к лиофилизации, %;

С₅₀ - показатель резистентности клеток к воздействию ДСН, соответствующий концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии;

9,7 и 1,9 - коэффициенты.

Адекватность разработанной эмпирической формулы определялась после обратного пересчета устойчивости (выживаемости) клеток после лиофилизации (В_P) по показателю С₅₀. Значимость различий между расчетной (В_P) и реальной устойчивостью клеток (В), определяемой культуральным методом, оценивали по формуле для вычисления относительной погрешности Δ:

Величина относительной погрешности по каждой из 20 серий препарата не превысила 20%, что сопоставимо с ошибкой определения устойчивости микробов культуральным методом.

Возможность осуществления заявляемого изобретения с использованием литического метода для осуществления прогнозирования показана следующим примером.

Пример

Были приготовлены 10 новых серий вакцины живой чумной сухой, характеристика которых представлена в таблице 2. На стадии получения вакцинных взвесей для осуществления прогноза устойчивости клеток при лиофилизации отбирали пробы. Пробы, разведенные дистиллированной водой, тестировали воздействием детергента ДСН. Для этого создавалась 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 ммоль концентрация детергента в пробе. После пяти минутной экспозиции с детергентом проводили фотометрическую регистрацию изменения оптической плотности суспензии бактерий. Для каждой серии препарата были определены значения показателя резистентности клеток в составе вакцинной взвеси (табл. 2, графа 5). С использованием эмпирической формулы по каждому значению C₅₀ был сделан прогноз устойчивости бактерий к лиофилизации (табл. 2, графа 6).

На основании данных о концентрации живых микробов, определенной культуральным методом в вакцинной взвеси (табл. 2, графа 2) и сухой вакцине (табл. 2, графа 3), по формуле 3 была рассчитана реальная выживаемость бактерий после лиофилизации (табл. 2, графа 4).

Результаты определения относительной погрешности (табл. 2, графа 7) показывают, что прогноз устойчивости бактерий к лиофилизации с помощью литического метода (В_P) имеет высокую сходимость со значениями устойчивости, полученными культуральным методом (В), что определяет возможность его использования при приготовлении вакцины чумной живой сухой.

Анализ доступной литературы и современного уровня техники не выявил способа, пригодного для прогнозирования устойчивости клеток к экстремальным факторам лиофилизации в технологии получения вакцины чумной живой сухой. Однако наличие такого способа имеет существенное значение для оценки кондиционности получаемых препаратов. Экспериментальные исследования показали, что использование в заявленном способе разработанного авторами литического метода для оценки поврежденности бактерий обеспечивает такие полезные свойства, которые проявляются в экспрессном проведении анализа, использовании минимума оборудования и реактивов (концентрационный фотоэлектрический колориметр и раствор ДСН). Установление линейной зависимости между показателем резистентности микробных клеток к ДСН в составе вакцинной взвеси до высушивания и их устойчивостью к лиофилизации, эффективный расчет показателя по формуле для прогноза является новым в технологии получения вакцинных препаратов.

Таблица 1 - Сведения о причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутыми результатами

№ п.п	Виды результатов и их размерность	Показатели фактические и расчетные	Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта
заявляемого объекта	прототипа
1	Средняя продолжительность определения показателей, мин	20	120	Использование литического метода определения показателя резистентности обеспечивает экспрессную оценку наличия клеточных повреждений по сравнению с прототипом, где значительное время занимает прогревание и экспозиция клеток с флуоресцентным красителем.
2	Требуемое аппаратурное оформление для проведения анализа, шт	1	3	Для литического метода требуется только концентрационный фотоэлектрический колориметр. Прототип для проведения флуориметрического анализа предполагает использование флуориметра, концентрационного фотоэлектрического колориметра и иономера.
3	Средняя продолжительность подготовки к анализу, мин	10	60	Для проведения литического анализа требуется только раствор ДСН. Для флуориметрического анализа требуется приготовление трис-буфера, раствора бромида этидиума, раствора бромида этидиума в трис-буфере, а также растворов тритона Х-100, хлорида натрия и соляной кислоты.
4	Определение характера связи между показателями и устойчивостью при лиофилизации, да/нет	да	нет	Установлена прямая линейная зависимость между показателем резистентности бактерий к ДСН и их устойчивостью к лиофилизации. Наличие связи между показателем барьерной функции и устойчивостью бактерий к лиофилизации не установлено.
5	Определение эмпирической формулы для предварительного прогноза устойчивости микробов по показателю, да/нет	да	нет	Получена формула, позволяющая по показателю резистентности бактерий в составе вакцинной взвеси (до высушивания), прогнозировать их устойчивость к лиофилизации. Формулы для прогноза по показателю барьерной функции не существует.

Таблица 2
Характеристика чумных микробов вакцинного штамм EV в ходе лиофилизации
Серия	ABB до лиофилизации, млрд. жив. микр. ·см-3	ACB после лиофилизации, млрд. жив. микр. ·г-1	В, %	С50, ммоль	ВP, %	Δ, %
1	63,6	22,7	29,4	3,4	35,1	16,2
2	52,0	20,2	29,7	2,6	27,4	8,4
3	75,6	26,3	32,8	3,6	36,6	10,4
4	50,4	21,6	27,0	2,5	26,3	2,7
5	44,0	14,8	29,8	2,4	25,0	19,2
6	46,0	14,6	18,3	2,2	20,0	8,5
7	58,2	26,7	30,7	3,5	35,7	14,0
8	71,0	32,3	34,0	3,7	37,6	9,6
9	33,0	34,7	43,0	4,5	45,8	6,1
10	35,8	32,8	43,7	3,6	37,4	16,8
Примечание - состав среды высушивания и режимы лиофилизации согласно регламенту производства №1368-03

Способ прогнозирования устойчивости клеток чумного микроба штамма EV к лиофилизации, предусматривающий разведение дистиллированной водой исследуемой суспензии клеток, тестовое воздействие детергентом, додецилсульфатом натрия в количестве, соответствующем концентрации детергента в пробе 3,21, 5,69, 11,19; 16,52 ммоль, экспонирование полученных проб в течение 5 мин с дальнейшей фотометрической регистрацией оптической плотности суспензии бактерий, определение показателя резистентности бактерий, соответствующего концентрации додецилсульфата натрия, вызывающей 50% лизис клеток (C₅₀), и последующее прогнозирование устойчивости бактерий к лиофилизации по формуле:
Вр=9,7С₅₀+1,9,
где Вр - прогнозируемая (расчетная) устойчивость (выживаемость) бактерий к лиофилизации, %;
С₅₀- показатель резистентности клеток к воздействию додецилсульфата натрия, соответствующий концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии;
9,7 и 1,9 - коэффициенты.