Способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза



Способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза
Способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза

 


Владельцы патента RU 2420590:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Военная академия радиационной, химической и биологической защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко" (RU)

Для осуществления способа предварительно устанавливают время миграции рабочего раствора иммуноглобулина специфического для каждой серии и производителя, при этом иммуноглобулин специфический используется в качестве реперной метки (контроль). Далее готовят исследуемую пробу, подозреваемую на наличие споровых бактерий, для проведения реакции антиген-антитело путем добавления рабочего раствора иммуноглобулина специфического в фосфатном буфере к пробе. В ходе реакции образуется комплекс бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический. Далее проводят капиллярный электрофорез, детектирование в УФ-области спектра, определение времени миграции комплекса в системе капиллярного электрофореза и сравнивают его со временем миграции в системе капиллярного электрофореза иммуноглобулина специфического (контроля). При превышении времени миграции комплекса свыше 50 с по сравнению со временем миграции иммуноглобулина специфического идентифицируют наличие в пробе бактерий в споровой форме. Описываются также условия и параметры проведения анализа. Изобретение позволяет провести специфическую идентификацию бактерий в споровой форме с высокой степенью достоверности. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

 

Изобретение относится к экспрессным способам специфической идентификации микроорганизмов, а именно к специфической идентификации бактерий в споровой форме методом капиллярного электрофореза.

Известно, что для экспрессной специфической идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, наиболее широкое распространение получили иммунологические и молекулярно-генетические методы анализа. Однако данные методы требуют усовершенствования, так как имеют ряд недостатков. Так, например, из иммунологических методов наибольшее распространение получил способ идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, на основе иммуноферментного анализа, заключающийся в специфическом взаимодействии антител с бактериальными клетками и измерении скорости ферментативной реакции [1-3]. При этом иммуноферментный анализ имеет несколько модификаций, например твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), «точечный» иммуноферментный анализ (дот-ИФА) и другие.

К недостаткам данного способа следует отнести:

- использование дорогих тест-систем;

- многостадийность и длительность анализа (до 6 часов);

- влияние примесей (дот-ИФА).

Известен способ идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, на основе полимеразной цепной реакции и его разновидность ПЦР-РВ, относящийся к молекулярно-генетическим методам анализа, заключающийся в выделении ДНК (РНК) из клинического образца (пробы), амплификации специфических фрагментов ДНК и детекции продуктов амплификации [4, 5].

К недостаткам данного способа также следует отнести:

- использование дорогих тест-систем;

- многостадийность анализа (выделение ДНК, амплификация).

При этом для выполнения перечисленных разновидностей методов необходим квалифицированный оператор, подготовка которого в специализированных учреждениях занимает длительный (несколько месяцев) период времени.

Наиболее близким по существу к заявляемому способу является способ идентификации на основе иммуноэлектрофореза [6, 7]. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов: иммунодиффузии и зонального электрофореза в геле. Он применяется в основном для идентификации белков. Суть данного способа заключается в следующем:

- образец антигенного состава помещается в лунку, вырезанную в геле;

- проводится электрофоретическое разделение;

- в геле вырезается бороздка, параллельная направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняется смесью антител к белкам (антигенам);

- разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации, по которым и осуществляют идентификацию белков.

Иммуноэлектрофорез может быть использован для решения задач специфической идентификации бактерий в споровой форме при использовании капиллярного электрофореза.

Как известно, при капиллярном электрофорезе разделение компонентов пробы осуществляется в капилляре, внутренний диаметр которого может быть от 25 до 160 мкм. После введения пробы к концам капилляра прикладывается напряжение, и заряженные частицы под действием электрического поля и создаваемого электроосмотического потока начинают двигаться в направлении катода или анода. Детектирование может проводиться в ультрафиолетовой и видимой области спектра в диапазоне длин волн от 191 до 599 нм. При этом метод капиллярного электрофореза активно используется для электрофоретического разделения биологических микрообъектов, в том числе и белков [8].

Известно, что иммуноглобулины - группа близких по химической природе и свойствам глобулярных белков позвоночных животных и человека, которые обладают свойствами антител, то есть специфической способностью соединяться с антигеном, который стимулирует их образование [9]. Так как иммуноглобулины, по сути, являются белками, следовательно, возможно их детектирование в системе капиллярного электрофореза Agilent 3D СЕ за счет наличия аминокислот и пептидных связей, поглощающих свет в ультрафиолетовой области [10]. При этом электрофоретическое разделение возможно за счет того, что каждая молекула белка, а следовательно, и иммуноглобулина, имеет заряд. Этот заряд определяется как сумма электрических зарядов боковых групп аминокислот: основных (диаминомонокарбоновые кислоты) и кислых (моноаминодикарбоновые кислоты), лежащих на поверхности белка [10].

