Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, пищевой и промышленной биотехнологии. Для определения активности антимикробного препарата готовят четыре одинаковые суспензии тестовых микроорганизмов. В первую вводят физраствор, во вторую - антимикробный препарат в предварительно выбранной концентрации С_преп, в третью - физраствор, в четвертую - такое же количество антимикробного препарата. После некоторого времени t_d в третью и четвертую суспензии вводят детергент, а первые два образца суспензий доливают физраствором так, чтобы концентрации микроорганизмов оказались одинаковыми во всех четырех образцах суспензии. Измеряют с помощью лазерного и/или нелазерного флуориметра уровни флуоресценции этих суспензий в момент времени t₁ и через интервал времени Δt, равный примерно 15 минутам. Затем еще раз проводят измерения в момент времени t₂ и через интервал времени Δt. Далее, используя измеренные значения, вычисляют эффективность антимикробного препарата ε, решая кинетические уравнения. Использование способа позволяет сократить время определения эффективности антимикробного препарата, повысить точность и упростить определение предпочтительного антимикробного препарата. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, микробиологии, пищевых и промышленных биотехнологий, а именно к исследованию биологических материалов путем определения их физических и химических свойств с помощью оптических средств, к системам, в которых материал возбуждается оптическими средствами и он флуоресцирует.

При воздействии препарата искусственного и/или естественного фактора на систему, содержащую микроб, чаще всего происходит избирательный киллинг живых микроорганизмов, либо этого не происходит. Только в этом случае по измеренному количеству живых микробов на основе определения скорости их гибели в нескольких моментах времени, в течение которого происходит воздействие лечебного препарата, можно объективно оценить эффективность лечения. При этом в указанном контексте в настоящее время методы определения живых микробов на фоне всех микробов имеют субъективный уровень оценки их концентрации, при этом измерение скорости их гибели не может быть проведено с нужной точностью вследствие наличия указанного недостатка, то есть мертвых микробов в микробных ассоциациях. Это связано с тем, что в большинстве случаев непосредственное определение концентрации микробов содержит систематический множитель, который не влияет на определяемую скорость.

Известен способ определения эффективности антимикробного препарата на основе диско-диффузионного метода, в котором приблизительную скорость гибели микробов определяют по визуальной оценке, в течение определенного интервала времени по изменениям зоны поражения микробной суспензии антимикробным препаратом. Затем по найденным интервалам вычисляют скорость (Осипов Г.А., Парфенов А.И., Богомолов П.О. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и биоптатах слизистой оболочки кишечника. Российский гастроэнтерол. журнал. 2001, 1: 54-69).

Этот способ позволяет определять эффективность антимикробного препарата несложным, но длительным образом.

Недостаток его и в том, что он достаточно неточен и имеет субъективный характер оценки.

Известен также способ определения эффективности антимикробного препарата, который позволяет определять эффективность непосредственно, во многих условиях наблюдения. Он основан на прямом подсчете количества клеток во времени при помощи лабораторного контроля, на основе которого устанавливают кинетику изменения, далее делают вывод о скорости гибели микробов и эффективности антимикробного препарата (Garrett ER. Kinetics of antimicrobial action. Scand J Infect Dis Suppl. 1978; 14: 54-85).

Этот способ определения эффективности антимикробного препарата позволяет определять эффективность антимикробного препарата без косвенных показателей.

Недостаток аналога в том, что он достаточно сложен и дорог, а также не позволяет проводить измерение в экспресс-режиме.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения эффективности антимикробного препарата, который основан на оценке скорости гибели с использованием техники хромато-масс-спектрометрии для проведения анализа относительной концентрации микробов в нужный момент времени. Для этого при использовании данной технологии определяют по способу концентрацию специфических молекул, принадлежащих микробам, и на их основании судят о количестве микробных клеток. Осуществляется оценка убыли популяции живых организмов при помощи лабораторного трудоемкого анализа, что не позволяет достаточно быстро оценивать эту величину. Такие проблемы связаны с необходимостью предварительной обработки субстрата химическими препаратами с целью спецификации молекул, принадлежащих микробам исследуемого типа и с применением для дальнейшего детектирования этих химических компонент дорогостоящей аппаратуры, что в конечном итоге позволяет рассчитать скорость гибели микробов по предлагаемой авторами формуле (Осипов Г.А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах). Вестник РАМН. - 1996. Т.13, №2, с.52-59.)

