Новые композиции вакцин


 


Владельцы патента RU 2422155:

МЕРИАЛ ЛИМИТЕД (US)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой иммуногенную композицию - эмульсию типа «масло-в-воде», содержащую водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, неионогенный липофильный этоксилированный С9-С22 спирт жирного ряда, этоксилированный 1-4 ЕО, минеральное масло, содержащее линейную или разветвленную углеродную цепь, содержащую от 15 до 32 атомов углерода, неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, представляющее собой этоксилированный С9-С22 спирт жирного ряда, этоксилированный 5-21 ЕО. Суммарная концентрация поверхностно-активных веществ (по массе на объем эмульсии) составляет от 0,2% до 6,5%, концентрация масляной фазы, включающей масло(а) и поверхностно-активные вещества, составляет от 2% до 50% и температура инверсии фаз (PIT) составляет от 25°С до 65°С. Изобретение может использоваться в качестве адъювантов. 18 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

Родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет заявки США №11/107000, поданной 15 апреля 2005 г., содержание которой включено в настоящую заявку путем ссылки.

Ссылки

Предшествующие заявки и все документы, которые цитируют в этих заявках или во время их рассмотрения («документы, цитируемые в заявке»), и все документы, на которые ссылаются или которые цитируют в «документах, цитируемых в заявке», и все документы, на которые ссылаются здесь или которые цитируют здесь («цитируемые здесь документы»), все документы, на которые ссылаются или которые цитируют в «цитируемых здесь документах», вместе с любыми инструкциями изготовителя, описаниями, спецификациями продуктов и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых здесь или в любом документе, включенным сюда путем ссылки и тем самым включенным в настоящую заявку путем ссылки, могут использоваться в практике изобретения.

Область техники

Настоящее изобретение относится к эмульсиям типа «масло-в-воде», их применению в качестве адъювантов и к фармакологическим иммунологическим композициям и композициям вакцин, содержащих упомянутые эмульсии.

Предшествующий уровень техники

Применение адъювантов в вакцинах хорошо известно. Адъювант представляет собой соединение, которое при объединении с иммуногеном вакцины усиливает иммунный ответ на иммуноген. Среди методов, которые усиливают иммуногенность белка, гликопротеина или пептида, имеются методы, в которых эмульгируют иммуногены [Nossal 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vofiel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. p.141]. Благодаря значительной роли, которую адъюванты играют в повышении иммуногенности иммуногенов вакцин, применение адъювантов в рецептурах вакцин является практически повсеместным [Nossal, 1999, supra: Vogel and Powell. 1995, supra; идеи вышеупомянутых 2 работ включены в данную заявку путем ссылки]. Общепринятые адъюванты, хорошо известные в данной области техники, различны по своей природе. Они могут состоять, например, из нерастворимых в воде неорганических солей, липосом, мицелл или эмульсий, т.е. адъювант Фрейда. Другие адъюванты можно найти в вышеупомянутой работе [Vogel and Powell, 1995, supra]. Хотя единого механизма действия адъювантов не существует, важной характеристикой адъювантов является их способность значительно усиливать иммунный ответ на иммуноген вакцины по сравнению с ответом, индуцированным только иммуногеном вакцины [Nossal 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra]. При этом некоторые адъюванты более эффективны в случае нарастающих гуморальных иммунных ответов, другая группа адъювантов более эффективна при усилении иммунных клеточных ответов. [Vogel and Powell, 1995, supra] и еще одна группа адъювантов усиливает как гуморальный, так и клеточный иммунные ответы против антигенов, используемых для приготовления вакцин [Vogel and Powell, 1995, supra].

Эмульсии, используемые в рецептуре вакцин, содержат смесь масла, водного раствора и поверхностно-активных веществ. Некоторые эмульсии включают липофильное поверхностно-активное вещество, такое как Span 80® и гидрофильное поверхностно-активное вещество, такое как Tween 80®. Упомянутые эмульсии могут также содержать такие соединения, как лецитин или сапонин, которые, как известно, обладают свойствами ионогенных поверхностно-активных веществ.

Однако при работе с эмульсиями, используемыми в качестве адъювантов вакцин, могут возникать проблемы, связанные со стабильностью эмульсий. Ферментативная активность липазы или эстеразы, находящихся в растворе или суспензии иммуногена, может вызывать гидролиз поверхностно-активных веществ эмульсии 2Xnidi, что приводит к потере стабильности адъюванта. Липазы и эстеразы могут поступать, например, из клеточной культуры, используемой для выращивания вирусов или бактерий. Эти утверждения особенно справедливы тогда, когда указанные композиции содержат концентрированные иммуногены, конкретно неочищенные концентрированные иммуногены. Обычно это имеет место в случае адъювантов, используемых в инактивированных (убитых) вакцинах. Вышеуказанная проблема является еще более важной для композиций поливалентных вакцин, так как в том же объеме разбавителя выше концентрация иммуногенов.

Еще одна проблема применения адъювантов связана с риском нежелательных явлений, таких как токсичность или локальное воспаление в месте инъекции. Например, после инъекции возможен локальный воспалительный ответ и/или образование гранулем. Для того чтобы ограничить такую нежелательную реакцию, можно уменьшать содержание поверхностно-активных веществ и других компонентов в эмульсии; однако, такое уменьшение может привести к понижению стабильности композиции вакцины. Следовательно, существует потребность в новых адъювантах и композициях вакцин, содержащих такие адъюванты, обладающих повышенной стабильностью и безвредностью.

Цитирование или идентификация любого документа в настоящей заявке не является признанием того, что такой документ предлагается в качестве предшествующего уровня техники в отношении настоящего изобретения.

Краткое описание изобретения

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к новой эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), обладающей повышенной стабильностью в присутствии суспензий бактерий, паразитов или вирусов, особенно концентрированных, неочищенных или плохо очищенных суспензий.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к стабильной, безвредной и легко вводимой O/W эмульсии (конкретно вводимой путем инъекций), действующей в качестве среды для доставки фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один активный ингредиент, который, более конкретно может представлять собой иммуноген.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к стабильной, безвредной и легко вводимой путем инъекции O/W эмульсии, действующей в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа, индуцированного иммуногеном. Конкретно, настоящее изобретение относится к новому адъюванту, который при использовании композиции вакцины, содержащей иммуноген, усиливает клеточный иммунный ответ вакцинированного субъекта, гуморальный иммунный ответ или предпочтительно оба типа ответа на иммуноген.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к стабильной, безопасной и иммуногенной композиции или вакцине, содержащей O/W эмульсию.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу изготовления композиции вакцины с использованием адъюванта по настоящему изобретению, композиции вакцины, полученной таким способом, и к способам ее применения.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору, содержащему иммуноген или другой фармацевтический продукт в первом флаконе и адъювант, приготовленный по настоящему изобретению, во втором флаконе, причем подразумевается, что перед использованием адъювант смешивают с иммуногеном или другим продуктом вакцины.

Настоящее изобретение в одном варианте осуществления изобретения относится к эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), которая может включать:

(1) водный раствор, содержащий иммуноген,

(2) минеральное масло,

(3) неионногенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда,

(4) неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен и/или любой их комбинации.

Настоящее изобретение в еще одном варианте осуществления изобретения относится к эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), которая может включать:

(1) водный раствор, содержащий иммуноген,

(2) неионогенное липофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен и/или любой их комбинации,

(3) минеральное масло,

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда.

Эмульсии, изготовленные по настоящему изобретению, базируются на комбинировании, по меньшей мере, двух поверхностно-активных веществ, выбранных из членов двух различных групп поверхностно-активных веществ (липофильных и гидрофильных поверхностно-активных веществ), и возможно использование одного или нескольких поверхностно-активных веществ, относящихся к каждой группе.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к композиции вакцины, включающей новую эмульсию, которая может содержать, по меньшей мере, один иммуноген, подходящий для индуцирования иммунного ответа у вакцинированного субъекта. Кроме того, изобретение относится к таким композициям, в которых эмульсия действует в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа, индуцированного иммуногеном, конкретно для усиления клеточного иммунного ответа, гуморального иммунного ответа или предпочтительно и того и другого.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения антиген или иммуноген представляет собой Mycoplasma, предпочтительно Mycoplasma hyopneumoniae, свиной цирковирус, предпочтительно свиной цирковирус-2 или Helicobacter, предпочтительно Helicobacter cerdo или Helicobacter pylori, или их производные.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу приготовления композиции вакцины, где иммуноген, особенно иммуноген в лиофилизованной форме или в водном растворе, смешивают с адъювантом по рассматриваемому изобретению. Иммуноген может быть выбран из группы, состоящей из инактивированных патогенов, ослабленных патогенов, субъединиц антигенов ослабленных патогенов, субъединиц антигенов, рекомбинантных экспрессирующих векторов, включающих плазмиды, и т.п. Патоген может иметь бактериальное вирусное, протозоальное, паразитическое или грибковое происхождение или иммуноген может представлять собой токсоид.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа у вакцинированного против патогена субъекта, включающему введение субъекту композиции вакцины по настоящему изобретению.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к наборам, содержащим, по меньшей мере, два флакона, в первом флаконе находится иммуноген, главным образом иммуноген в лиофилизированной форме или в растворе в водной среде, а во втором флаконе находится адъювант или эмульсия по настоящему изобретению.

