Новые сшивающие реагенты для получения биосовместимых материалов на основе хитозана



Новые сшивающие реагенты для получения биосовместимых материалов на основе хитозана
Новые сшивающие реагенты для получения биосовместимых материалов на основе хитозана

 


Владельцы патента RU 2408618:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (RU)
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к созданию полимерных материалов на основе хитозана, обладающих низкой токсичностью и повышенной биосовместимостью, в частности, пленок, микрокапсул, гидрогелей, раневых покрытий, скаффолдов и т.д. Изделия на основе биологически активных полимерных материалов могут быть использованы в хирургии при лечении ран и в качестве материалов для временного замещения тканей организма, в области биотехнологии для получения матриц для выращивания клеточных культур, в фармацевтике как носители ферментов и других биологически активных соединений. Сшивающие реагенты представляют собой 2,4-производные 3-оксаглутарового альдегида (2,2'-оксидиацетальдегида). Эти соединения могут быть получены периодатным окислением моносахаридов, нуклеозидов, нуклеотидов. Низкая токсичность и биосовместимость материалов на основе хитозана достигается использованием сшивающих реагентов. 2 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к созданию полимерных материалов на основе хитозана, обладающих низкой токсичностью и повышенной биосовместимостью, в частности, пленок, микрокапсул, гидрогелей, раневых покрытий, скаффолдов и т.д. Изделия на основе биологически активных полимерных материалов могут быть использованы в хирургии при лечении ран и в качестве материалов для временного замещения тканей организма, в области биотехнологии для получения матриц для выращивания клеточных культур, в фармацевтике как носители ферментов и других биологически активных соединений.

В качестве реагентов для сшивания хитозана используют фталевый и янтарный диангидриды, диэпоксиды, краун-эфиры, дивинилсульфон [Серейкайте И., Бассус Д., Бобнис Р. и др. // Биоорганическая химия, 2003, т.29, №3, с.254-257] альдегиды различного строения: глутаровый альдегид (ГА), генипин [Mi F.L., Tan Y.C., Liang H.C. e.a. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2001, v.12, №8, p.835-850], формальдегид [A. Singh, S.S. Narvi, P.K. Dutta and N.D. Pandey. // Bull. Mater. Sci., 2006, V.29, №.3, p.233-238], ацетальдегид, глиоксаль, олигоэтиленгликоль [Ohya Y., Cai R., Nishizawa H., Нага К., Ouchi T. //S.T.P. Pharma Sci., 2000, v.10., №1., p.77-82]. Как показали авторы [S.J. Meade et al Bioorg. Med. Chem. 11, 853-862, 2003], на основании сравнительного изучения реакционной способности альдегидов наиболее легко реагирует с аминогруппами глутаровый альдегид (ГА). Использование ГА позволяет проводить сшивку хитозана в мягких условиях (низкие температуры, физиологические рН).

Из полимерных аминосодержащих носителей в сочетании с ГА использовали как синтетические полимеры (аминополистирол, модифицированные диаминами стиролдивинилбензольные полимеры, а также продукт сополимеризации этилена с малеиновым ангидридом), так и искусственные (аминоэтилцеллюлоза), а также аминосодержащие полимеры природного происхождения (желатин [Draye J.P., Delaey В., Van de Voorde A., Van Den Bulcke A., De Reu В., Schacht E. // Biomaterials, 1998, v.18. p.1677-1687], альбумин, белок птичьих перьев, казеин, коллаген и др.).

Наиболее перспективным полимером для создания биологически активных полимерных материалов является биосовместимый и биодеградируемый аминополисахарид хитозан [A.J.Varma et al. Carboh. Polymers, 55, 77-93,2004; J.Berger et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 57, 19-34, 2004; H. Yi et al. Biomacromolecules, 6, 2881-2894 2005; K. Kurita. Marine Biotech. 8, 203-226, 2006]. Растворимость хитозана в разбавленных водных растворах кислот, наряду с волокно- и пленкообразующей способностью и наличием реакционноспособных аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его в полимерные изделия.

Ранее на основе системы хитозан - ГА (патент РФ 2261911) был разработан биокатализатор, содержащий иммобилизованную органофосфатгидролазу - фермент, гидролизующий фосфоэфирные связи, предназначенный для удаления фосфорорганических соединений с различных поверхностей, в т.ч. кожных покровов, и последующей их детоксикации, а также для использования в качестве средств индивидуальной защиты.

