Штамм бактерий bacillus mucilaginosus, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор, и его применение
Владельцы патента RU 2409660:
Богомолов Сергей Викторович (RU)
Кандыба Екатерина Владимировна (RU)
Назаров Абдынаби Ганиевич (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор. Также штамм может быть применен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Урожайность сельскохозяйственных культур составляет до 341,0 ц/га, а степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями составляет 1,1-33,2%. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.
Известен штамм Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 (патент РФ №2081867). Указанный штамм обладает способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму. Недостатком штамма является отсутствие у него антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям.
Известен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, прототип (патент РФ №2289621), который повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям. К недостаткам штамма можно отнести невысокую прибавку урожая, получаемую для ряда культур.
Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и повышающих урожайность сельскохозяйственных культур.
Поставленная задача решается тем, что получен штамм Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму, что позволяет использовать его в растениеводстве для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.
Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 выделен из огородных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), хорошая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, способность трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ В-10369.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
При микроскопировании клетки неподвижные, крупные палочки правильной формы с округлыми концами, одиночные, окружены капсулой. В молодой культуре встречаются клетки в парах, иногда в коротких цепочках.
Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах в интервале 1,0-1,6×3-7µ. Грамотрицательны, но окраска по Грамму может варьировать.
При выращивании на картофельном агаре (масс.%: картофельный отвар - 98,0; агар - 2,0) и среде Александрова (масс.%: K2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,05; FeCl2 - следы; сахароза - 0,5; силикаты - 0,1; СаСО3 - 0,01 (растирается с силикатами); агар - 2,0) при 29±1°С в течение 72-96 часов колонии большие, диаметром 3-8 мм, слизистые, выпуклые, прозрачные, сильно распространяются по всей поверхности питательной среды, полный цикл развития завершается спорообразованием.
При выращивании на агаризованной среде Эшби (масс.%: сахароза - 2,0; K2HPO4 - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO4 - 0,02; СаСО3 - 0,5; K2SO4 - 0,5; агар - 2,0) при температуре 29±1°С в течение 96 часов колонии выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые, с ровным краем, вязкой консистенции, диаметром 1-4 мм.
При выращивании на среде Сурмана с мелассой (масс.%: меласса - 0,5; K2HPO4 - 0,03; MgSO4 - 0,01; NaCl - 0,05; KNO3 - 0,1; СаСО3 - 1,0) при температуре 29±1°С в течение 48 часов культура представляет собой вязкую жидкость; при микроскопировании клетки крупные единичные палочки и споры до 130-250 млн/мл.
На средах без источника азота (среда Эшби) споры не образуются. При перенесении вегетативных клеток со среды Эшби на картофельный агар или на среду Сурмана с мелассой способность к спорообразованию восстанавливается. Споры имеют овальную форму 1,5-1,8µ в диаметре.
На белковых средах (МПА, МПБ, молоке) рост отсутствует (иногда наблюдается очень слабое развитие). Гидролизует крахмал. Желатин не разжижает.
Физиолого-биохимические признаки.
Мезофил, рост возможен в интервале 20-40°С, оптимальная для роста и спорообразования температура 29±1°С.
Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.
Возможен рост при рН 6,0-8,5, оптимально для роста и спорообразования рН 6,8-7,2.
Отношение к источникам углеводов.
Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, фруктозе, мальтозе, галактозе, ксилозе, арабинозе. Из спиртов усваивает сорбит, маннит, глицирин, лактат, цитрат. Не усваивает целлюлозу, этанол, бутанол, ацетат.
Отношение к источникам азота.
В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид и нитраты.
Отношение к нерастворимым соединениям фосфора.
Штамм обладает способностью растворять силикаты, апатиты, трикальцийфосфат, нуклеонат натрия, биотит, цеолит (табл.1).
Таблица 1 Влияние штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 на нерастворимые фосфаты |
||
№ п/п | Наименование показателя | Числовое значение показателя |
1. | Число жизнеспособных клеток (КОЕ) | 200 млн/мл |
2. | Накопление фосфора в жидкой культуре при внесении в среду (в пересчете на Р2О5): | |
- нуклеонат натрия | 83,0 мг/мл | |
- трикальций фосфат | 25,0 мг/мл | |
- фторапатит | 4,0-6,0 мг/мл | |
- цеолит | 3,0-5,0 мг/мл |
Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям.
Антагонистическую активность определяли методом «лунок» (Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: Высшая школа, 1965, с.131) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах.
Показано, что исследуемый штамм подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium sp. и бактерий Erwinia phytophtora, Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Erysiphe graminis, Septoria graminum, Actinomyces sp. (табл.2).
Таблица 2 Спектр антагонистической активности штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 |
|
Тест-культура | Зона подавления роста, мм |
Alternaria sp. | 6 |
Pythium sp. | 5 |
Erwinia phytophtora | 4 |
Rhizoctonia sp. | 10 |
Puccinia triticina | 7 |
Erysiphe graminis | 5 |
Septoria graminum | 7 |
Actinomyces sp. | 5 |
Штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава, масс.%: крахмал - 1,0; K2HPO4 - 0,02; NaCl - 0,02; NH4NO3 - 0,1; агар - 2,0, при температуре 4±2°С до 3-х лет.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 в лабораторных условиях.
Штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-0000 выращивают в колбах на качалке на жидкой питательной среде следующего состава (масс.%): сахароза - 2,0; K2HPO4 - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO4 - 0,02; NH4NO3 - 0,02; СаСО3 - 0,5; K2SO4 - 0,5, вода - остальное. Колбы засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды и выращивают в течение 72 часов при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании.
Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 250 млн спор/мл, которую используют для обработки почвы и семян.
Пример 2. Культивирование штамма Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369 в ферментере.
Стерильную питательную среду по примеру 1 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 36 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.
Полученной культурой засевают ферментер объемом 1 м3 с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав (масс.%): меласса - 0,5; K2HPO4 - 0,03; MgSO4 - 0,01; NaCl - 0,05; KNO3 - 0,1; СаСО3 - 1,0 из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании - аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 60 часов. Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 200 млн спор/мл, которую используют для обработки почвы и семян.
Пример 3. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур. Препарат, полученный по примеру 2, применяют для проведения испытаний в открытом грунте:
- на сахарной свекле и гречихе в НИИ Агропромышленного производства (г.Курск);
- на картофеле во ВНИИ Картофельного хозяйства (Московская область);
- на яровой пшенице в Приморской государственной сельхозакадемии (г.Владивосток);
- на ячмене в Кубанском Государственном аграрном университете (г.Краснодар);
- на озимой пшенице в НИИ Агропромышленного производства (г.Курск).
В каждом случае обработку почвы препаратом проводят перед посевом семян на площади 6 га из расчета 200 мл препарата/га. Для удобства внесения жидкую культуру перед использованием разводят водой в 1000 раз.
В качестве контроля приведены результаты, полученные в аналогичных условиях, но без предварительной обработки почвы препаратом.
Результаты испытаний, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus ВМ-09 ВКПМ В-10369, оказывает положительное влияние на урожайность ряда сельскохозяйственных культур.
Таблица 3 | ||||
Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур | ||||
Обрабатываемые культуры | Урожай, ц/га | Прибавка урожая | ||
контроль | препарат | ц/га | % | |
Озимая пшеница | 19,9 | 22,1 | 2,2 | 11,0 |
Яровая пшеница | 13,4 | 15,3 | 2,1 | 14,1 |
Сахарная свекла | 279,0 | 341,0 | 62,0 | 22,2 |
Гречиха | 9,2 | 10,5 | 1,3 | 14,1 |
Картофель | 236,0 | 319,0 | 83,0 | 35,0 |
Ячмень | 17,8 | 21,4 | 3,6 | 12,2 |
Пример 4. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.
Опыты по изучению влияния препарата, полученного по примеру 2, на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями проводили:
- для яровой и озимой пшеницы в Курском НИИАПП и Ульяновском НИИСХ;
- для картофеля в Брянском филиале ВНИИКХ (г.Брянск).
В каждом случае обработку почвы проводили препаратом на площади 5 га из расчета 200 мл/га. Перед использованием жидкую культуру разводят водой в 1000 раз.
Результаты, приведенные в табл.4, показывают, что степень поражения болезнями значительно меньше в случае предварительной обработки почвы, т.е. препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.
Таким образом, получен штамм Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, характеризующийся:
- хорошим ростом на производственных средах в условиях глубинной ферментации;
- способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор;
- широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры.
Показано, что жидкая культура, полученная на основе штамма Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, повышает урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к заболеваниям.
Таблица 4 | ||||||||
Влияние препарата на степень поражения пшеницы различными болезнями | ||||||||
Варианты опыта | Яровая пшеница Степень поражения % |
Озимая пшеница Степень поражения % |
Картофель | |||||
Ботва | Клубни | |||||||
Бурая ржавчина, % | Мучни- стая роса |
Корневые гнили | Бурая ржавчина, % | Септориоз, % | Фитофтороз, % | Вирусные, % | Парша, % | |
Ульяновский НИИСХ | ||||||||
Контроль | 48,4 | - | 12,5 | - | - | - | - | - |
Препарат | 33,2 | - | 7,5 | - | - | - | - | -- |
Курский НИИАПП | ||||||||
Контроль | 25,5 | 2,5 | - | 26,5 | 46,9 | - | - | - |
Препарат | 12,0 | 1,1 | - | 12,0 | 27,9 | - | - | - |
Брянский филиал ВНИИКХ | ||||||||
Контроль | - | - | - | - | - | 8,3 | 14,9 | 6,3 |
Препарат | - | - | - | - | - | 6,2 | 13,9 | 4,1 |
1. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и способностью трансформировать труднодоступный для растений фосфор.
2. Применение штамма бактерий Bacillus mucilaginosus BM-09 ВКПМ В-10369 для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к заболеваниям.