Отметим, что в настоящем описании и конкретно в формуле изобретения термины, такие, как «содержит», «содержащийся» и «содержащий» и т.п. могут иметь значения, приписанные таким терминам в Патентном законе США, например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и т.п.; термины, такие как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из» имеют значение, приписываемое им Патентным законом США, например, они предусматривают элементы, излагаемые не в прямой форме, но исключают элементы, которые обнаружены на предшествующем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения.

Упомянутые варианты осуществления изобретения и другие варианты раскрываются в нижеследующем подробном описании или являются очевидными и включены в подробное описание.

Подробное описание изобретения

Для удобства здесь приводятся некоторые термины, которые используются в описании, примерах и дополнениях и в формуле изобретения.

Термин «животное», используемый здесь, включает в себя всех позвоночных животных, в том числе человека. Он также включает особь животного на всех стадиях развития, включая эмбриональную и фетальную стадии. Конкретно термин «позвоночное животное» включает (но не ограничивается перечисленным ниже) человека, семейство псовых (например, собаки), семейство кошачьих (например, кошки), семейство лошадей (например, лошади), жвачных животных (например, крупный рогатый скот), семейство свиней (например, свиньи), семейство овец (например, овцы), семейство коз (например, козы), кроликов, а также птиц. Термин «птицы» используют здесь для обозначения любых видов или подвидов таксономического класса Aves, например кур (племенных, мясных и несушек), индюков, уток, гусей, перепелов, фазанов, попугаев, певчих птиц, ворон и бескилевых птиц, включая страуса, эму и казуара.

Используемый здесь термин «свинья» или «поросенок» относится к животному, которое происходит из семейства свиней, тогда как термин «свиноматка» относится к самке свиньи в репродуктивном возрасте и способной к репродукции.

Используемый здесь термин «вирулентный» относится к изоляту, который сохраняет свою способность инфицировать в животном-хозяине.

Используемый здесь термин «инактивированная вакцина» относится к композиции вакцины, содержащей инфекционный организм или патоген, который более не способен к репликации или росту. Патоген может быть бактериального, вирусного, протозойного, паразитического или грибкового происхождения. Инактивация может быть осуществлена множеством методов, включающих высокое давление, химическую обработку (например, обработка тимеросалом или формалином), разрушение ультразвуком, облучение, нагревание или любые другие общепринятые средства, достаточные для того, чтобы не допустить репликации или роста организма при сохранении его иммуногенности.

Используемый здесь термин «иммуногенность» означает способность продуцировать иммунный ответ в животном-хозяине против иммуногена или иммуногенов. Указанный иммунный ответ создает основу защитного иммунитета, вызываемого вакциной против конкретного инфекционного организма.

Используемый здесь термин «иммунный ответ» относится к ответу, вызываемому в животном. Иммунный ответ может относиться к клеточному иммунитету (CMI), гуморальному иммунитету или может включать оба типа. Настоящее изобретение также рассматривает ответ, ограниченный частью иммунной системы. Например, композиция вакцины по настоящему изобретению может конкретно вызывать увеличенный ответ гамма-интерфероном.

Используемый здесь термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ в животном-хозяине. Антиген может содержать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или порцию организма, рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами, кусок фрагмента ДНК, способный индуцировать иммунный ответ при нахождении в животном-хозяине, белок, гликопротеин, липопротеин, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно иммуноген или антиген могут содержать токсин или антитоксин.

Термин «поливалентный» здесь используют для обозначения вакцины, содержащей более одного антигена либо одного и того же вида (например, различные изоляты Mycoplasma hyopneitmoniae}, либо различных видов (например, изоляты как из Pasteurella hemolytica, так и из Pasteurella multocida), или вакцины, содержащей комбинацию антигенов различных родов (например, вакцины, содержащей антигены из Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia соli, Haemophilus somnus и Clostridium).

Термин «адъювант» здесь используют для обозначения вещества, которое прибавляют к вакцине для увеличения ее иммуногенности. Механизм действия адъюванта плохо понятен. Полагают, что некоторые адъюванты усиливают иммунный ответ, медленно высвобождая антиген, тогда как другие адъюванты могут опосредовать их эффекты по любому из следующих ниже механизмов: увеличением клеточной инфильтрации, воспалением и переносом к месту инъекции, конкретно для антигенпрезентирующих клеток (АРС), промотированием состояния активации АРС путем повышения регуляции состимулирующих сигналов или экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС), увеличением презентации антигенов или индуцированном высвобождения цитокинов для непрямого действия. Наиболее подходящий адъювант для данного иммуногена вакцины будет в большой степени зависеть от типа иммунного ответа, который требуется для защитного иммунитета. Возможно, выбор адъюванта является до некоторой степени эмпирическим. Известные адъюванты для вакцин включают (но не ограничиваются перечисленными ниже) масляные и водные эмульсии (например, полный адъювант Фрейда и неполный адъювант Фрейда), конкретно эмульсии типа «масло-в-воде», эмульсии типа «вода-в-масле», эмульсии типа «вода-в-масле-в-воде». Они также включают, например, сапонин, гидроксид алюминия, сульфат декстрана, карбомер, альгинат натрия, "AVRIDINE" (N,N-диоктадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин), парафиновое масло, мурамилдипептид, катионные липиды (например, DMRIE, DOPE и их комбинации) и т.п.

Используемые здесь термины «фармацевтически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемая основа (среда)» являются взаимозаменяемыми и относятся к жидкой основе (среде) для иммуногенов вакцины, которые можно вводить хозяину без значительных неблагоприятных эффектов. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, известные в данной области техники, включают (но не ограничиваются ими) стерильную воду, физиологический раствор, глюкозу или буферные растворы. Носители могут включать вспомогательные вещества, включающие (но не ограничивающиеся перечисленными ниже) разбавители, стабилизаторы (например, сахара и аминокислоты), консерванты, увлажняющие вещества, эмульгаторы, буферы, регулирующие рН, добавки, увеличивающие вязкость, красители и т.п. Фармацевтически приемлемые или приемлемые для ветеринарии носители или среды или эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, фармацевтически приемлемым или приемлемым для ветеринарии носителем или средой или эксципиентом может быть 0,9% раствор NaCl (например, физиологический раствор) или фосфатный буфер. Дозы и объемы доз обсуждаются здесь в описании настоящей заявки и также могут быть определены специалистом из указанного описания в сочетании со знаниями в данной области без проведения соответствующих экспериментов.

Термин «композиция вакцины» здесь используют для обозначения композиции, которая включает, по меньшей мере, один антиген или иммуноген в фармацевтически приемлемом носителе (среде) для индуцирования иммунного ответа в хозяине. Композиции вакцин можно вводить в дозах и по методикам, хорошо известным специалистам в медицине и ветеринарии, принимая во внимание такие факторы, как возраст, пол, массу тела, вид и состояние животного-реципиента и путь введения. Путь введения может быть чрезкожным, введением через слизистую (например, пероральный, назальный, глазной) или парентеральным (например, внутрикожный, внутримышечный, подкожный). Для парентерального введения продукта хозяину можно использовать или шприц с иглой, или безыгольное устройство для инъекций. Композиции вакцины можно вводить отдельно или их можно вводить совместно или последовательно с другими препаратами и видами лечения. Формы для введения могут включать суспензии и препараты для парентерального, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения (например, введение путем инъекции), такие как стерильные суспензии и эмульсии. Композиции вакцин можно вводить в виде спрея или в смеси с пищей и/или водой или доставлять в смеси с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза или т.п. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, буферные агенты, регулирующие рН, адъюванты, гелеобразователи или агенты, увеличивающие вязкость, консерванты, вещества, придающие вкус и аромат, красители и т.п. в зависимости от пути введения и требуемого препарата.