Гели, полученные в результате последовательной обработки хитозана ГА и затем диоксидом серы в водном растворе (US Patent 4125708), а также триполифосфатом и затем ГА (US Patent 5322935), предложено использовать в качестве наполнителей в аппаратах колоночного типа для очистки воды от растворенных в ней соединений, содержащих ионы хрома и марганца, и для изготовления высокоселективных сшитых мембран, предназначенных для разделения компонентов жидких смесей, например водно-спиртовых (US Patent 5006255). Смесь ГА и хитозана с низкой молекулярной массой представляет собой эффективный флокулянт при обезвоживании осадков сточных вод (US Patent 4609470). Пленки на основе хитозана, сшитого ГА или содержащим карбонильные группы сшивающим реагентом генипином (Mt F.-L., HuangC.-T., Liang H.-F. et al. // J.Agr.Food Chem., 2006, v.54, p.3290-3296), предложены в качестве покрытий различных пищевых продуктов; хитозановые пленки замедляют процессы окисления, роста микроорганизмов, потери влаги, сорбируют посторонние запахи, что позволяет использовать их в качестве съедобных пленок для качественного хранения пищевых продуктов.

Использование ГА при получении различных физических форм полимерных материалов на основе хитозана, в особенности биотехнологического и медицинского назначения, обладающих различными видами биологической активности, обусловлено его способностью при взаимодействии с аминополисахаридом образовывать обладающие высокой влагоудерживающей способностью прочные биосовместимые пористые структуры [Вихорева Г.А., Кильдеева Н.Р., Устинов М.Ю., Ночевкина Ю.Н. // Хим. волокна, 2002, №6, с. 29-33; Вихорева Г.А., Шаблыкова Е.А., Кильдеева Н.Р. // Хим. волокна, 2001, №3, с.38-42; Acharya A.S., Suseman L.G., Manning J.M. /А J. Biol. Chem., 1983, v.285, №4, p.2296-2302; Jameela S.R., Jayakrishnan A. //Biomaterials, 1995, №16, p.769-775].

Исследование процесса сшивки хитозана ГА показало присутствие в образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА [V.Crescenzi et al. // Biomacromolecules. 2003, v.4, p.1045-1054; П.А.Перминов. Канд. дисс. Москва, 2007], содержащих карбонильные группы и С=С-связи.

Кротоновая конденсация ГА катализируется аминогруппами, поэтому в случае хитозана ГА расходуется не только на сшивку аминополисахарида, но и на рост олигомерных цепей ГА, длину и структуру которых контролировать не представляется возможным (фиг.1). На фиг.1 приведено строение продуктов кротоновой конденсации ГА и продуктов взаимодействия ГА с хитозаном. Присутствие в составе образующихся гидрогелей реакционно-способных карбонильных групп и С=С-связей ограничивает использование системы хитозан - алифатический диальдегид в биомедицинских целях.

В этой связи весьма актуальным является поиск новых сшивающих реагентов, способных, подобно ГА, эффективно реагировать с хитозаном с образованием гидрогелей, но не образующих при этом олигомерных продуктов.

Задачей данного изобретения является создание на основе хитозана нетоксичных и биосовместимых материалов медицинского и биотехнологического назначения, а также новых сорбционно-активных материалов.

Указанная задача решается путем использования новых сшивающих реагентов, 2,4-производных 3-оксаглутарового альдегида (2,2'-оксидиацетальдегида). Введение электроотрицательного атома кислорода в 3-положение ГА, а также наличие заместителей в 2,4-положениях препятствуют альдольной и кротоновой конденсации и образованию нерегулярных продуктов.