Техническим результатом предлагаемого способа является сокращение времени определения эффективности антимикробного препарата, повышение точности и простота определения предпочтительного антимикробного препарата.

Данный технический результат достигается тем, что в способе определения активности антимикробного препарата готовят четыре одинаковые суспензии тестовых микроорганизмов и в первую вводят физраствор, во вторую вводят антимикробный препарат в предварительно выбранной концентрации С_преп, в третью вводят физраствор, в четвертую вводят такое же количество антимикробного препарата, после некоторого времени t_d в третью и четвертую суспензии вводят выбранный детергент, а первые два образца суспензий доливают физраствором так, чтобы концентрации микроорганизмов оказались одинаковыми во всех четырех образцах суспензии, и измеряют с помощью лазерного и/или нелазерного флуориметра уровни флуоресценции этих суспензий в момент времени t₁ и через интервал времени Δt, равный примерно 15 минутам, потом еще раз проводят измерения в момент времени t₂ и через интервал времени Δt, таким образом далее используя измеренные значения вычисляют эффективность антимикробного препарата ε, численно решая следующее уравнение относительно ε

(((Ф₁)_t-(Ф_n1)_te^εt1)/((Ф_d1)_t-(Ф_nd1)_te^εt1))^{(t2-td)/(t1-td)}=

=((Ф₂)_t-(Ф_n2)_te^εt2)/((Ф_d2)_t-(Ф_nd2)_te^εt2))

где ε - эффективность препарата, (Ф₁)_t, (Ф_n1)_t, (Ф_d1)_t, (Ф_nd1)_t, (Ф₂)_t, (Ф_n2)_t, (Ф_d2)_t и (Ф_nd2)_t - производные уровней флуоресценции суспензий без ничего, с антимикробным препаратом, с детергентом и с антимикробным препаратом с детергентом вместе в момент времени t₁ и аналогично в момент времени t₂, при этом производные считаются по следующей формуле

(Ф_ij)_t=(Ф_i(t_j+Δt)-Ф_i(t_j))/Δt

где (Ф_ij)_t - производная по времени уровня флуоресценции i-го образца в момент времени t_j, Ф_i(t_j) и Ф_i(t_j+Δt) - уровни флуоресценции i-го образца в моменты времени измерения t_j и t_j+Δt. Затем по максимальному значению е выбирают предпочтительный антимикробный препарат. Для частного случая, когда t_d=0, t₂=2t₁ эффективность антимикробного препарата е вычисляют по явной формуле

ε=ln((--++P-bD+-+-sqrt((bD++--P)²-8D²(c++--D))/4D)/t₁

D=sqrt(c²-4e); P=bc-2d

где ln(х) - натуральный логарифм от аргумента х, sqrt(x) - корень квадратный от аргумента х, а первые, вторые, третие или четвертые знаки перед знакопеременными членами ставятся в зависимости от хода четырех кривых Ф_i(t) и выбираются по критерию действительности и положительности величины ε, и далее по максимальному значению ε выбирают соответствующий антимикробный препарат.

Описание способа

Способ основывается на проведении нескольких измерений во времени уровней флуоресценции четырех суспензий микроорганизмов, во вторую и четвертую из которых в самом начале был добавлен антимикробный препарат в одинаковой концентрации. Потом по прошествии некоторого времени в третью и в четвертую добавляют детергент в одинаковой концентрации. Все препараты и чистый физраствор добавляют таким образом, чтобы в итоге концентрации микроорганизмов во всех четырех образцах были одинаковыми. Измерения проводят на стандартной аппаратуре для измерения общей интенсивности и/или спектральных характеристик флуоресценции, индуцированной излучением лазера и/или источника со сплошным спектром эмиссии. Для вычисления эффективности антимикробного препарата по результатам измерений как с использованием детергента, так и без использования детергента воспользуемся следующей моделью. Допустим, что концентрация микроорганизмов в суспензиях растет под действием различных факторов роста f(t) и убывает под действием факторов эффективности антимикробного препарата ε и детергента g. Естественно, вклады в скорость изменения концентрации микроорганизма dC/dt от указанных факторов пропорциональны самой концентрации клеток микроорганизма С в суспензии. Предположим также, что в суспензии кроме внутриклеточных флуорофоров присутствуют внешние флуорофоры, выбрасываемые микробными клетками во внешнюю среду и в результате Киллинга антимикробным препаратом и детергентом. Концентрацию внешних флуорофоров обозначим через С_в. В итоге получаем систему из двух уравнений

где Q - коэффициент, выражающий производительность клеток микроорганизма для выработки внешних флуорофоров, k - удельная скорость приращения концентрации внешних флуорофоров за счет антимикробного препарата, d - удельная скорость приращения концентрации внешних флуорофоров за счет детергента. Считаем, что утилизация внешних флуорофоров не происходит.