Можно обратиться за справкой к нормативным фармакологическим руководствам, таким, например, как "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990) для того, чтобы получить подходящие препараты без излишнего экспериментирования.

Настоящее изобретение в одном варианте осуществления изобретения относится к новому адъюванту или эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), которая может содержать:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген вакцины, способные индуцировать иммунный ответ в хозяине,

(2) неионногенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда,

(3) минеральное масло,

(4) неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен (блок-сополимер РОЕ-РОР) и/или любой их комбинации.

Настоящее изобретение в еще одном варианте осуществления изобретения относится к новому адъюванту или эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), которая может содержать:

(1) водный раствор, содержащий антиген, используемый для приготовления вакцины, или иммуноген, способные индуцировать иммунный ответ в хозяине,

(2) неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен (блок-сополимер РОЕ-РОР) и/или любой их комбинации,

(3) минеральное масло,

(4) неионогенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда.

Эмульсии, изготовленные по настоящему изобретению, базируются на комбинации, по меньшей мере, двух поверхностно-активных веществ, выбранных из двух различных групп поверхностно-активных веществ (липофильных и гидрофильных поверхностно-активных веществ), и возможно использование одного или нескольких поверхностно-активных веществ, относящихся к каждой группе.

Липофильный этоксилированный спирт жирного ряда может представлять собой этоксилированный спирт жирного ряда, который может содержать приблизительно 43% молекулярной массы (мас./мас.) или меньше этиленоксида (ЕО). Липофильный блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен (блок-сополимер РОЕ-РОР) представляет собой сополимер, который может содержать приблизительно 35% (мас./мас.) или меньше этиленоксида.

Гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда может представлять собой этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше приблизительно 43% (мас./мас.) этиленоксида (ЕО). Гидрофильный блок-сополимер полиоксиэтилен- полиоксипропилен (блок-сополимер РОЕ-РОР) представляет собой сополимер, который может содержать приблизительно 55% (мас./мас.) или меньше этиленоксида.

Для неионогенных гидрофильных поверхностно-активных веществ этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой С9-С22 спирт жирного ряда и предпочтительно выбран из группы, состоящей из олеилового, цетилового, стеарилового, изостеарилового, лаурилового спирта и их комбинаций, предпочтительно олеилового спирта и более предпочтительно олеилового спирта, этоксилированного 5-21 ЕО. MM блок-сополимера РОЕ-РОР составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 16000.

Группа неионогенных гидрофильных поверхностно-активных веществ включает (но не ограничивается перечисленными ниже) этоксилированные спирты жирного ряда: Brij® 76 [Steareth-10], Brij® 56 [Ceteth-10], Brij® 96/97 [Oleth-10], Brij® 98 [Oleth-20], Brij® 721 [Steareth-21], Brij® 58 [Ceteth-20], Brij® 35 [Laureth-23], Brij® 78 [Steareth-20], (Uniqema) Volpo® N5 [Oleth-5], Volpo® CS6 [Ceteareth-6], Volpo® CS12 [Ceteareth-12], Volpo® CS20 [Ceteareth-20], Volpo® CS25 [Ceteareth-25], Volpo® CS23 [Ceteareth-23] (Croda), BL9-EX [Laureth-9], BC-7 [Ceteth-7], BT-5 [C12-14 Pareth- 5], BT-7 [C12-14 Pareth-7], BT-9 [C12-14 Pareth-9], BT-12 [C12-14 Pareth-12], BD-IO [C12-15 Pareth-10], BO-7V [Oleth-7], BC5,5 [Ceteht-6], BL-21 [Laureth-21], BL-25 [Laureth-25], BC-15TX [Ceteth-15], ВС-23 [Ceteth-23], BC-25TX [Ceteth-25], BO-15V [Oleth-15], BO-50V [Oleth-50], BB-20 [Beheneth-20], (Nikko Chemicals) и их комбинации; блок-сополимеры РОЕ-РОР: Lutrol® F127 [Poloxamer 407], Lutrol® F68 [Poloxamer 188], Lutrol® F108 [Poloxamer 338], Lutrol® F98 [Poloxamer 278], Lutrol ®F87 [Poloxamer 227], Lutrol® F88 [Poloxamer 228], Lutrol® F77 [Poloxamer 207], Lutrol® F38 [Poloxamer 108] (BASF), Tetronics®T1307, Tetronics®T1107, Tetronics®T908 (BASF) и их комбинации.

Для неионогенных липофильных поверхностно-активных веществ этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой С9 - С22 спирт жирного ряда и предпочтительно выбран из группы, состоящей из олеилового, цетилового, стеарилового, изостеарилового, лаурилового спирта и их комбинаций, предпочтительно и более предпочтительно олеилового спирта, этоксилированного 1-4 ЕО. MM блок-сополимера РОЕ-РОР составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 8000.

Группа неионогенных липофильных поверхностно-активных веществ включает (но не ограничивается перечисленными ниже) этоксилированные спирты жирного ряда: Brij® 30 [Laureth-4], Brij® 92/93 [Oleth-2], Brij® 72 [Steareth-2], Brij® 52 [Ceteth-2] (Uniqema), Volpo® L3 [C12-13 Pareth-3], Volpo® N3 [Oleth-3], Volpo® L4 [C12-13 Pareth-4] (Croda), BS-4 [Steareth-4], BD-2 [C12-15 Pareth-2], BD-4 [C12-15 Pareth-4], BT-3 [C12-14 Pareth-3] (Nikko Chemicals), их комбинации; блок-сополимеры POE-POP: Pluronic® L121 [Poloxamer 401], Pluronic® L101 [Poloxamer 331], Pluronic® L81 [Poloxamer 221], Pluronic® L62 [Poloxamer 182], Pluronic® L43 [Poloxamer 123], Pluronic® P103 [Poloxamer 333], Pluronic® L123 [Poloxamer 403], Lutrol® L63 [Poloxamer 183], Lutrol® P122 [Poloxamer 402], Lutrol® L92 [Poloxamer 272], Lutrol® L72 [Poloxamer 202], Lutrol® L42 [Poloxamer 122], Lutrol® L61 [Poloxamer 181] (BASF), Tetronics®T1301, Tetronics®T701, Tetronics®T901 (BASF) их комбинации.

Поверхностно-активные вещества по изобретению могут содержать спирты жирного ряда животного и растительного происхождения. Изменение вещества одного типа происхождения на вещество другого типа происхождения можно осуществить просто путем только незначительного регулирования состава эмульсии.

Общая концентрация поверхностно-активных веществ в эмульсии по изобретению (по массе на объем эмульсии) составляет от приблизительно 0,2% до приблизительно 6,5%, конкретно от приблизительно 1% до приблизительно 6%, предпочтительно от приблизительно 1,5% до приблизительно 5%, более предпочтительно от приблизительно 2% до приблизительно 3%.

Такие эмульсии обладают низкой вязкостью и их легко вводить путем инъекций.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к эмульсии типа «масло-в-воде» (О/W), которая может содержать:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине;

(2) неионогенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда;

(3) минеральное масло;

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше приблизительно 43% и меньше приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида;

(5) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий приблизительно 71% (мас./мас.) или больше этиленоксида.

Этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше приблизительно 43% и меньше приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида представляет собой предпочтительно олеиловый спирт, этоксилированный (5-14 ЕО). Спирт жирного ряда, содержащий приблизительно 71% (мас./мас.) или больше этиленоксида, представляет собой предпочтительно олеиловый спирт, этоксилированный 15 ЕО или больше.

В указанном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда обычно составляет от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,0%, конкретно от приблизительно 1,5% до приблизительно 4,5%, более предпочтительно от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,5%, выражаемая в процентах массы к объему эмульсии (мас./об.). Для неионогенных высокогидрофильных этоксилированных спиртов жирного ряда концентрация обычно составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 3,0%, конкретно от приблизительно 0,05% до приблизительно 2,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,0% (мас./об.). Концентрация неионогенного липофильного этоксилированного спирта жирного ряда составляет обычно от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5%, конкретно от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,0%, предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,2% (мас./об.).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к эмульсии типа «масло-в-воде» (O/W), которая может содержать:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине,

(2) неионогенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда,

(3) минеральное масло,

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда.

(5) неионогенный гидрофильный блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен.

Гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой предпочтительно спирт жирного ряда, содержащий больше приблизительно 43% и меньше, чем приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида, более предпочтительно олеиловый спирт, этоксилированный 5-14 ЕО. Неионогенный блок-сополимер РОЕ-РОР может предпочтительно содержать 70% (мас./мас.) этиленоксида или больше.