Эти соединения могут быть легко получены периодатным окислением нуклеозидов, нуклеотидов и моносахаридов (таких как производные рибозы, арабинозы, эритрозы, глюкозы, галактозы, арабинозы). Следует отметить, что получение производных 3-оксаглутарового альдегида осуществляется в водных растворах в мягких условиях, за реакцией можно наблюдать с помощью ТСХ или ЯМР-спектроскопии. Методика проведения реакции очень проста: к раствору соединения с диольной группой в воде добавляют небольшой избыток NaIO4 и выдерживают 10-30 мин при 20°С [С.Н.Михайлов, Г.И.Яковлев. // Химия природных соединений, 1987, с.40-43; Ермолинский Б.С., Михайлов С.Н. //Биоорган, химия. 2000, т.26, с.483-504] (фиг.2). На фиг.2 приведена схема реакции периодатного окисления, которая используется для получения производных 3-оксаглутарового альдегида. Следует отметить, что указанные производные могут быть также получены периодатным окислением соединений с триольными группами, в этом случае используется 2 эквивалента NaIO4.

Особенностями использования предлагаемых новых сшивающих реагентов являются: 1) строение диальдегидных производных моносахаридов, нуклеозидов и нуклеотидов исключает возможность кротоновой конденсации диальдегида, приводящей к образованию двойных С=С-связей и образованию токсичных продуктов с непредсказуемым составом; 2) наличие в составе сшивающих реагентов дополнительных функциональных групп (фосфатной группировки и гетероциклических оснований) дает возможность их использования не только в качестве сшивающих реагентов, но и модифицирующих соединений, обеспечивающих дополнительную функционализацию хитозана; 3) использование предлагаемых реагентов открывает новые возможности: а) создания новых биосовместимых материалов на основе хитозана; б) реализации в процессе сшивки не только ковалентных, но и ионных взаимодействий; в) приводит к получению новых сорбционно-активных материалов.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Периодатное окисление уридина

0.899 г (4.2 ммоль) периодата натрия растворяли в 8 мл воды, затем добавляли при перемешивании 0.976 г (4 ммоль) уридина и раствор выдерживали при комнатной температуре. По данным ТСХ в системе хлороформ - спирт 4:1 реакция заканчивается через 1 час. Реакционую смесь оставляли в холодильнике на 20 часов при 0°С, выпавший белый кристаллический осадок NaIO3 отфильтровывали и получали 0.5 М раствор диальдегидного производного уридина (oxUrd), который использовывали для сшивки хитозана. Раствор диальдегидного производного уридина стабилен при хранении в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Пример 2. Периодатное окисление динатриевой соли аденозин-5'-монофосфата

К раствору 0.782 г (2 ммоль) динатриевой соли аденозин-5'-монофосфата в 2.5 мл воды добавляли при перемешивании 4.2 мл 0.5 М раствора периодата натрия (2.1 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре и смесь оставляли в холодильнике на 20 часов при 0°С. Выпавший белый кристаллический осадок NaIO3 отфильтровывали и получали 0.3 М раствор диальдегидного производного аденозин-5'-монофосфата (oxAMP). Раствор диальдегидного производного стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

Пример 3. Периодатное окисление метил β-D-рибофуранозида

0.899 г (4.2 ммоль) периодата натрия растворяли в 8 мл воды, затем добавляли при перемешивании 0.648 г (4 ммоль) метил β-D-рибофуранозида и раствор выдерживали при комнатной температуре. По данным ТСХ в системе хлороформ - спирт 4:1 реакция заканчивается через 1 час. Реакционую смесь оставляли в холодильнике на 20 часов при 0°С, выпавший белый кристаллический осадок NaIO3 отфильтровывали и получали 0.5 М раствор диальдегидного производного метил β-D-рибофуранозида, который использовали для сшивки хитозана. Раствор диальдегидного производного стабилен при хранении в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Пример 4. Получение раствора 3-оксаглутарового альдегида (2,2'-оксидиацетальдегида)

0.450 г (2.1 ммоль) периодата натрия растворяли в 5 мл воды, затем добавляли при перемешивании 0.208 г (2 ммоль) 1,4-ангидроэритритола и раствор выдерживали при комнатной температуре. По данным ТСХ в системе хлороформ - спирт 5:1 реакция заканчивается через 1 час. Реакционую смесь оставляли в холодильнике на 20 часов при 0°С, выпавший белый кристаллический осадок NaIO3 отфильтровывали и получали 0.4 М раствор 3-оксаглутарового альдегида, который использовывали для сшивки хитозана. Раствор 3-оксаглутарового альдегида стабилен при хранении в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Пример 5. Получение гидрогеля хитозана

К 2,5 г 3%-ного раствора хитозана с молекулярной массой 460 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) добавляют 0,4 мл 0,5М oxUrd. Полученный гель имеет следующий состав, мас. %: хитозан - 2,43, oxUrd - 1,54, остальное до 100%. Соотношение oxUrd/NH2 составляет 0,67 моль/моль. Гелеобразование завершается в течение 120 минут.

