Штамм бактерий clostridium acetobutylicum - продуцент бутанола, ацетона и этанола

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения бутанола, ацетона и этанола. Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под номером В-2531D и является продуцентом бутанола, ацетона и этанола. Изобретение позволяет повысить выход бутанола, ацетона и этанола и расширить сырьевую базу для их получения. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма Clostridium acetobutylicum, продуцирующего бутанол, ацетон и этанол.

Изобретение может быть использовано для получения бутанола, ацетона и этанола экологически чистым методом - методом сбраживания сырья.

Бутанол, ацетон и этанол - органические растворители, широко применяемые при изготовлении нитролаков и масляных лаков, в производстве сложных растворителей, синтетической резины и шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов, служат сырьем для производства практически всех пластмасс и их растворителей.

Известны химические методы получения бутанола, ацетона и этанола, но при этом в конечном продукте почти всегда обнаруживается присутствие примесей в виде остаточных количеств исходного сырья или промежуточных продуктов химического синтеза, а также вторичный бутиловый спирт, что значительно снижает качественные показатели и сферу применения растворителей.

Получение бутанола, ацетона и этанола методом ацетонобутилового брожения не имеет недостатков, присущих химическому синтезу, и находит широкое применение в различных отраслях хозяйственной деятельности человека, являясь не только целевым продуктом, но и сырьем, особенно в производствах, связанных с повышенными требованиями к качеству исходного сырья, - это, прежде всего, промышленность тонкого органического синтеза и фармацевтическая промышленность.

Обычное соотношение растворителей, получаемых при сбраживании бактериями Clostridium acetobutylicum, бутанол:ацетон:этанол 6:3:1, может изменяться в зависимости от свойств штамма-продуцента, от особенностей технологии, от видов сбраживаемого сырья. Наиболее ценным продуктом является бутанол.

С появлением нового направления в использовании бутанола в качестве биотоплива, альтернативного углеводородному топливу, возвратился интерес к ацетонобутиловому брожению. При этом направление исследований - получение максимального выхода бутанола, возможность переработки воспроизводимых источников сырья.

Основными направлениями исследований в Великобритании, США, Германии, Китае, Японии являются конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии, разработка новых технологических приемов производства и выделения конечных целевых продуктов.

Совершенствования известных отечественных технологий в ацетонобутиловом производстве касались, как правило, создания приемов с целью повышения выхода целевых продуктов, главным образом бутанола, как наиболее ценного продукта.

При этом сбраживаемым сырьем традиционно была мука - пшеничная, кукурузная, реже ржано-пшеничная, т.е. пищевое крахмалистое сырье. Следует учесть также, что производственный штамм на отечественных предприятиях, вырабатывающих бутанол и ацетон методом брожения, был фактически один, предложенный при вводе первого ацетонобутилового завода страны, - Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 4361.

Результаты исследований отечественных ученых (Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового брожения, М., 1958 г. С.144-153) позволили перевести ацетонобутиловое производство на смешанное сырье - муку и мелассу, как новый способ, предусматривающий снижение расхода пищевого сырья - муки и замену на непищевое сырье - мелассу.

Отечественные работы по использованию иных видов сырья, в частности древесных гидролизатов (Яровенко В.Л. и др. «Непрерывное брожение в ацетонобутиловом производстве», Нальчик, 1962 г.), получаемых кислотным гидролизом, были частью основного направления исследований этого коллектива и касались разработки способа непрерывного ацетонобутилового брожения, с использованием уже упомянутого производственного штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 4361. Промышленного применения эти работы не нашли, но с появлением нового вида сырья появились разработки по созданию новых штаммов-продуцентов бутанола и ацетона (SU №1604852, 1988).

В настоящее время самыми многочисленными являются исследования по поиску микроорганизмов и конструированию штаммов, накапливающих максимальное количество бутанола при переработке воспроизводимых источников сырья.