В указанном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, выражаемая в процентах массы на объем эмульсии (мас./об.), составляет обычно от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,0%, конкретно от приблизительно 1,5% до приблизительно 4,5%, более предпочтительно от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,5%. Для неионогенного блок-сополимера концентрация обычно составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 2,0%, более конкретно от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,5% (мас./об.). Концентрация неионогенного липофильного этоксилированного спирта жирного ряда обычно составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5%, конкретно от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,0%, предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,2% (мас./об.).

Эмульсия по изобретению обычно может иметь температуру инверсии фаз (PIT) больше или равную 25°С, конкретно в интервале от приблизительно 28°С до приблизительно 65°С, более конкретно от приблизительно 33°С до приблизительно 60°С.

PIT представляет собой температуру, при которой эмульсия типа «вода-в-масле» превращается в эмульсию типа «масло-в-воде» или разрушается (разрушение эмульсии и разделение 2 фаз). Величину PIT можно измерить различными средствами, например, визуально или путем измерения проводимости. Эмульсию помещают в водяную баню при температуре ниже, чем PIT данной эмульсии, например, приблизительно 25°С. Температуру постепенно повышают. Наблюдают изменения внешнего вида эмульсии, т.е. изменение текучести, разделение на две фазы, изменение внешнего вида поверхности, обусловленное миграцией масляной фазы к поверхности, и сравнивают с контрольной эмульсией. Температура, для которой визуально наблюдают такое изменение внешнего вида, представляет собой величину PIT эмульсии. Альтернативно PIT определяют быстрым переходом от величины проводимости, равной приблизительно 5-15 миллисименс/сантиметр (mS/cm) (эмульсия типа «масло-в-воде), к величине приблизительно равной 0 mS/cm (эмульсия типа «вода-в-масле») для физиологического раствора в качестве водной фазы, измеряемой зондом, помещенным в эмульсию вблизи ее поверхности. Температура, для которой наблюдается переход, представляет собой PIT для данной эмульсии. Специалист средней квалификации в данной области техники сможет определить комбинации поверхностно-активных веществ и масла, включая их относительные концентрации, для того, чтобы получить эмульсии по изобретению и конкретно эмульсии, имеющие PIT в интервалах, определенных выше, без излишнего экспериментирования.

Как правило, эмульсии по настоящему изобретению могут содержать по объему на объем эмульсии (об./об.) от приблизительно 2% до приблизительно 50% масляной фазы, включающей масло(а) и поверхностно-активные вещества, конкретно от приблизительно 4% до приблизительно 40%, предпочтительно от приблизительно 8% до приблизительно 35% и, более предпочтительно от приблизительно 15% до приблизительно 30% масляной фазы. По определению интервалы значений в настоящем описании всегда включают границу интервала, если не указано иное.

Применяемое масло может представлять собой минеральное масло, включающее парафиновое масло, такое как изопарафиновое масло и/или нафтеновое масло, сквалан, сквален, пристан, полиизобутен, гидрированный полиизобутен, полидецен, полиизопрен и т.п. Одно предпочтительное минеральное масло, применимое в настоящем изобретении, может включать масло, содержащее линейную или разветвленную углеродную цепь, содержащую более 15 атомов углерода, предпочтительно от 15 до 32, и не содержащее ароматических соединений. Такие масла могут, например, быть маслами, которые позиционированы на рынке под названием MARCOL® 52 или MARCOL® 82 (Esso) или "DRAKEOL® 6VR" (Penreco).

Масло может также представлять собой смесь масел, содержащую, по меньшей мере, 2 масла, выбранных из масел, описанных здесь, и в любом соотношении. Смесь масел может также содержать, по меньшей мере, одно масло, выбранное из масел, описанных выше, и, по меньшей мере, одно растительное масло, и упомянутое растительное масло составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 33% масляной фазы, предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 15% об./об. Упомянутые растительные масла представляют собой ненасыщенные масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, которые способны к биологическому разложению и преимущественно являются жидкими при температуре хранения (примерно +4°С) или, по меньшей мере, позволяют получать эмульсии, которые являются жидкими при указанной температуре. Растительное масло может, например, представлять собой арахисовое масло, ореховое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, соевое масло, масло энотеры и т.п.

Настоящее изобретение обычно предусматривает применение водного раствора, содержащего подходящие для ветеринарии и фармацевтических целей носитель, эксципиент или разбавитель, включающие стерильную воду, физиологический раствор, глюкозу, буфер и т.п., но не ограниченные ими. Носитель, эксципиент или разбавитель могут также включать полиолы, глюциды или агенты, регулирующие рН. Носитель, эксципиент или разбавитель могут также содержать, например, аминокислоты, пептиды, антиоксиданты, бактерицид, бактериостатические соединения. К маслу прибавляют водный раствор и поверхностно-активные вещества в количестве, необходимом для получения 100% объема эмульсии по изобретению.

Настоящее изобретение предусматривает эмульсию, содержащую парафиновое масло, этоксилированный олеиловый спирт (2-3 ЕО) в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества, этоксилированный олеиловый спирт (5-6 ЕО) в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества и блок-сополимер РОЕ-РОР, содержащий приблизительно 70-80% ЕО и имеющий ММ примерно 9800-16000, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества. Конкретно концентрация парафинового масла составляет от приблизительно 5% до приблизительно 50% и предпочтительно от приблизительно 15% до приблизительно 30% (об./об.), концентрация этоксилированного (2-3 ЕО) олеилового спирта составляет от 0,1% до 1,5%, предпочтительно от 0,1% до 1,2% (мас./об.), концентрация этоксилированного (5-6 ЕО) олеилового спирта составляет 1% до 5%, предпочтительно от 1% до 4% (мас./об.) и концентрация блок-сополимера РОЕ-РОР, содержащего приблизительно 70-80% ЕО и имеющего ММ примерно 9800-16000, составляет от 0,01% до 2%, предпочтительно от 0,05% до 1,5% (мас./об.).

Во втором варианте осуществления настоящего изобретения эмульсия включает парафиновое масло, этоксилированный (2-3 ЕО) олеиловый спирт в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества, этоксилированный (10 ЕО) олеиловый спирт в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества и блок-сополимер РОЕ-РОР, содержащий приблизительно 70-80% ЕО и имеющий ММ примерно 9800-16000, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества. Конкретно, концентрация парафинового масла составляет от 5% до 50%, предпочтительно от 15% до 30% (об./об.); концентрация этоксилированного (2-3 ЕО) олеилового спирта составляет от 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.); концентрация этоксилированного (10 ЕО) олеилового спирта составляет 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.) и концентрация блок-сополимера РОЕ-РОР, содержащего приблизительно 70-80% ЕО и имеющего ММ примерно 9800-16000, составляет от 0,01% до 2%, предпочтительно от 0,05% до 1,5% (мас./об.).

В третьем варианте осуществления настоящего изобретения эмульсия включает парафиновое масло, этоксилированный (2-3 ЕО) олеиловый спирт в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества, этоксилированный (5-6 ЕО) олеиловый спирт в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества. Конкретно, концентрация парафинового масла составляет от 5% до 50%, предпочтительно от 15% до 35% (об./об.); концентрация этоксилированного (2-3 ЕО) олеилового спирта составляет от 0,5% до 2% (мас./об.); концентрация этоксилированного (5-6 ЕО) олеилового спирта составляет от 1% до 5%, предпочтительно от 2,0% до 4,5% (мас./об.).

К эмульсии могут быть необязательно прибавлены в качестве соадъювантов другие соединения, включающие (но неограниченные перечисленным ниже) алюминий, CpG-олигонуклеотиды (ODN), конкретно ODN 2006, 2007, 2059, 2216 или 2135 [Pontarollo R. A. et al., Vet. Immimol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette CM. et al., Vet. Immimol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al. Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103; Kerkmann M. et al., J. Immunol, 2003, 170: 4465-4474]; полиА-полиU ["Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03]; бромид диметилдиоктадециламмония (DDA) ["Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157], N,N-диоктадецил-N',N'-bis(2-гидроксиэтил)пропандиамин (например, Avridine®) [Ibid, p.148], карбомер, хитозан [см. например, патент США №5980912].

Настоящее изобретение также относится к способу изготовления композиции вакцин или иммунологической композиции, включающей, по меньшей мере, один антиген или иммуноген и адъювант или эмульсию, приготовленную согласно настоящему изобретению. Иммуноген может быть введен во время образования эмульсии или в альтернативном варианте осуществления изобретения иммуноген можно прибавлять к эмульсии позже, например, непосредственно перед использованием.