Для проведения комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации бактерий в споровой форме с использованием системы Agilent 3D СЕ предварительно проводят реакцию «антиген - антитело» путем добавления рабочего раствора иммуноглобулина специфического в фосфатном буфере. При этом реакцию проводят непосредственно в виале в течение 25 мин при 37°С. В ходе реакции образуется комплекс «бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический», отличающийся размером и суммарным зарядом от иммуноглобулина специфического.

Электрофоретическое разделение комплекса проводят непосредственно в кварцевом капилляре диаметром 75 мкм с использованием в качестве электролита фосфатного буфера и с соблюдением следующих параметров:

- температура капилляра, равная плюс 20±0,1°С;

- напряжение, используемое для разделения, равное плюс 20±0,1 кВ;

- способ введения пробы - гидродинамический в течение 5 с при давлении 30±0,2 мбар.

Разделение осуществляют в течение 15 мин.

Детектирование и иммуноглобулина, и его комплекса с бактерией осуществляют на выходе из кварцевого капилляра в ультрафиолетовой области с использованием длины волны λ=254 нм.

Общее время анализа с момента получения пробы до выдачи результатов, с учетом осуществления реакции «антиген - антитело», не превышает 50 мин.

Таким образом, предлагаемый способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза заключается в выявлении разницы во времени миграции иммуноглобулина специфического и образовавшегося комплекса «бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический». При этом время миграции иммуноглобулина специфического, используемого в качестве реперной метки, устанавливают заблаговременно для каждой серии и производителя.

Предложенный способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза обладает следующими достоинствами:

продолжительность анализа вместе с проведением реакции «антиген - антитело» не более 50 мин;

- детектирование проводится непосредственно в капилляре;

- реакцию «антиген - антитело» проводят непосредственно в виале для капиллярного электрофореза в термостате при температуре 37°С;

- доступное для самостоятельного освоения программное обеспечение;

- относительно низкая стоимость одного анализа (не более 130 руб.).

Способ позволяет провести специфическую идентификацию бактерий в споровой форме в условиях специализированных и полевых лабораторий.

Пример

В лаборатории готовят пробу, содержащую бактерии в споровой форме с концентрацией 104 КОЕ × мл-1, общим объемом 10 мл. При этом в качестве имитатора используют вакцинный штамм B.anthracis («Вакцина живая против сибирской язвы животных из штамма СТИ»).

В виалу для капиллярного электрофореза микродозатором переносят 0,2 мл пробы. Затем в виалу прикалывают 0,1 мл иммуноглобулина специфического. Полученную пробу термостатируют при 37°С в течение 25 мин. После термостатирования проводят анализ пробы в течение 15 мин.

В качестве средства измерения используют систему высокоэффективного капиллярного электрофореза Agilent 3D СЕ (США). При этом в ходе анализа используют следующие параметры и условия электрофоретического разделения и детектирования:

- температура капилляра - плюс 20±0,1°С;

- напряжение, используемое для разделения, - плюс 20±0,1 кВ;

- введение пробы - гидродинамическое в течение 5 с при давлении 30±0,2 мбар;

- длина волны детектирования - 254 нм;

- время анализа - 15 мин;

- электролит - фосфатный буфер.

Результаты анализа представлены на фигурах 1 и 2. На фигуре 1 представлена электрофореграмма пробы, содержащей иммуноглобулин диагностический сибиреязвенный. На фигуре 2 представлена электрофореграмма пробы, содержащей комплекс штамм СТИ-1 с иммуноглобулином диагностическим сибиреязвенным. Из представленных электрофореграмм в обоих случаях видны пики при одинаковой длине волны детектирования λ=254 нм. Появление пика через 10,52 мин свидетельствует о наличии в пробе чистого иммуноглобулина диагностического. Появление пика через 11,56 мин свидетельствует о наличии в пробе комплекса штамм СТИ-1 с иммуноглобулином диагностическим сибиреязвенным антиспоровым. При этом разница во времени миграции чистого иммуноглобулина и комплекса составляет 64 с.

В ходе статистических расчетов результатов повторных опытов было показано, что разница во времени миграции комплекса и чистого иммуноглобулина данной серии и производителя равна (80±29) с, что вполне достаточно для однозначной идентификации спор B.anthracis. Следует отметить, что идентификация других видов бактерий в споровой форме также представляется возможной при наличии соответствующего специфического иммуноглобулина. При этом для достоверной идентификации необходимо также установить разницу во времени миграции иммуноглобулина специфического и образуемого им комплекса бактерия в споровой форме с иммуноглобулином специфическим.

Литература

1. Патент на изобретение №2265051 от 10.03.2004 г. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Федорова В.А., Дроздов И.Г. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РKKK (П) 679D - продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 Е 09 сероваров.

2. Патент на изобретение №2345365 от 29.05.2007 г. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления.

3. Патент на изобретение №2339952 от 29.05.2007 г. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Малашенкова В.Г., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления.

4. Патент на изобретение №2329305 от 01.03.2002 г. Ротман Р.Э., Янг С., Лин Ш., Елен Г.Д. Количественный анализ, позволяющий одновременно обнаруживать и идентифицировать бактериальные инфекции.