Выходы флуоресценции для флуорофоров внутри и снаружи клеток неодинаковы. Обозначим их через γ_в и γ_к. Уровни флуоресценции исследуемых образцов субстратов тогда будут даваться выражением (с учетом флуоресценции препаратов):

где С_вn, C_вd и C_вnd - концентрации внешних флуорофоров в образцах с препаратом, с детергентом и препаратом и детергентом вместе соответственно, C_n, C_d и C_nd - концентрации живых микроорганизмов в образцах с препаратом, с детергентом и препаратом и детергентом вместе соответственно, F_n и F_d - уровни собственной флуоресценции антимикробного препарата и детергента. Будем считать, что флуоресценции препаратов не зависят от времени.

Из первого уравнения системы (1) следует, что

Продифференцируем по времени все четыре уравнения системы (2). Тогда с учетом (1) и (3) получим следующую систему равенств

Помножим второе и четвертое уравнения на e^εt и вычтем из первого второе и из третьего четвертое. Получим следующие два равенства

Поделив первое уравнение на второе в (5), получим равенство

Рассмотрим измерения производных (Ф)_t в два момента времени t₁ и t₂ после добавления детергента. Для этих моментов времени будут справедливы следствия из равенства (6)

где (Ф_i1)_t и (Ф_i2)_t - производные уровней флуоресценции для i-го образца в моменты времени t₁ и t₂ соответственно.

Взяв степени от первого и второго уравнения из (7) по 1/(t₁-t_d) и 1/(t₁-t_d) соответственно и приравняв правые части от полученных равенств, будем иметь

Или переписав в другую форму, получим

Это уравнение является трансцедентальным, поэтому в общем случае его можно решить численно на вычислительной машине относительно интересующей нас величины ε. По вычисленному значению эффективности антимикробного препарата можно судить об его предпочтительности: чем выше ε, тем антимикробный препарат предпочтительней.

Рассмотрим частный случай, когда детергент добавляют сразу после приготовления суспензий (t_d=0), а измерения и вычисления производных проводят во время t₁ и t₂=2 t₁. Тогда уравнение (9) преобразуется в следующую форму:

где х=e^εt1.

Это уравнение относительно х можно привести к алгебраическому уравнению четвертой степени

В этом уравнении коэффициентами перед членами разных степеней являются следующие величины

Уравнение (11) имеет четыре решения

где D=sqrt(c²-4e) и P=bc-2d, a b=b'/a', с=с'/а', d=d'/a' и е=е'/а'. Здесь под знаком sqrt() обозначен корень квадратный от аргумента. Каждому решению соответствует свой порядковый номер знака перед знакопеременными членами в (13). В зависимости от характера соотношений между (Ф)_t, (Ф_n)_t, (Ф_d)_t и (Ф_nd)_t единственному физическому решению будут соответствовать разные номера решений (13). Критерием выбора решений будет неотрицательность и действительность величины ε

Эта величина будет критерием выбора предпочтительного антимикробного препарата.

Производные, встречающиеся в описании, могут быть найдены на практике по следующей формуле

где (Ф_ij)_t - производная по времени уровня флуоресценции i-го образца в момент времени t_j, Ф_i(t_j) и Ф_i(t_j+Δt) - уровни флуоресценции i-го образца в моменты времени измерения t_j и t_j+Δt.