Известен новый штамм термофильных бактерий Cl. Thermosaccharolyticum, сбраживающий глюкозу, целлюлозу, мальтозу, целлобиозу при 55-62°С с повышенным выходом бутанола; брожение идет в течение 1-4 дней. Питательная среда содержит источник азотного и органического питания, неорганические соединения. С целью повышения выхода бутанола в среду при выращивании штамма вносят 0.1-1.0 часть (вес.) бутанола (JP 61209594).

Известен мутантный штамм Clostridium beijerinckii BA101 (WO 9851813), обеспечивающий высокий выход бутанола, который составляет от 18 до 21 г/л при батарейном или непрерывном брожении.

Известен мутантный штамм Clostridium pasteurianum CA 101, полученный выращиванием в анаэробных условиях в среде азота при 37°С в течение 12 часов, при центрифугировании и с обработкой мутагеном N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином с последующим культивированием в среде, содержащей кротониловый спирт; мутант имеет высокую резистентность к кротониловому спирту и высокую продуктивность по бутанолу (JP 3058782).

Во всех цитированных источниках упоминается о сбраживании «углеводного сырья» и повышенных выходах бутанола, но не указываются виды сырья, что очень важно при сравнительной оценке эффективности штамма и возможного производственного использования его.

Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала высокопродуктивных штаммов и получение нового штамма, который был бы устойчив к повышенному содержанию бутанола и обладал способностью сбраживать широкий спектр недорогих и легкодоступных источников углерода, содержащихся в возобновляемых источниках сырья и полученных, в основном, из отходов.

Бактерии могут быть легко выращены и использованы в коммерческих целях, поскольку они являются генетически стабильными вследствие их выделения их природных изолятов. Они обладают высокой скоростью роста и получения растворителей.

Наиболее близким к предложенному является штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 5359 (S-3716), полученный путем индуцированного мутагенеза и отбора мутантных клонов на селективных средах (Патент RU №2080382).

Штамм отличает высокий выход растворителей, главное - бутанола, а кроме того, высокая степень сбраживания углеводов.

К недостаткам известного штамма следует отнести необходимость использования в качестве сырья для сбраживания - свеклосахарной мелассы, которая в настоящее время является основным сырьем в пищевой промышленности при получении хлебопекарских дрожжей и в производстве кормового белка для животноводства. Эти обстоятельства значительно сокращают возможность применения штамма. Следует отметить, что штамм получен с помощью химических мутагенов, поэтому возникает значительная степень риска при использовании его в производстве из-за вероятности расщепления мутанта и потери ценных свойств. Данные об устойчивости штамма авторами не приводятся.

Заявляемый штамм получен методом ступенчатой аналитической селекции изолятов, выделенных из отрубей риса (ручного обмолота) и полученных при последующих многократных высевах и выращивании на селективных средах, содержащих различные углеводы. Ступенчатый отбор проводился по признаку сбраживания нескольких видов углеводов, с возможностью расширения видов перерабатываемого сырья, в частности растительного. Для повышения резистентности к бутанолу в среду после стерилизации вносили от 0.5 до 10.0 г/л бутанола. Сброженную среду рассевали на агаризованную среду с внесением бутанола, выращивали в анаэробных условиях, проводили отбор и пересев на жидкие селективные питательные среды, отличающиеся по углеводному компоненту, источнику азота, количеству вносимого бутанола.

Анализировали сброженные среды и оценивали по количеству накопившегося бутанола, остаточного (несброженного) сахара, газов брожения. Были отобраны изоляты, наиболее активным из которых оказался изолят №8 (вариант 31), подтвердивший высокие показатели при повторных пересевах, который и был отобран, как штамм Clostrydium acetobutylicum №3108. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН и имеет регистрационный номер ВКМ B-2531D.

Продуктивность заявляемого штамма по сравнению с прототипом представлена в таблице.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиологические признаки.

Морфология клеток:

Вегетативные клетки бактерий с хорошей подвижностью, крупные палочковидные, одиночные или попарно, короткими цепочками, в зависимости от стадии развития культуры. Окраска по Граму положительная. Образуют эндоспоры. Тип образования спор бацилярный, споры овальные, диаметр 2-2.5 мкм.