Все количество используемого водного раствора может находиться в эмульсии, полученной сначала. Или, возможно, что только часть указанного водного раствора используют для образования эмульсии, а остальное количество водного раствора прибавляют с включением иммуногена. Иммуноген или антиген может быть в лиофилизированной форме или в некоторых других подходящих твердых формах, и затем его смешивают с эмульсией или, альтернативно, антиген может находиться в растворе, конкретно в водном растворе, и этот раствор смешивают с эмульсией.

Поверхностно-активные вещества предпочтительно прибавляют или к маслу, или к водному раствору в соответствии с их растворимостью. Например, неионогенные липофильные поверхностно-активные вещества прибавляют к маслу, по изобретению, тогда как неионогенные гидрофильные поверхностно-активные вещества прибавляют к водному раствору.

Эмульгирование может быть осуществлено обычными способами, известными среднему специалисту в данной области техники. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения эмульсию можно приготовить при температуре, которая ниже PIT эмульсии, в частности, при комнатной температуре, например, при температуре около 30°С. Водную фазу и масляную фазу смешивают путем механического перемешивания, например, турбинной мешалкой, снабженной ротором-статором, способной создавать большое сдвиговое усилие. Предпочтительно, перемешивание начинают при низкой скорости вращения и медленно ее увеличивают при постепенном прибавлении обычно водного раствора к маслу. Предпочтительно, чтобы водный раствор постепенно прибавляли к маслу. Отношение масло/водный раствор может быть адаптировано для получения эмульсии типа «вода-в-масле» (W/O), например, при концентрации от приблизительно 40% до приблизительно 55% масла (об./об.). Когда перемешивание прекращают, эмульсия постепенно изменяется, превращаясь в эмульсию типа «масло-в-воде» при охлаждении при комнатной температуре (инверсия фаз). После инверсии, если необходимо, эмульсию разбавляют путем прибавления водного раствора для получения нужной концентрации масла в конечной эмульсии. Эмульсию можно хранить при температуре примерно 5°С.

В еще одном варианте осуществления изобретения эмульсию можно получать при температуре выше, чем PIT-эмульсии. На первой стадии смешивают водную фазу и масляную фазу при температуре выше, чем PIT-эмульсии. Предпочтительно постепенно прибавлять водный раствор к маслу. Отношение масло/водный раствор может быть адаптировано для получения эмульсии типа «вода-в-масле» (W/O), например, при концентрации от приблизительно 40% до приблизительно 55% масла (об./об.). Эмульгирование можно осуществить путем перемешивания с низким сдвиговым усилием или без сдвигающего усилия, например, с помощью статического миксера или мешалки пропеллерного или турбинного типа с очень низкой скоростью вращения. Полученная эмульсия представляет собой эмульсию типа «вода-в-масле» (W/О). На второй стадии эмульсию постепенно охлаждают ниже PIT. На этой стадии эмульсия изменяется, превращаясь в эмульсию типа O/W (инверсия фаз). После инверсии, если необходимо, эмульсию разбавляют путем прибавления водного раствора для получения нужной концентрации масла в конечной эмульсии. Эмульсию можно хранить при температуре примерно 5°С.

Размер капель масла в эмульсии может составлять от приблизительно 100 нм до приблизительно 500 нм. Эмульсию можно использовать, например, в качестве адъюванта для составления композиции вакцины или фармацевтической композиции. Эмульсию можно также использовать в качестве растворителя для растворения высушенного продукта, особенно лиофилизованного продукта, содержащего, например, ослабленные микроорганизмы или живые рекомбинантные векторы.

В конкретном варианте осуществления изобретения предварительную эмульсию получают только с частью водного раствора. Указанную предварительную эмульсию можно разбавлять, чтобы получить конечную композицию, прибавляя суспензию активного ингредиента, такого как лекарственное средство или иммуноген, предпочтительно иммуноген. Альтернативно, предварительную эмульсию можно разбавлять водным раствором и использовать для растворения высушенного продукта, такого как лиофилизованный продукт.

Иммуноген или антиген, подходящие для применения по настоящему изобретению, могут быть выбраны из группы, состоящей из инактивированных патогенов, ослабленных патогенов, иммуногенных субъединиц (например, белки, полипептиды, пептиды, эпитопы, гаптены) или рекомбинантных экспрессирующих векторов, включающих плазмиды, содержащие иммуногенные вставки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноген представляет собой инактивированный или убитый организм. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция вакцины содержит иммуноген, выбранный из группы птичьих патогенов, включающих (но не ограниченных перечисленными ниже) Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус ньюкасльской болезни (NDV), вирус синдрома снижения несучести (EDS) или вирус инфекционного заболевания синовиальной сумки (IBDV), вирус птичьего гриппа и т.п. и их комбинации.

Альтернативно, композиция вакцины содержит иммуноген, выбранный из кошачьих патогенов, таких как (но не ограниченных ими) вирус герпеса кошек (FHV), каликовирус кошек (FCV), вирус лейкоза кошек (FeLV), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус бешенства и т.п.и их комбинации.

В еще одном варианте осуществления изобретения композиция вакцины по настоящему изобретению содержит иммуноген, выбранный из песьих патогенов, включающих (но не ограниченных перечисленными ниже) вирус бешенства, вирус герпеса собак (CHV), парвовирус собак (CPV), коронавирус собак, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica и т.п. и их комбинации.

В еще одном варианте осуществления изобретения композиция содержит иммуноген, выбранный из патогенов лошадей, таких как вирус герпеса лошадей (типа-1 или типа-4), вирус гриппа лошадей, столбняка, вирус «Западного Нила» и т.п. и/или их комбинации.

В еще одном варианте осуществления изобретения композиция содержит иммуноген, выбранный из бычьих патогенов, таких как вирус бешенства, бычий ротавирус, вирус бычьего парагриппа типа 3 (bPIV-3), бычий коронавирус, вирус бычьей вирусной диарреи (BVDV), вирус заболевания ног и рта (FMDV), бычий респираторный синтициальный вирус (BRSV), бычий вирус инфекционного ринотрахеита (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haeniolytica и т.п. и их комбинации.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит иммуноген, выбранный из свиных патогенов (но не ограниченных перечисленными ниже), таких как вирус гриппа свиней (SIV), свиной цирковирус типа 2 (PCV-2), вирус репродуктивного респираторного синдрома свиней (PRRS), вирус псевдобешенства (PRV), свиной парвовирус (PPV), FMDV, чума свиней (HCV), Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Helicobacter cerdo, Helicobacter pylori и т.п. и их комбинации.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям вакцин, содержащим, по меньшей мере, один иммуноген и эмульсию в фармацевтически приемлемом носителе. Иммуногены, включающие вирусы, бактерии, грибы и т.п. можно продуцировать методами культивирования in vitro, используя соответствующую культуральную среду или линии клеток хозяина и обычные методики, хорошо известные средним специалистам в данной области техники. Например, PRRS можно культивировать в соответствующей линии клеток, такой как линия клеток МА-104 [см. патенты США №5587164; 5866401; 5840563; 6251404 среди других]. PCV-2 может быть культивирован аналогичным образом с использованием линии клеток РК-15 [см. патент США №6391314], SIV можно культивировать на яйцах [патент США №6048537] и Mycoplasma hyopneumoniae можно культивировать в соответствующей культуральной среде [патенты США №5968525 и №5338543; Ross R. F. et al., Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905].

Для получения инактивированных иммунологических композиций или композиций вакцин патоген предпочтительно инактивируют после харвестирования или необязательно подвергают очистке средствами химической обработки, используя, например, формальдегид, бета-пропиолактон, этиленимин, бинарный этиленимин (ВЕI), тимеросал и т.п. и/или обрабатывают физическими методами (например, подвергают нагреванию или действию ультразвука). Способы инактивации хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, вирус PRRS может быть инактивирован обработкой бета-пропиолактоном [Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370] или обработкой BEI [патент США №5587164], инактивацию вируса PCV-2 можно осуществить путем обработки этиленимином или путем обработки бета-пропиолактоном [Патент США №6391314]; вирус свиного гриппа можно инактивировать с помощью детергента типа Triton или обработкой формальдегидом [Патент США №6048537], Mycoplasma hyopneumoniae bacterium можно инактивировать обработкой формальдегидом [Ross R.F. supra], этиленимином или BEI [см. WO 91/18627] или обработкой тимеросалом [патенты США №5968525 и №5338543].

