Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза. Сущность изобретения включает способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) посредством приготовления формалинизированных эритроцитов, с их последующей сенсибилизацией антигеном, при том, что после выращивания бактериальную массу в количестве 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл инактивируют обработкой 2%-ной концентрацией детергента вторичного алкилсульфата натрия, из расчета 0,75-10 мл антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов и выдерживают в течение 2 часов при 45°С. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности диагностикума. 3 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, а именно к получению биологических препаратов.

Известен «Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе», в котором формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 минут.

Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл до 80-100 млрд микробных клеток в 1 мл. Устанавливают pH 8,0-9,0 и подвергают автоклавированию при 1 атмосфере (10°С) в течение 20-30 минут. Взвесь бруцелл остужают до температуры 18-25°С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный экстракт используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при температуре 50-60°С в течение 30 минут. Сенсибилизацию эритроцитов, обработанных детергентом, проводят при 37-38°С в течение 16-18 часов. (Патент №2283498, 2006 г. Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН, авторы Юсупов О.Ю., Хаиров С.Г., Шумилов К.В., Климанов А.И., Ощепков В.Г., Дектяренко Л.В., Скляров О.Д., Дугричилова М.О.)

Недостатком данного способа является то, что при серологическом исследовании в РНГА с применением антигена, приготовленного по указанному способу из благополучных по бруцеллезу хозяйств, часть животных дает неспецифические реакции в низких титрах в пределах 1:25, 1:50 и 1:100, а иногда спонтанно агглютинируют сенсибилизированные эритроциты с физиологическим раствором, что дало нам основание усовершенствовать данный способ получения эритроцитарного антигена для РНГА (см. табл.1).

Таблица 1
Результаты сравнительного испытания специфичности антигенов в РНГА в благополучных по бруцеллезу хозяйствах
Животные	Исследованы антигеном	Количество	Реагировали с эритроцитарными антигенами в РНГА
Отр.	1:25	1:50	1:100	1:200
Коровы	Аналогом	50	40	5	3	2	-
Новым	50	50	-	-	•	-
Овцематки	Аналогом	70	64	4	1	1	-
Новым	70	70	-	-	-	-

Целью изобретения является повышение высокой специфичности и активности антигена.

Эта цель достигается тем, что для обработки взвеси бруцелл используют новый стандарт вторичного алкилсульфата натрия (СТО 05807999-007-2006), отечественный детергент, выпускаемый под коммерческим названием «Прогресс».

Пример. Бруцеллы штамма 19, выращенные на мясопептонном печеночном глюкозоглицериновом агаре, смывают с питательной среды стерильным 12%-ным раствором хлорида натрия, полученную суспензию доводят до концентрации 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл (по бруцеллезному стандарту мутности) 12%-ным раствором хлорида натрия и автоклавируют при температуре 120°С в течение 20 минут.

После установления стерильности, чистоты, типичности культуру бакмассы подогревают до 45°С, в нее добавляют 2% вторичного алкилсульфата натрия СТО 05807999-007 2006. Затем взвесь бруцелл с детергентом помещают в водяную баню при 45°С в течение 40-45 минут и периодически через каждые 5-10 минут перемешивают. Полученную взвесь бруцелл - антиген (корпускулярный, автоклавированный) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов проводят по способу Вайнбаха в нашей модификации, которая заключается в том, что формалинизацию эритроцитов проводят в течение 16-18 часов вместо 24 и встряхивают их в Шуттель-аппарате не постоянно, как это рекомендует автор, а через каждые 30 минут в течение 1,5-2 минут. Это дало возможность значительно сократить время подготовки и получить максимальный выход эритроцитов без признаков гемолиза и склеивания, которые наблюдались иногда при постоянном встряхивании их в течение 24 часов. Сокращение времени формалинизации эритроцитов до 16-18 часов с периодическим встряхиванием способствовало также лучшей сохранности эритроцитов. При этом не снижались их сорбционные свойства, а срок хранения увеличивался.

Подготовленные таким способом эритроциты сохраняют свою стабильность и адсорбционные свойства в течение двух и более лет при условии хранения при температуре 4-6°С.