Пример 6. Получение гидрогеля хитозана

3%-ный раствор хитозана (молекулярная масса 460 кДа) в 2%-ной уксусной кислоте титруют 10М NaOH до рН 5,0. К 2,5 г этого раствора добавляют 0,4 мл 0,5М oxUrd. Полученный гель имеет следующий состав, мас. %: хитозан - 2,43, oxUrd - 1,54, остальное до 100%. Соотношение oxUrd/NH2 составляет 0,67 моль/моль. Гелеобразование завершается в течение 60 минут.

Пример 7. Получение гидрогеля хитозана

К 2,5 г 2%-ного раствора хитозана с молекулярной массой 460 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) добавляют 0,64 мл 4 мМ oxUMP. Полученный гель имеет следующий состав, маc.%: хитозан - 1,60, oxUMP - 0,026, остальное до 100%. Соотношение oxUMP/NH2 составляет 0,01 моль/моль. Гелеобразование завершается в течение 10 минут.

Пример 8. Получение гидрогеля хитозана.

К 2,5 г 2%-ного раствора хитозана с молекулярной массой 190 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) добавляют 0,64 мл 4 мМ охАМР. Полученный гель имеет следующий состав, мас. %: хитозан - 1,60, охАМР - 0,028, остальное до 100%. Соотношение охАМР/NH2 составляет 0,01 моль/моль. Гелеобразование завершается в течение 14 часов.

Пример 9. Получение гидрогеля, содержащего иммобилизованный трипсин

К 2,5 г 3%-ного раствора хитозана с молекулярной массой 190 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) добавляют 0,2 мл водного раствора трипсина (5 мг/мл) и 0,4 мл 0,5М oxUrd. Полученный гель имеет следующий состав, мас. %: хитозан - 2,43, oxUrd - 1,54, трипсин - 0,032, остальное до 100%. Соотношение охUrd/NH2 хитозана составляет 0,67 моль/моль. Гелеобразование завершается в течение 120 минут. Гель имеет активность, равную 90 ед./г высушенного геля.

Пример 10. Получение микрокапсул на основе хитозана

Микрокапсулы получали методом высокочастотного (до 200 Гц) разбиения струи формовочной композиции, представляющей собой совместный раствор хитозана с молекулярной массой 300 кДа и oxUrd, в теплое (60°С) растительное масло. Соотношение oxUrd/NH2 составляло 0,4 и 2 моль/моль. Для завершения процесса гелеобразования капсулы выдерживали в растительном масле в течение 5-10 минут при перемешивании. Полученные микрокапсулы, диаметром 300-500 мкм, имели правильную сферическую форму. Степень набухания в воде микрокапсул, полученных при соотношении oxUrd/NH2=2,0 моль/моль, составляет 300%, а при oxUrd/NH2=0,4 моль/моль - 2000%.

Пример 11. Получение объемно модифицированной пленки на основе хитозана

К 45 г 2%-ного раствора хитозана с молекулярной массой 460 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) добавляют 11,26 мл 2 мМ диальдегидного производного метил β-D-рибофуранозида. После перемешивания раствор выливали на чашку Петри диаметром 10 см и оставляли на ночь при температуре 40°С. Полученная пленка имеет следующий состав, мас.%: хитозан - 95,40, диальдегидное производное метил β-D-рибофуранозида - 0,80, остальное до 100%. Соотношение диальдегидное производное метил β-D-рибофуранозида /NH2 составило 0,005 моль/моль. Толщина сформованной пленки 50 мкм, степень набухания в воде 800%.

Пример 12. Получение поверхностно модифицированной пленки на основе хитозана

Раствор хитозана (2%) массой 45 г с молекулярной массой 467 кДа в 2%-ной уксусной кислоте (рН 4,1) выливали на чашку Петри диаметром 10 см и оставляют на 5 суток при температуре 25°С. Толщина сформованной пленки составила 50 мкм. Сформованную пленку заливали 20 мл 0,1 М водного раствора NaOH для нейтрализации уксусной кислоты, а затем после промывки дистиллированной водой и помещали в 11,3 мл 4 мМ 3-оксаглутарового альдегида на 2 часа. Толщина полученной пленки составляет 83 мкм, степень набухания в воде 1000%.