Пример применения

Описанным выше предполагаемым способом были определены скорости гибели микробов S. Aureus, при воздействии 4 различных препаратов: Ванкомицин, Хинупристин-дальфопристин, Линезолид и Даптомицин. Для проверки эффективности данных препаратов проводят опыт, который происходит по следующему алгоритму. Приготовляют суспензии микроорганизмов S. Aureus в концентрации 10⁹ КОЕ/мл в 10 образцах. Образцы разделяют на группы по 2 образца и на каждой группе из 4-х испытывают по отдельному препарату, перечисленному выше, и последнюю группу используют в качестве контроля. В каждый второй образец из всех групп добавляют детергент мирамистин в стандартной концентрации. Во все образцы каждой группы добавляют соответствующий препарат в одинаковой концентрации; в группу контроля доливают физраствор в объеме, равном объему добавляемых растворов препаратов. Далее измеряют интенсивности образцов через 30 минут, через 35 минут, через 60 минут и через 65 минут. Результаты вычислений даны в нижеследующей таблице значений вычисленных эффективностей для четырех типов антимикробных препаратов.

Препарат	Ванкомицин	Хинупристин-дальфопристин	Линезолид	Даптомицин
ε	1,35	2,2	2,8	3,6

Из этого набора антимикробных препаратов предпочтительным оказался Даптомицин. Ошибка измерения эффективности препарата равна ±0.6 отн. ед.

Отдельно на чертеже приведен график зависимости от времени уровней флуоресценции суспензий без ничего (Ф) и с антимикробным препаратом (Ф_n), с детергентогм без препарата (Ф_d) и с детергентом вместе с антимикробным препаратом (Ф_nd).

1. Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата, согласно которому в суспензию тестового микроорганизма вводят антимикробный препарат в определенной концентрации, отличающийся тем, что готовят четыре одинаковые суспензии тестовых микроорганизмов и в первую вводят физраствор, во вторую вводят антимикробный препарат в предварительно выбранной концентрации С_преп, в третью вводят физраствор, в четвертую вводят такое же количество антимикробного препарата, после некоторого времени t_d в третью и четвертую суспензии вводят детергент, а первые два образца суспензий доливают физраствором так, чтобы концентрации микроорганизмов оказались одинаковыми во всех четырех образцах суспензии, и измеряют с помощью лазерного и/или нелазерного флуориметра уровни флуоресценции этих суспензий в момент времени t₁ и через интервал времени Δt, равный примерно 15 мин, потом еще раз проводят измерения в момент времени t₂ и через интервал времени Δt, таким образом, далее используя измеренные значения, вычисляют эффективность антимикробного препарата ε, численно решая следующее уравнение относительно ε:
(((Ф₁)_t-(Ф_n1)_te^εt1)/((Ф_d1)_t-(Ф_nd1)_te^εt1))^{(t2-td)/(t1-td)}=
=((Ф₂)_t-(Ф_n2)_te^εt2)/((Ф_d2)_t-(Ф_nd2)_te^εt2)),
где ε - эффективность препарата, (Ф₁)_t, (Ф_n1)_t, (Ф_d1)_t, (Ф_nd1)_t, (Ф₂)_t, (Ф_n2)_t, (Ф_d2)_t и (Ф_nd2)_t - производные уровней флуоресценции суспензий без ничего, с антимикробным препаратом, с детергентом и с антимикробным препаратом с детергентом вместе в момент времени t₁ и аналогично в момент времени t₂, при этом производные считаются по следующей формуле:
(Ф_ij)_t=(Ф_i(t_j+Δt)-Ф_i(t_j))Δt,
где (Ф_ij)_t - производная по времени уровня флуоресценции i-го образца в момент времени t_j, Ф_i(t_j) и Ф_i(t_j+Δt) - уровни флуоресценции i-го образца в моменты времени измерения t_j и t_j+Δt, и далее по максимальному значению ε выбирают соответствующий предпочтительный антимикробный препарат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что добавление детергента проводят в момент времени t_d=0, а измерения проводят в моменты времен t₁ и t₂=2t₁, и эффективность антимикробного препарата ε вычисляют по формуле
ε=ln((--++P-bD+-+-sqrt((bD++--P)²-8D²(c++--D))/4D)/t₁,
D=sqrt(c²-4e); P=bc-2d,





где ln(х) - натуральный логарифм от аргумента х, sqrt(x) - корень квадратный от аргумента х, а первые, вторые, третьи или четвертые знаки перед знакопеременными членами ставятся в зависимости от хода четырех кривых Ф_i(t) и выбираются по критерию действительности и положительности величины ε, и далее по максимальному значению ε выбирают соответствующий предпочтительный антимикробный препарат.