Инактивированный патоген можно концентрировать по общепринятьм методикам для концентрирования, конкретно ультрафильтрацией, и/или очищать обычными методами, конкретно хроматографическими приемами, включающими (но не ограниченными перечисленными ниже) гель-фильтрацию, ультрацентрифугирование на градиенте сахарозы или селективное осаждение, в частности, с использованием полиэтиленгликоля (PEG).

Иммуногены, применимые в композициях вакцин по настоящему изобретению, включают также экспрессирующие векторы. Термин "вектор" относится к плазмиде или вирусу рекомбинантной ДНК или РНК, например, к вирусам оспы, аденовирусам, вирусам герпеса, которые содержат гетерологичный полинуклеотид, доставляемый к клетке-мишени либо in vitro, либо in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может содержать последовательность, представляющую интерес для терапевтических целей, и может необязательно быть в виде полигенного экспрессирующего кластера. Для использования здесь нет необходимости в том, чтобы вектор был способен к репликации в отдаленной клетке-мишени или субъекте. Термин включает клонирующий вектор для трансляции кодирующей последовательности полинуклеотида. Вирусные векторы также включены.

Термин «рекомбинантный» обозначает полинуклеотид геномной сДНК полусинтетического или синтетического происхождения, которая или не встречается в природе или связана с еще одним полинуклеотидом в систему, которая не обнаружена в природе.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения экспрессирующие векторы представляют собой экспрессирующие векторы, используемые для in vitro экспрессии белков в соответствующей клеточной системе. Экспрессируемые белки можно собирать в супернатанте культуры или из супернатанта культуры после (или не после) секреции (если не имеется секреции, когда лизис клеток происходит или его осуществляют), необязательно концентрировать методами концентрирования, такими как ультрафильтрация, и/или очищать такими методами очистки, как аффинная, ионообменная или гель-фильтрационная хроматография, и использовать для приготовления эмульсии по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также охватывает рецептуры поливалентных иммунологических композиций или композиций комбинированных вакцин. Например, антигены, применимые в комбинации бычьей убитой бактериальной вакцины, изготовленной по настоящему изобретению, включают (но не ограничены перечисленными ниже) Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., особенно P. multocida и Р. haemolytica, Haemophilus sp., особенно Н. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E.coli и т.п.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам индуцирования иммунного ответа у хозяина, например, животного, которые включают введение хозяину иммунологической композиции или композиции вакцины по изобретению. Иммунные ответы, вызванные таким образом, представляют собой в основном антительные и/или клеточные иммунные ответы и, в частности, ответ гамма-интерфероном.

Конкретно, настоящее изобретение относится способам для иммунизации патогенным организмом против инфекции или для предотвращения или уменьшения симптомов, вызванных инфекцией животного патогенным организмом (например, инфекцией вирусом, бактериями, грибами или простейшими паразитами). Способ по настоящему изобретению применим для позвоночных животных, включающих (но не ограниченных перечисленными ниже) человека, семейство псовых (например, собаки), семейство кошачьих (например, кошки), семейство лошадей (например, лошади), жвачных животных (например, крупный рогатый скот), семейство свиней (например, свиньи), семейство овец (например, овцы), семейство коз (например, козы), кроликов, а также птиц, включающих (но не ограниченных ими) кур, индюков, уток, гусей, перепелов, фазанов, попугаев, певчих птиц, соколов, ворон и бескилевых птиц (страусы, эму и казуары).

В конкретном аспекте изобретения указанные способы состоят в вакцинации беременных женских особей перед родами путем введения композиции вакцины, приготовленной по изобретению. Указанные способы дополнительно включают индуцирование защитных антител, вызываемым протоколом вакцинации и переносом упомянутых защитных антител от вакцинированных беременных женских особей к их потомству. Перенос таких материнских антител впоследствии защищает потомство от заболевания.

Дозировка композиции вакцины, приготовленной по настоящему изобретению, будет зависеть от вида, породы, возраста, размера, истории вакцинации, состояния здоровья вакцинируемого животного. Другие факторы, такие как концентрация антигена, дополнительные компоненты вакцины и путь введения (т.е. подкожное, интрадермальное, пероральное и внутримышечное введение) также будут влиять на эффективную дозу. Дозу вакцины для введения легко определить, исходя из концентрации антигена в вакцине, пути введения и возраста и состояния животного, подлежащего вакцинированию. Альтернативно, систематические испытания иммуногенности различных доз, а также исследования LD50 и другие методики скрининга можно использовать для определения эффективной дозы для композиции вакцины по настоящему изобретению без проведения излишних экспериментов.

Из примеров, представленных ниже, легко понять, какая приблизительная доза и какой приблизительный объем будут подходящими для применения композиции вакцины, описанной в настоящей заявке. Решающим фактором является то, что доза обеспечивает, по меньшей мере, частичный защитный эффект против природной инфекции, что подтверждается уменьшением смертности и заболеваемости, связанными с природной инфекцией. Соответствующий объем также легко определяется средним специалистом в данной области техники. Например, для видов птиц объем дозы может составлять от приблизительно 0,1 мл до приблизительно 0,5 мл и предпочтительно от приблизительно 0,3 мл до приблизительно 0,5 мл. Для животных семейства кошачьих, псовых и лошадей объем дозы может составлять от приблизительно 0,2 мл до приблизительно 3,0 мл, предпочтительно от приблизительно 0,3 мл до приблизительно 2,0 мл и более предпочтительно от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 1,0 мл. Для крупного рогатого скота и свиней объем дозы может составлять приблизительно от 0,2 мл до приблизительно 5,0 мл, предпочтительно от приблизительно 0,3 мл до приблизительно 3,0 мл и более предпочтительно от 0,5 мл до приблизительно 2,0 мл.

Повторная вакцинация через регулярные интервалы времени может быть предпочтительна для усиления иммунного ответа первичной вакцинации или тогда, когда прошел длительный период времени после введения последней дозы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию вакцины вводят путем парентеральной инъекции (т.е. подкожно, интрадермально или внутримышечно). Композицию можно вводить в виде одной дозы или в альтернативных вариантах осуществления изобретения - в виде повторяющихся доз от примерно двух до примерно пяти через заданные интервалы, в течение периода времени от приблизительно двух до приблизительно шести недель, предпочтительно от приблизительно двух до приблизительно пяти недель. Однако специалист в данной области техники должен сознавать, что количество доз и интервалы времени между вакцинациями зависят от ряда факторов, включающих (но не ограничивающихся перечисленными ниже) возраст вакцинируемого животного, состояние животного, в частности, в присутствии материнских антител, путь иммунизации, количество антигена, имеющегося в дозе и т.п. Для первичной вакцинации период составляет обычно больше недели и предпочтительно составляет от приблизительно двух до приблизительно пяти недель. Для ранее вакцинированных животных повторную вакцинацию до или во время беременности можно проводить с интервалом примерно в год.

Настоящее изобретение также предполагает введение композиции вакцины с помощью безыгольного устройства для инъекций, такого как Pigjet®, Avijet®, Dermojet® или Biojector® (Bioject, Oregon, USA), но не ограниченного перечисленными выше. Средний специалист в данной области техники способен приспособить технические условия устройства для инъекций к требуемым в отношении таких факторов, как вид вакцинируемого животного, возраст и масса животного и т.п. без проведения излишних экспериментов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает однократное введение композиции вакцины, приготовленной с эмульсией по изобретению. Например, в одном варианте осуществления изобретения композиция вакцины представляет собой вакцину инактивированного Mycoplasma hyopneumoniae, тогда как альтернативный вариант осуществления изобретения предусматривает вакцину, содержащую композицию инактивированного вируса PCV2. Другие иммунологические композиции или вакцины подходят для применения по схеме с однократной дозой, включающие инактивированные PRRS и SIV, но не ограниченнные ими. Вакцину также можно вводить в присутствии антител, существующих до введения.

Кроме того, изобретение относится к способам лечения хозяина, например, животного, которые включают введение хозяину фармацевтической композиции, приготовленной по изобретению и содержащей, по меньшей мере, один иммуноген, выбранный из группы, состоящей из белков или пептидов, антител, аллергенов, CpG ODN, факторов роста, цитокинов или антибиотиков и конкретно CpG ODN или цитокинов. Упомянутые фармацевтические композиции можно использовать для повышения эффективности роста у животных, таких как куры, свиньи и коровы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему два флакона, первый из них содержит такой ингредиент, как иммуноген или фармацевтическую композицию, а второй флакон содержит эмульсию, приготовленную по настоящему изобретению. Иммуноген может находиться в лиофилизированном виде, в высушенном виде или в водном растворе, как описано в данной заявке.

