Способ получения иммобилизованных бислойных везикул


 


Владельцы патента RU 2409668:

Ярославов Александр Анатольевич (RU)
Царькова Лариса Александровна (RU)
Сыбачин Андрей Владимирович (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованных бислойных везикул. Способ получения иммобилизованных бислойных везикул осуществляют за счет обработки носителя, содержащего привитые полимерные цепи, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе. При осуществлении данного способа в качестве носителя используют модифицированные твердые поверхности или модифицированные дисперсные частицы. Данные носители содержат по крайней мере один привитой катионный или анионный полимер с плотностью посадки полимера не менее 200 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя. В качестве бислойных везикул используют анионные или катионные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества и несущие поверхностный заряд противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя. Изобретение позволяет упростить способ получения иммобилизованных бислойных везикул.

 

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, биоаналитики и касается способа получения иммобилизованных бислойных везикул.

Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки твердой поверхности слюды водной суспензией специально приготовленных агрегатов бислойных липидных везикул, приводящей к формированию на поверхности липидного полислоя с включенными в него везикулами (О.Teschke, E.F. de Souza, Liposome structure imaging by atomic force microscopy: verification of improved liposome stability during adsorption of multiple aggregated vesicles, Langmuir, 2002, v.l8, p.6513).

Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем последовательной обработки стеклянной подложки бычьим сывороточным альбумином, олеил-O-полиэтиленгликолем и водной суспензией отрицательно заряженных везикул (US Patent №7501280, класс 435/325).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя (стекла с предварительно нанесенным липидным бислоем), содержащего привитые полимерные цепи олигонуклеотида 1, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе. В данном способе в качестве бислойных везикул используют везикулы, содержащие ковалентно связанный олигонуклеотид 2 комлементарный олигонуклеотиду 1 (Chiaki Yoshina-Ishii, Steven G. Boxer, Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipid bilayers, J. Am. Chem. Soc., 2003, v.125, p.3696) - прототип.

Недостатками известного способа являются его сложность, заключающаяся в многостадийности процесса, требующей предварительной модификации поверхности носителя липидным бислоем (стадия 1), химической активации концевой 5'-дисульфидной группы олигонуклеотида 2 путем ее обработки избытком трис(2-карбокиэтил)фосфина (стадия 2) и модификации полученным соединением бислойных липидных везикул (стадия 3), а также необходимость проведения многократной очистки полупродуктов и конечного продукта.

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа получения иммобилизованных бислойных везикул.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя, содержащего привитые полимерные цепи, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе в качестве носителя используют модифицированные твердые поверхности или модифицированные дисперсные частицы, содержащие по крайней мере один привитой катионный или анионный полимер с плотностью посадки полимера не менее 200 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя, а в качестве бислойных везикул используют анионные или катионные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества и несущие поверхностный заряд противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя.

Предлагаемый способ позволяет сохранять целостность иммобилизованных на поверхности бислойных везикул.

В предлагаемом способе в качестве носителя можно использовать модифицированные твердые поверхности, например стекло, слюду, полимерные пленки и т.д., и модифицированные дисперсные частицы, например полимерные микросферы, углеродные нанотрубки, силикатные наночастицы и т.д. Модификацию твердых поверхностей или дисперсных частиц осуществляют путем ковалентной иммобилизации (прививки) катионных или анионных полимеров по концевой группе на поверхности носителя. При других способах фиксации полимеров на твердых поверхностях или дисперсных частицах может происходить разрушение слоя везикул, иммобилизованных на поверхности носителя. Для прививки катионных или анионных полимеров на поверхность носителя можно использовать любой известный метод прививки, например, радикальную полимеризацию с переносом атома. Носитель можно использовать как в твердом виде, так и в виде суспензии в воде или водно-солевом растворе.

Плотность посадки полимера на поверхность носителя должна составлять не менее 200 привитых полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя. При меньшей плотности посадки привитых цепей полимера может наблюдаться частичное либо полное разрушение иммобилизованных везикул.

В качестве бислойных везикул можно использовать бислойные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества, то есть вещества, в структуре которого имеются как гидрофильные, так и гидрофобные области. Гидрофобные области могут содержать, например, один, два или три алифатических радикала. Бислойные везикулы обязательно должны нести поверхностный заряд противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя. При невыполнении этого условия предлагаемый способ не работает.