5. Патент на изобретение №2223499 от 12.04.2000 г. Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Ефременко В.И, Саркисова Н.В., Жарникова И.В., Афанасьева Е.Н., Жданова Е.В. Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды.

6. Патент на изобретение №2366715 от 24.03.2008 г. Будченко А.А., Мазурова И.Ю., Илючин В.И. Способ дифференциации возбудителя мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза.

7. Воробьева Н.В. Иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез / Теория и практика // Учебное пособие для вузов / Н.В. Воробьева. - М.: Научный мир, 2006.

8. Патент на изобретение №2327978 от 22.07.2006 г. Сидорова А.А., Ганжа О.В. Способ идентификации объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля.

9. Иммуноглобулины [электронный ресурс] - ХиМик.ru http://www.xumuk.ru/ encyklopedia/1664.html>ИММУНОГЛОБУЛИНЫ</а>.

10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот [текст] /Пособие для студентов биологических факультетов и учащихся специализированных старших классов гимназий / Л.А.Остерман. - М.: МЦНМО, 2002. - 248 с.

1. Способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации бактерий в споровой форме на основе капиллярного электрофореза, включающий этапы:
а) подготовку рабочего раствора иммуноглобулина специфического, проведение капиллярного электрофореза, детектирование иммуноглобулина в ультрафиолетовой области спектра и определение времени его миграции в системе капиллярного электрофореза (контроль),
б) подготовку пробы, подозреваемой на наличие бактерий в споровой форме, для проведения реакции антиген-антитело с рабочим раствором иммуноглобулина специфического для получения комплекса иммуноглобулин специфический - бактерия в споровой форме, проведение капиллярного электрофореза, детектирование в ультрафиолетовой области спектра и определение времени миграции комплекса в системе капиллярного электрофореза,
в) сравнение времени миграции в системе капиллярного электрофореза иммуноглобулина специфического и комплекса иммуноглобулин специфический - бактерия в споровой форме и при превышении времени миграции комплекса свыше 50 с по сравнению со временем миграции иммуноглобулина специфического идентифицируют наличие в пробе бактерий в споровой форме.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробоподготовка иммуноглобулина специфического включает его разведение 0,5 см3 кипяченой дистиллированной водой и приготовление рабочего раствора.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед электрофоретическим разделением готовят рабочий раствор иммуноглобулина путем добавления в пробирку поочередно разведенного иммуноглобулина и фосфатно-солевого буфера в объемах, указанных в инструкции к иммуноглобулину, полученный рабочий раствор перемешивают в течение 3 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что электрофоретическое разделение проводят непосредственно в капилляре с внутренним диаметром 75 мкм.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для электрофоретического разделения используют фосфатный буфер, а также применяют следующие условия и параметры разделения:
- температура капилляра, равная плюс 20±0,1°С;
- напряжение, используемое для разделения, равное плюс 20±0,1 кВ;
- способ введения пробы - гидродинамический в течение 5 с при давлении 30±0,2 мБар;
- время анализа - 15 мин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование в ультрафиолетовой области спектра проводят при длине волны 254 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека первого типа, принадлежащего к рекомбинантному субтипу 02_AG, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. .

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека первого типа, принадлежащего к рекомбинантному субтипу 02_AG, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. .

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям биомедицины, биоскрининга и разработки способов диагностики на основе искусственных репортерных биомолекул, касается нового способа высокочувствительной детекции каталитически активного белка летального фактора сибирской язвы LF; способа амплификации сигнала, образуемого при расщеплении субстрата низкоэффективным протеолитическим ферментом.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и касается способа оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов для возбудителей особо опасных инфекций Francisella tularensis и Brucella spp.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза. .
Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики хронической скрытой бактериальной инфекции с поражением сосудистой стенки. .

Изобретение относится к выделенному вирусу растений, названному вирус томата торрадо (ToTV), и его компонентам, а также к способам получения устойчивых к ToTV растений. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения степени чувствительности бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано, в частности, для определения концентраций поллютантов, оказывающих неблагоприятное воздействие на организм человека.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу определения продукции факторов хоминга стволовых клеток костного мозга, и может быть использовано в клеточной терапии для определения пролиферативно-дифференцировочного статуса стволовых клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения скорости гибели живых микробов. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе иммобилизованных клеток бактерий, и может быть использовано для получения иммобилизованного биокатализатора, предназначенного для определения различных токсикантов.
Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики хронического инфекционного - воспалительного поражения сосудов ЦНС, ассоциированного с хламидийной инфекцией.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам измерения, использующим жизнеспособные микроорганизмы, содержащие люциферазу, и может быть использовано для экспрессной оценки загрязнения атмосферного воздуха токсичными веществами, например сероводородом, ароматическими углеводородами, окислами азота, металлорганическими соединениями.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к клеточной биоинженерии, а именно к клеточным технологиям скрининга молекулярных мишеней. .
Изобретение относится к области физики и биологии, может быть использовано для экологического мониторинга водоемов
Наверх