Теперь изобретение будет дополнительно описано на следующих примерах, не ограничивающих объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Способ изготовления эмульсии

Эмульсию получают в две стадии, как описано ниже.

Первая стадия. Для приготовления рецептур используют эмульгатор «Silverson» (типа L4RT с дезинтегрирующей головкой диаметром 10 мм) с большим сдвигом ротора-статора. Для получения эмульсии один объем масляной фазы эмульгируют при 35°С с одним объемом водной фазы #1. Водную фазу прибавляют к масляной фазе при перемешивании 5000 об/мин (оборотов в минуту) в течение 1 минуты. Скорость вращения постепенно увеличивают по мере увеличения объема до 8300 об/мин в течение 1 минуты. Во время указанной стадии эмульсия представляет собой эмульсию типа «вода-в-масле». Конечная эмульсия LR4 является эмульсией типа O/W, содержащей 20% масляной фазы. Для эмульсии LR4 композиция фаз была следующей:

Масляная фаза (72 мл):
- Oleth-2 (Brij® 92) : 1,8% мас./об.
-Oleth-5(Volpo®N5) : 8,2% мас./об.
- Парафиновое масло (Marcol 82®) : 87,5% об./об.
- Консервант : 2,5% об./об.
Водная фаза #1 (108 мл):
- Poloxamer 407 (Lutrol® F127) : 0,58% мас./об.

- Изотонический буфер, содержащий динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8): Q. S. до 100,0% об./об.

Раствор (5% мас./об.) Lutrol® F 127 в том же буфере в качестве вакцины, например, в изотоническом буфере, содержащем динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8), используют для приготовления водной фазы #1.

Когда перемешивание прекращают, эмульсия изменяется, превращаясь в эмульсию типа «масло-в-воде». Эмульсию помещают в холодную камеру (5°С), по меньшей мере, на 4 часа. На данной стадии эмульсия представляет собой предварительную эмульсию, содержащую 40% масляной фазы.

Вторая стадия. Водную фазу #2 приготавливают из 180 мл фосфатного изотонического буфера, содержащего динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8) с иммуногеном(ами) (инактивированным иммуногеном Mycoplasma hyopneumoniae или иммуногеном PCV-2, как описано ниже). Предварительную эмульсию, как описано на первой стадии, охлаждают до приблизительно 5°С, разбавляют, прибавляя такой же объем водной фазы #2 при той же температуре и перемешивают вращением магнитного стержня в течение 1 минуты. Конечная концентрация поверхностно-активного вещества в эмульсии LR4 составляла 2,18% (мас./об.).

Полученные, как описано здесь, вакцины LR4 стабильны, по меньшей мере, в течение одного года при 5°С.

Используя ту же методику приготовления, можно получать другие эмульсии, как описано ниже:

Эмульсия LR3

Первая стадия. Конечная эмульсия LR3 представляет собой эмульсию типа O/W, содержащую 33% масляной фазы.

Масляная фаза (120 мл):
- Oleth-2 (Brij® 92) : 6,24% мас./об.
- Oleth-10 (Brij® 96) : 2,76% мас./об.
- Парафиновое масло (Marcol 82®) : 89,50% об./об.
- Консервант : 1,50% об./об.
Водная фаза #1 (120 мл):
- Poloxamer 407 (Lutrol® F127) : 1,20% мас./об.

- Изотонический буфер, содержащий динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8): Q.S. до 100,0% об./об.

Раствор (5% мас./об.) Lutrol® F 127 в том же буфере в качестве вакцины, например, в 0,02 М изотоническом буфере, содержащем динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8), используют для приготовления водной фазы #1.

Когда перемешивание прекращают, эмульсия изменяется, превращаясь в эмульсию типа «масло-в-воде». Эмульсию помещают в холодную камеру (5°С), по меньшей мере, на 4 часа. На данной стадии эмульсия представляет собой предварительную эмульсию, содержащую 50% масляной фазы.

Вторая стадия. Водную фазу #2 (120 мл) приготавливают из изотонического буфера, содержащего динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8) и иммуногена(ов).

Предварительную эмульсию, как описано на первой стадии, охлаждают до приблизительно 5°С, разбавляют, прибавляя половину объема водной фазы #2, при той же температуре и перемешивают вращением магнитного стержня в течение 1 минуты. Конечная концентрация поверхностно-активного вещества в эмульсии LR3 составляла 3,40% (мас./об.).

Полученные, как описано здесь, вакцины LR3 стабильны, по меньшей мере, в течение одного года при 5°С.

Эмульсия ВЕ1. Конечная эмульсия ВЕ1 представляет собой эмульсию типа O/W, содержащую 33% масляной фазы.

Масляная фаза (120 ml):
- Oleth-2(Brij® 92) : 3,0% мас./об.
-Oleth-5(Volpo®N5) : 9,1% мас./об.
- Парафиновое масло (Marcol 82®) : 86,4% об./об.
- Консервант : 1,5% об./об.

Водная фаза #1 (240 мл):

- Изотонический буфер, содержащий динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8): Q.S. до 100,0% об./об.

Водная фаза #1 содержит изотонический буфер, содержащий динатрийфосфат и монокалийфосфат 0,02 М (рН 7,8) 98,5% об./об. и иммуноген(ы). Эмульсию ВЕ1 не разбавляют перед использованием. Конечная концентрация поверхностно-активного вещества в эмульсии ВЕ1 составляла 4% (мас./об.).

Пример 2. Стабильность эмульсий

Композиции LR4 и LR3 стабильны даже в присутствии концентрированного(ых) иммуногена(ов) при 21°С в течение, по меньшей мере, 9 месяцев. Распределение частиц по размерам в эмульсиях не изменяется в течение указанного периода времени.

Пример 3. Комбинированная вакцина против Mycoplasma hyopneumoniae и PCV-2 - Композиция и безвредность на поросятах.

Материалы и методы. Две вакцины, полученные, как описано в примере 1, содержащие или эмульсию LR3, или эмульсию LR4, 12 антигенных единиц инактивированного Mycoplasma hyopneumoniae и 2,4 log10 (антигенных единиц) инактивированного свиного цирковируса типа 2 / на дозу. Двадцать четыре (24) поросенка, возраст которых составлял три недели (24), разделяют по случайной схеме на две группы. Группу 2 из двенадцати (12) поросят вакцинируют на 0 день композицией вакцины LR3 (4 мл) внутримышечно, тогда как группу 3 из двенадцати (12) поросят вакцинируют на 0 день композицией вакцины LR4 (4 мл) внутримышечно. Группа 1 соответствует невакцинированной контрольной группе. Ежедневно проводят осмотр поросят. Через две недели после инъекции наблюдают место инъекции и местные поражения.

Обработка Шок и общие реакции Гипертермия Относительная средняя ежедневная прибавка массы Размер местной реакции
Группа 1 (контроль) Реакция отсутствует -0,1±0,3* 6,5±1,9 0,0±0,0
Группа 2 (LR3) Реакция отсутствует 0,6±0,5 6,3±1,3 1,8±2,8
Группа 3 (LR4) Реакция отсутствует 0,1±0,2 6,4±1,7 8,4±11,4
* Среднее ± стандартное отклонение.

Результаты. Адъюванты LR3 и LR4 демонстрируют хорошие показатели безвредности.

Пример 4. Результаты серологических исследований после введения одной дозы вакцины против PCV-2 с эмульсией LR4 в качестве адъюванта

Материалы и методы. Вакцину, полученную, как описано в примере 1, содержащую эмульсию LR4, CpG ODN #2216 50 мкг/на дозу, 1,5 антигенных единиц инактивированного Mycoplasma hyopneumoniae и 1,5 log10 (антигенных единиц) инактивированного свиного цирковируса типа 2 / на дозу. Сорок (40) поросят, возраст которых составлял три недели (24), обладающих антителами материнского происхождения, существовавшими до эксперимента, разделяют по случайной схеме на две группы. Группу 2 из двадцати (20) поросят вакцинируют на 0 день композицией вакцины LR4 (0,5 мл) интрадермально с помощью безыгольного устройства для инъекций. Группа 1 соответствует невакцинированной контрольной группе. Отбирают образцы крови на D0, D21, D41, D63, D84, D126, D153 и D180 дни после вакцинации для титрования антител PCV-2 ORF2 методом ELISA.