Обработку модифицированного полимером носителя суспензией бислойных везикул можно проводить в воде или водно-солевом растворе. Обработку можно осуществлять в широком интервале температуре, например от 5 до 90°С. Иммобилизация везикул на поверхности модифицированного полимером дисперсного носителя может сопровождаться образованием коагулирующего осадка, который может быть вновь переведен в коллоидную дисперсию путем добавления новой порции суспензии модифицированного носителя или бислойных везикул.

При обработке модифицированного полимером носителя суспензией бислойных везикул рН среды и концентрация соли в водно-солевом растворе могут варьироваться в широких пределах. Конкретные значения этих параметров выбирают с учетом состава везикул и химической природы привитых полимерных цепей.

Иммобилизованные на поверхности везикулы могут быть использованы в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения различных веществ, например лекарств, пищевых добавок, катализаторов химических реакций и т.д.

Строение и состав конечных продуктов, получаемых с помощью предлагаемого способа, могут быть оценены и доказаны различными физико-химическими методами: лазерным электрофорезом, динамическим светорассеянием, флуоресценцией, электронной микроскопией, эллипсометрией, атомно-силовой микроскопией и проч.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

Бислойные везикулы со средним размером 50 нм получают в 10-2 М фосфатном буфере с рН 7 из смеси анионного кардиолипина и электронейтрального фосфатидилхолина методом озвучивания. Внутренний водный объем везикул заполняют 1 М раствором NaCl. Бислойные везикулы, иммобилизованные на поверхности дисперсного носителя, получают смешением 0.9 мл 3%-ной водной суспензии дисперсных частиц метилметакрилатного латекса диаметром 100 нм, содержащих привитые катионные цепи поли-2-метилпропеноилоксиэтилтриметиламмоний бромида с плотностью посадки 1000 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности частицы, с 0.1 мл 1%-ной водно-солевой суспензией бислойных везикул, заполненных раствором NaCl. Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут; продукт - частицы латекса с иммобилизованными везикулами - отделяют центрифугированием. Отсутствие поглощения в области λ=240-350 нм в надосадочной жидкости (супернатанте) указывает на отсутствие в ней везикул, то есть на количественное связывание везикул с частицами носителя. Целостность везикул контролируют, измеряя проводимость супернатанта и сравнивая ее с проводимостью 10-2 М фосфатного буферного раствора в отсутствии везикул. Совпадение результатов свидетельствует об отсутствии вытекания NaCl из везикул в окружающий раствор, то есть о том, что целостность везикул после их иммобилизации на поверхности носителя сохраняется. Методом криогенной просвечивающей электронной микроскопии показано, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Из примера видно, что предлагаемый способ обеспечивает количественную иммобилизацию везикул на поверхности модифицированных полимером дисперсных частиц и сохранение целостности иммобилизованных везикул. Конечный продукт может быть использован без дополнительной очистки.

Пример 2.

Бислойные везикулы со средним размером 70 нм получают в 10-2 М фосфатном буфере с рН 8 из смеси катионного диметилдицетиламмоний бромида и электронейтрального диолеоилфосфатидилхолина методом озвучивания. Внутренний водный объем везикул заполняют 10-5 М раствором флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина (КФ). Бислойные везикулы, иммобилизованные на твердой поверхности, получают нанесением 0.1 мл 1%-ной суспензии бислойных везикул, заполненных КФ, на стеклянную пластинку размером 1 см × 1 см и толщиной 0.1 см, на поверхности которой были привиты анионные полимерные цепи полиакриловой кислоты с плотностью посадки 1500 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности пластинки. Пластинку с нанесенной суспензией везикул выдерживают при комнатной температуре и 100%-ной влажности в течение 7 минут; продукт -пластинку с иммобилизованными везикулами - промывают, опуская ее в 10-2 М фосфатный буферный раствор. Образование слоя везикул, иммобилизованных на поверхности пластинки, доказывают методами атомно-силовой микроскопии и эллипсометрии. За целостностью везикул следят, измеряя интенсивность флуоресценции пластинки с иммобилизованными везикулами. Атомно-силовая микроскопия показывает, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Из примера видно, что предлагаемый способ обеспечивает иммобилизацию везикул на модифицированной полимером стеклянной пластинке и сохранение целостности иммобилизованных везикул. Конечный продукт получают однократным промыванием пластинки с иммобилизованными везикулами в 10-2 М буферном растворе.

Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ существенно упрощает известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул, а именно устраняет необходимость предварительной модификации поверхности носителя липидным бислоем, ковалентной модификации бислойных везикул полимером и проведения многократной очистки полупродуктов и конечного продукта.

Способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя, содержащего привитые полимерные цепи, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют модифицированные твердые поверхности или модифицированные дисперсные частицы, содержащие по крайней мере один привитой катионный или анионный полимер с плотностью посадки полимера не менее 200 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя, а в качестве бислойных везикул используют анионные или катионные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества и несущие поверхностный заряд, противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области обезвреживания реакционных масс, получаемых после химического уничтожения фосфорорганического вещества (ФОВ). .

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к созданию полимерных материалов на основе хитозана, обладающих низкой токсичностью и повышенной биосовместимостью, в частности, пленок, микрокапсул, гидрогелей, раневых покрытий, скаффолдов и т.д.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе иммобилизованных клеток бактерий, и может быть использовано для получения иммобилизованного биокатализатора, предназначенного для определения различных токсикантов.
Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей для спиртового брожения для получения спирта, используемого, в частности, в качестве топлива.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для повышения эффективности биотехнологического получения этанола из целлюлозосодержащего сырья. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной промышленности. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. .

Изобретение относится к углеводсодержащим поликатионным амфифилам (1-3), представляющим собой тригидрохлориды rac-N-[6-( -D-гликопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)амино-сукциниламино]бензолсульфонамида приведенной общей формулы, где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, В - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), С - остаток спермина, n=6, m=2.

Изобретение относится к применению композиций для местного применения, которые содержат эпидермальный фактор роста. .
Изобретение относится к медицине и косметологии и представляет собой производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, для инъекции в качестве наполнителя мягкой ткани и/или для коррекции дефектов кожи, и/или для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза, где указанные производные выбраны из группы, включающей сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные и деацетилированные производные, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 50000 до 3×106 Да, липосомы образованы фосфолипидами, и концентрация фосфолипида находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается стабильной при хранении наносистемы с размером частиц до 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин растительного происхождения и мальтозу, предназначенной для включения в фосфолипидную наночастицу лекарственных средств, и способа ее получения и фосфолипидной композиции лекарственного средства в форме фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин, мальтозу и лекарственное средство, и способа ее получения.
Изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения псориаза и экземы, содержащей экстракт магонии падуболистной в липосомной системе доставки. .

Изобретение относится к фармакологии, а именно к созданию новой меж- и внутри многослойной везикулярной композиции, содержащей лекарство от псориаза, дитранол. .

Изобретение относится к дерматологии и представляет собой композицию для наружного применения, которая предназначена для лечения атопического дерматита, содержащая аденозилкобаламин в липосоме в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый липосомный носитель или эксципиент.
Изобретение относится к медицине, в частности к косметологии, и представляет собой увлажняющую сыворотку для лица, содержащую гелеобразующий компонент, увлажняющий компонент глицерин, пропиленгликоль, триэтаноламин, консервант, отдушку, биологически активную добавку и воду, отличающуюся тем, что содержит в качестве биологически активной добавки суспензию ниосом размером до 100 нм с включенным в них экстрактом стволовых клеток плаценты свиньи, гиалуроновой кислотой, маслом авокадо, концентратом (Actiflow ), содержащим полисахариды и витамин РР, циклометикон DC 345, а в основу входят акрилатная эмульсия сополимера (Salcare SC80), кремнийорганический эластомер (DC 9045), и талая вода с ледников гор Северного Кавказа, при определенном содержании компонентов в мас.%.

Изобретение относится к иммунолипосомальной форме фотосенсибилизатора на основе тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, которая используется в фотодинамической терапии злокачественных опухолей
Наверх