Пример 13. Получение волокнистого биокатализатора на основе хитозана

Тканый целлюлозный материал (хлопчатобумажную бязь) массой 1,2 г помещали в 3%-ный раствор хитозана с молекулярной массой 190 кДа (2,55 г), содержащий 0,2 мл водного раствора α-химотрипсина (5 мг/мл) и 0,40 мл 0,5М oxUrd. Бязь отжимали и выдерживали на воздухе в течение 25 минут. Полученный биокатализатор имел следующий состав, мас. %: белок - 2,05, хитозан - 12,92, нерастворимый носитель -51,37, oxUrd - 0,032, остальное до 100%. Активность биокатализатора составила 87 ед./г.

Сшивающие реагенты для получения на основе хитозана биосовместимых и нетоксичных материалов биомедицинского и биотехнологического назначения, а также новых сорбционно активных материалов, представляющие собой 2,4-производные 3-оксаглутарового альдегида (2,2'-оксидиацетальдегида).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе иммобилизованных клеток бактерий, и может быть использовано для получения иммобилизованного биокатализатора, предназначенного для определения различных токсикантов.
Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей для спиртового брожения для получения спирта, используемого, в частности, в качестве топлива.
Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей для спиртового брожения для получения этилового спирта как химического продукта, используемого, в частности, в качестве топлива.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой биокатализатор, содержащий иммобилизованные клетки бактерий, включенные в криогель поливинилового спирта, с помощью которых осуществляют разложение метилфосфоновой кислоты и ее эфиров.

Изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к составам и способам лечения заболевания, в частности диабета, путем имплантации инкапсулирующих устройств, содержащих покрытие и клетки, при этом плотность клеток составляет по меньшей мере 100000 клеток/мл, а покрытие содержит акрилатный полиэтиленгликоль (PEG) высокой плотности с молекулярной массой от 900 до 3000 дальтон, а также сульфонированный сомономер.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованной -фруктофуранозидазы, и может быть использовано при производстве инвертного сахара.

Изобретение относится к способу получения полисахаридных волокон для изготовления материалов, а именно, для получения рассасывающихся в организме человека и млекопитающих хирургических шовных материалов, рассасывающихся и нерассасывающихся перевязочных материалов, рассасывающихся тканых матричных материалов.

Изобретение относится к таксану, особенно к паклитакселу и доцетакселу, ковалентно связанному с гиалуроновой кислотой или производным гиалуроновой кислоты, используемому в качестве активного вещества в фармацевтических композициях, которые применяют в области онкологии, при лечении опухолей, аутоиммунных заболеваний и рестеноза, а также в качестве покрытия для стентов и медицинских устройств.
Изобретение относится к области медицины и касается препаратов, применяемых для профилактики и лечения нарушений физиологической и репаративной регенерации костной ткани и суставного хряща.
Изобретение относится к технологии получения бумаги, в частности к получению модифицированной бумаги с повышенными огне- и теплозащитными свойствами, и может быть применено в строительстве, самолето-, судо- и автомобилестроении.
Изобретение относится к технологии получения синтетической бумаги, в частности к составу для получения модифицированной бумаги с повышенными огне- и теплозащитными свойствами, и может быть использовано в строительстве, самолето-, судо- и автомобилестроении.

Изобретение относится к химии хитозана и полиэдрических клозо-гидроборатов, которые могут применяться как активные компоненты в энергоемких составах, способу их получения и применения.

Изобретение относится к получению биологически активных хитозановых продуктов и их производных и может найти применение в производстве косметических, лечебно-косметических, фармакологических препаратов, биологически активных добавок к пище и пищевых продуктов.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к улучшению качества растениеводческой продукции с помощью экологически безопасных биологически активных веществ, путем снижения содержания нитратов в овощах, кормовых и других сельскохозяйственных культурах.

Изобретение относится к новому нанокомпозиту, который может найти применение как компонент, способствующий изменению потребительских свойств создаваемых на его основе материалов.
Наверх