Размер клеток: на 5-8 часу роста d=1.3-1.5 мкм, цепочки, длинные палочки, l=12-20 мкм; на 20-32 часу роста d=1.3-1.5 мкм, подвижные палочки (иногда попарно) l=5-8 мкм.

Культурально-морфологические признаки на разных питательных средах:

Агаризованная картофельная среда с глюкозой.

Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие с ровными краями колонии размером от 1.0 до 2.0-2.2 мм.

Структура колоний однородная, цвет - от светло-серого до белого, непрозрачные, поверхность гладкая, блестящая.

Среда мелассно-мучная.

Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие колонии размером от 1.0 до 2.0 мм, края ровные, структура однородная, цвет серо-белый, прозрачные, блестящие, выпуклые.

Среда с ферментолизатом древесных опилок и добавками.

Через 48 часов роста в анаэробных условиях при 37°С образует колонии размером до 1.0 мм, белые, непрозрачные, круглые, края ровные, поверхность блестящая.

Физиолого-биохимические признаки:

Облигатный гетеротрофный анаэроб.

Желатину разжижает.

На мясо-пептонном агаре (посев уколом) - слабый рост, разрывает газами брожения.

Отношение к источникам углерода:

Сбраживает: крахмал, мальтозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, ксилозу, галактозу, маннит, маннозу, арабинозу, лактозу, декстрин, целлобиозу.

Не сбраживает: раффинозу, дульцит.

Отношение к источникам азота:

Усваивает соединения азота в восстановленной форме.

Отношение к источникам фосфора:

Усваивает соединения фосфора.

Потребность в факторах роста:

Необходимы: биотин и парааминобензойная кислота.

Отношение к температуре:

Растет при температуре 30-38°С, оптимум 36-37°С.

Растет при значениях рН 4.5-7.0, оптимальные значения рН 5.5-6.5.

Хранение штамма - в виде спор на жидкой питательной среде картофельно-глюкозной, на мелассно-мучной, на среде с ферментолизатом древесных опилок в лиофилизированном состоянии.

Хранение в запаянных стеклянных пробирках при температуре от плюс 4°С до плюс 25°С.

Пример 1.

Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма-продуцента бутанола, ацетона и этанола.

Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в виде спор в запаянной пробирке, пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 1 минуты. Суспензией спор инокулируют 150 мл стерильной жидкой картофельно-глюкозной среды, имеющей следующий состав: картофель - 37 г/л, глюкоза - 0,75 г/л, СаСО3 - 0,3 г/л, (NH4)2 SO4 - 0,225 г/л, рН - 6.2, стерилизуют 40 мин при 120°С. Выращивание ведут в термостате при 37°С.

Через 12 часов роста при 36,5°С (экспоненциальная фаза роста бактерий) полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулируют стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 литра (полезная емкость 3 литра).

Состав среды: ферментолизат хвойно-лиственных опилок - 2,85 л
(соотношение глюкоза:ксилоза - 8:2,
концентрация сбраживаемых углеводов - 5,4%)
автолизат кормовых дрожжей - 3 г/л
биотин - 3 мг/л
парааминобензойная кислота - 3 мг/л

Стерилизацию ферментолизата (2,85 л) проводят через подготовленный мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. В стерильный ферментер вносят, соблюдая правила асептики, предварительно простерилизованный при 115°С раствор, в количестве 200 мл, состоящий из автолизата кормовых дрожжей, биотина и пара-аминобензойной кислоты. Ферментацию ведут при 36,5°С. Брожение заканчивается через 40 часов.

По окончании брожения методом газовой хроматографии определяют содержание бутанола, ацетона и этанола, содержание несброженных сахаров.

Сумма растворителей составляла 22,41 г/л, в том числе

Бутанол - 15,90 г/л (70,95%), ацетон - 6,01 г/л (26,82%), этанол - 0,50 г/л (2,23%)

Несброженный сахар - 0,28 г/л

Пример 2.

Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма - продуцента бутанола, ацетона и этанола.

Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в виде спор в запаянной пробирке, пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 1 минуты. Суспензией спор инокулируют стерильную питательную среду, состоящую из мелассы и муки в соотношении 1:1 (в пересчете на сбраживаемые углеводы). Через 12 часов в термостате при 36,5°С полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулируют стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 л (рабочий объем 3 л).

Состав среды: ферментолизат хвойных опилок - 2,85 л
соотношение глюкоза: ксилоза = 8.6:1.4
концентрация углеводов - 5,5%
(NH4)2SO4 - 4,5 г/л
жмых зародышей пшеничного зерна - 3,0 г/л

Ферментацию ведут при 36,5°С. По окончании брожения определяют содержание растворителей, несброженных углеводов, объем выделившегося газа.

Сумма растворителей составила 22,38 г/л, в том числе

Бутанол - 15,78 г/л (70,50%), ацетон - 6.6 г/л (29,49%), этанол - следы (0,01%)

Содержание несброженного сахара - 0,25 г/л

Пример 3.

Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма.

Заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в запаянной пробирке, пастеризовали в кипящей водяной бане в течение 1 мин. Суспензией спор инокулировали стерильную питательную среду, состоящую из мелассы и муки в соотношении 1:1 (в пересчете на сбраживаемые углеводы). Через 12 часов роста в термостате при 36,5°С полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулировали подготовленную стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 л (рабочий объем 3 л).

Состав среды: - упаренная подсырная молочная сыворотка - 2,85 л
(содержание лактозы 20 г/л, т.е. 57,0 г)
сахароза - 100 г
жмых зародышей пшеницы - 3,0 г/л

Концентрация углеводов в среде составляла 5,4%.

Сахарозу вносили в молочную сыворотку и стерилизовали при 110°С в течение 30 минут. Измельченный в тонкий порошок жмых вносили в 25 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 110°С в течение 20 минут, и вносили в стерильную питательную среду при соблюдении правил асептики.

Инокулировали 150 мл. Ферментация проходила при 36,5°С. По окончании брожения определяли содержание растворителей, несброженные углеводы, объем выделившегося газа.

Сумма растворителей составила 22,38 г/л, в том числе

Бутанол 15,78 г/л (70,50%), ацетон 6,3 г/л (28,15%), этанол 0,3 г/л (1,35%).

Содержание несброженного сахара 0,25 г/л.

Таким образом, получен новый штамм, Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, продуцирующий бутанол, ацетон и этанол. Новый штамм, обеспечивая высокий выход целевых продуктов, обладает способностью утилизировать широкий спектр недорогих и легкодоступных источников углерода (которые в большинстве своем получены из отходов).

Таблица
Штамм продуктивность Конверсия углеводов
бутанол ацетон этанол сумма
S-3716 15,50 6,50 нет 22,00 40%
B-2531D 15,9 6,01 0,50 22,41 41,5%

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D - продуцент бутанола, ацетона и этанола.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике трихомонадной инфекции. .

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Neisseria gonorrhoeae путем секвенирования вариабельных участков трех генов Neisseria gonorrhoeae, таких как роr, tbp и одного из наиболее вариабельных генов домашнего хозяйства Neisseria gonorrhoeae - гена glnA - Glutamme synthetase, полученных стандартным способом из чистой культуры штамма Neisseria gonorrhoeae и подвергнутых амплификации с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано при диагностике гонореи. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения фермента, предпочтительно целлюлазы или ксиланазы, расщепляющих целлюлозу или ксиланы соответственно, путем культивирования штамма гриба Penicillium verruculosum.
Изобретение относится к микробиологии, аллергологии и биотехнологии и предназначено для получения безальбумозного нативного аллергена для аллергической диагностики стафилококкоза у животных.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis путем секвенирования вариабельных участков трех генов Chlamydia trachomatis, таких как ompA, tsf, pmpF, полученных из бактериальной ДНК Chlamydia trachomatis, выделенной из клинического материала пациентов с урогенитальным хламидиозом, подвергнутых амплификации с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается способа культивирования микобактерий туберкулеза. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.

Еч5/1ис // 364664

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения бутанола, ацетона и этанола

Наверх