Титрация оптимальной дозы бруцеллезного антигена

Для каждой серии формалинизированных эритроцитов титруют оптимальную дозу каждой серии бруцеллезного антигена. Предварительно антиген (взвесь бруцелл 50-60 млрд м.к. в 1 мл) подогревают до температуры 45°С в водяной бане, добавляют 2% нового стандарта вторичного алкилсульфата натрия СТО 05807999-007-2006 и выдерживают в течение 40-45 минут при периодическом перемешивании. Титрацию антигена проводят в пробирках, для чего на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов, подогретых так же до 45°С, добавляют 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 мл антигена (корпускулярный, автоклавированный) с детергентом. Штатив с пробирками встряхивают и вносят в водяную баню на 2 часа при 45°С. Отмывают сенсибилизированные эритроциты от избытка антигена три раза физиологическим раствором. Пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5-6 минут, надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор в соотношении 10 к одному. Эту операцию проводят еще дважды. После последнего центрифугирования в пробирки вносят по 4 мл физиологического раствора с целью получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов гомогенизируют путем встряхивания пробирок. Полученную взвесь эритроцитов используют для постановки РНГА. Для испытания антигена применяют стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус и негативной сыворотки крови. Из стандартного образца сыворотки готовят разведения в физиологическом растворе 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400. Все разведения сыворотки прогревают в водяной бане при 60-62°С в течение 30 минут. После чего в каждую лунку (полистироловой пластины) с разведенной сывороткой вносят по 0,05 мл (по одной капле) взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Затем содержимое пластинки тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 2,5-3 часа, после чего проводят учет реакций.

За оптимальную дозу антигена принимают ту, которая в РНГА дала четкие результаты со стандартного образца сывороткой антибруцелла абортус в разведении 1:1600, с оценкой в четыре креста.

Пример. Результаты проверки специфичности и активности антигена, полученного при обработке взвеси бруцелл 2%-ным новым стандартом вторичного алкилсульфата натрия (СТО 05807999-007-2006) и эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами антигена, даны в таблице 2.

Таблица 2
Результаты титрации антигена и проверки специфичности и активности бруцеллезного эритроцитарного антигена
К-во антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов	Титры РНГА	С физ. раствором
	Со стандартным образцом антибруцелла абортус		С негативной сывороткой
1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:50	1:100	1:200
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
0,5	++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-	-	-	-
1,0	++++	++++	++++	++++	++++	++	-	-	-	-	-
1,5	++++	++++	++++	++++	++++	++	-	-	-	-	-
2,0	++++	++++	++++	++++	++++	++	-	-	-	-	-
2,5	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-	-	-
3,0	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-	-	-
3,5	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-	-	-
4,0	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+	-	-	-	-

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что антиген, изготовленный путем обработки взвеси бруцелл новым стандартом вторичного алкилсульфата натрия, повышает специфичность и активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки бакмассы бруцелл является 2%-ная концентрация вторичного алкилсульфата натрия. Наименьшей дозой антигена (сенситина), позволяющей получить эритроцитарный антиген с высокой активностью и специфичностью, является 0,75-1,0 мл его на 1 мл 10%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана.

Изготовление опытной серии бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА, для чего в бакмассу добавляют 2% детергента и подогревают до 45°С, выдерживают в водяной бане в течение 40-45 минут. После этого полученный антиген (корпускулярный, автоклавированный) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана. Предварительно оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена определяют путем его титрации (см. титрации антигена), для чего на 1 мл 10%-ных эритроцитов добавляют 0,75-1,0 мл антигена, выдерживают в водяной бане (45°С) в течение двух часов и периодически через каждые 5-10 минут перемешивают. Затем отмывают сенсибилизированные эритроциты от избытка антигена три раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 минут, надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор в соотношении 1:10. Эту процедуру проводят еще дважды. После этого в осадок эритроцитов добавляют физраствор с таким расчетом, чтобы получить 5%-ную взвесь эритроцитов, добавляют в качестве консерванта 0,2-0,3% формальдегида и проверяют его специфичность и активность в РНГА. После этого готовый препарат помещают в холодильник при 4-6°С.

Таким образом, обработка бакмассы бруцелл 2%-ной концентрацией нового стандарта вторичного алкилсульфата натрия и сенсибилизация эритроцитов барана, из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1,0 мл 10%-ной взвеси эритроцитов позволяет получить высокоспецифичный и высокоактивный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА и значительно упрощает способ изготовления указанного препарата (Табл.3).

Таблица 3
Результаты сравнительного испытания активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов для РНГА, приготовленных различными способами
Сыворотки крови	К-во проб	Положительная РНГА
С эритроцитарным антигеном Прикаспийского ЗНИВИ	С эритроцитарным антигеном Прикаспийского ЗНИВИ (аналог)
Крупного рогатого скота	297	48 (16,2%)	46 (15,5%)
Овец	315	28 (8,9%)	25 (7,9%)
Свиней	76	13 (17%)	12 (15%)

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при диагностике бруцеллеза, включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что антиген для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов инактивируют путем обработки бактериальной массы, полученной после выращивания бруцелл в количестве 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл, 2%-ным детергентом вторичным алкил сульфатом натрия и сенсибилизируют формалинизированные эритроциты инактивированным антигеном из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов и выдерживают в течение 2 ч при 45°С.