Обработка D0 D21 D41 D63 D84 D126 D153 D180
Группа 1 3,08±0,58* 2,57+0,50 2,15±0,58 <1,51±0,48 <1,51±0,34 <1,51±0,17 <1,51±0,05 <1,51±0,02
Группа 2 2,91±0,52 2,35±0,52 2,44±0,35 2,67±0,50 2,60±0,49 2,40±0,49 2,48±0,54 2,43±0,54
** Среднее ± стандартное отклонение (log10 единицы).

Результаты. Как показано в таблице, все вакцинированные животные демонстрируют значительный антительный ответ против PCV-2 ORF2, начиная с 7-го до 180-го дня после вакцинации, даже при наличии материнских антител во время вакцинации.

Пример 5. Методика получения Helicobacter

Культура. Культуры бактерий выращивают из исходных культур на глицериновой среде, используя 5-10% инокулят в бульоне бруцелл с прибавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Культуры выращивают в колбах, снабженных крышкой с отверстием в тройном газовом инкубаторе (85% N2, 10% СO2, 5% O2) при 37°С и встряхивании со скоростью приблизительно 70 об/мин. Во время инокуляции пластины TSA+5% овечьей крови (SB) также используют в качестве диагностического теста для определения чистоты образца. Морфология колоний была точкообразной и четкой. На пластинах, оставленных в инкубаторе на 3-4 дня, виден некоторый гемолиз. Требовалось 24-36 часов для того, чтобы вырастить культуры до OD600>1. Выращенные культуры также помещают на пластины с TSA+5% SB и тестируют на продуцирование каталазы и уреазы (Helicobacter cerdo положительный для обоих ферментов).

Центрифугирование. Отбирают аликвоту культур, выращенных до ОD600>1 в стерильные пробирки центрифуги и центрифугируют при 7500 об/мин в течение 20 минут с ротором J 10 Beckman при приблизительно 8600 g. Супернатант отбрасывают и дебрисы промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). Дебрисы повторно суспендируют в PBS и отбирают аликвоты в флаконы для вакцины на 10 мл.

Лиофилизация. Препараты антигенов лиофилизируют в течение 36 часов без стабилизаторов или консервантов. Отмечают образование хорошо сформированных слоев осадка.

Гидролиз пепсином. Приготавливают раствор пепсина (0,1%) в 10 мМ НСl и дважды стерилизуют на фильтре, используя фильтр 0,2 микрон. Лиофилизованный препарат антигена гидролизуют пепсином (1 мкг пепсина прибавляют на каждый мг высушенной клеточной массы) в течение 25 часов при 37°С и легком покачивании. Образцы (100 мкл) наносят на пластины с TSA+5% SB (инкубированные при 37°С в тройном газовом микроаэрофильном инкубаторе) 18 и 25 часов; через 96 часов рост не наблюдается, что указывает на инактивирующий эффект гидролиза пепсином.

Нейтрализация PBS. Препараты антигенов имели рН около 2 после гидролиза пепсином, поэтому их нейтрализуют PBS (2:1 по объему). После нейтрализации рН составлял примерно 7.

Пример 6. Рецептуры препаратов антигенов, полученных из Helicobacter cerdo, обработанных пепсином или формалином.

Вакцины будут составлять, как показано в в таблице 1, без подготовки путем растворения лиофилизованных бактерий в 10 мл адъюванта на флакон. Значения отражают концентрацию каждого ингредиента после приготовления вакцины. Эмульсия LR2 эквивалентна эмульсии LR4, описанной в примере 1. В эмульсии LR2 конечная концентрация Lutrol F 127 составляет 0,20% (мас./об.) вместо 0,175% (мас./об.).

Таблица 1.
Рецептуры вакцин
Ингредиент Компоненты Количество ингредиента в мг на мл Количество ингредиента в мг на дозу (2 мл)
PBS 2 4
NaCl 0,05 0,1
КСl 0,2875 0,575
Na2HPO4 0,05 0,1
КН2РO4
Деионизированная вода 3,5 мкг 7,0 мкг
Пепсин (раствор) 0,042 0,084
НСl 3,5 7,0
Клетки Helicobcicter

Пример 7. Животные и способы вакцинации вакцинами на основе Н. cerdo.

Используемых животных выбирают из обыкновенных свиней, не имеющих PKRSV и М. Hyopneumoniae. Обыкновенных поросят выбирают, пока они не отделены от матерей. Регистрируют массы всех поросят.Поросят делят на две группы из, по меньшей мере, 5 особей каждая со стратификацией по массе, полу и происхождению. Всех поросят осматривают для обеспечения статуса здоровых. В группы для испытаний включают только клинически здоровых животных. Всех поросят идентифицируют. Поросят вакцинируют в возрасте 1-2 недель, пока они находятся с матерью. Одну группу поросят вакцинируют, а вторую группу оставляют невакцинированной для контроля. Вакцинированные животные получают 1 дозу 1 (2 мл на дозу) внутримышечно по 0, 5 мл в каждое плечо и бедро. Животные невакцинированной контрольной группы не получают никаких инъекций.

В возрасте 3 недель всех поросят отлучают от матери и заражают. Каждую группу помещают в отдельные загоны в изолированном объекте. Поросят вскрывают приблизительно через 28 дней после заражения. Поросят из группы отрицательного контроля вскрывают в день последнего вскрытия. Схема эксперимента суммирована в таблице 2.

Таблица 2.
Схема эксперимента
Описание лечения Заражение Helicobacter Отсутствие заражения
Вакцинируемая группа 5 поросят
Отрицательный контроль 5 поросят

Методика заражения и оценки. В случае серьезного клинического заболевания можно применять виды лечения, которые считаются необходимыми для благополучия животного. Для каждого животного записывают номер бирки на ухе, дату(ы) заболевания, предполагаемый диагноз, схему лечения и характер животного. После заражения животные не получают никакого лечения. Умирающих или раненых животных умерщвляют. Нездоровые животные (клиническое заболевание или ранение) могут быть исключены из групп для исследований.

Серологические и кожные тесты. Делают забор крови из верхней полой вены до вакцинации, заражения и вскрытия. Определяют уровни антител. Проводят кожные тесты.

Параметры продуктивности. Поросят взвешивают по прибытии, перед вакцинацией, перед заражением и при каждом вскрытии для оценки потенциального прироста или потери массы.

Вскрытие. Поросят вскрывают на 28 день после инфицирования, такой срок адаптирован для заражения.

Пример 8. Изоляты Helicobacter.

Два изолята бактерий (2662 и 1268) извлекают из слизистой желудка свиней микроаэрофильной культурой и переносят на планшеты со средой Skirrow.

Исходя из положения желудка (кардиального и полостного), морфологии (грамм-отрицательные, короткие, изогнутые "подобные крылу чайки" палочки), активности уреазы, способности реагировать с кроличьими антителами anti-Hp, оба изолята относят к виду Helicobacter, на основе SDS-PAGE и вестерн-блоттинг профилей; изолят 2662, как было обнаружено, аналогичен helicobacter pylori и получил название "Helicobacter cerdo". В отличие от изолята 2662, изолят 1268 имел особенный профиль.

Пример 9. Бактериальный потенциал, измеряемый активностью уреазы.

Пример 10. Воспалительная реакция желудка.

Воспалительную реакцию желудка (таблица 4) "подсчитывают" для фолликул и лимфатических инфильтратов в желудочном тонком слое по шкале: 0 - отсутствует, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - сильная. Общее количество баллов воспаления для каждого поросенка подсчитывают как сумму гистологических баллов в кардии и полости желудка. Средние баллы для группы рассчитывают из них.

Таблица 4.
Воспалительная реакция желудка
Число групп Среднее общее число баллов
Вакцинированная группа 3,6
Контрольная группа 4,4

Пример 11: Серологические ответы

Таблица 5.
Серологические ответы
Группы День 6 Первая вакцинация День 14 Вторая вакцинация День 24 День 40
Вакцинированная крупа 1,0 1,3 81,0 86,5
Контроль инфицирования 1,0 0,8 1,3 4,5
Suivaxyn Myco hyo+H.cerdo 6.9 11.8 99.9 97.3
Контроль 9.4 6.6 9.1 9.0

Вакцина против Н. cerdo обеспечивает хорошие индексы защитного иммунитета, базирующиеся на степени активности уреазы, слепой гистологической оценке срезов тканей и сильных серологических ответах. Комбинированная вакцина, содержащая Suivaxyn, Mycoplasma hyopneumoniae и Н. cerdo давала аналогичные гуморальные иммунные ответы.

* * *

Изобретение дополнительно описано нижеследующими пронумерованными абзацами.

1. Эмульсия типа «масло-в-воде» (O/W), включающая:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, используемый для приготовления вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине;

(2) неионногенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда;

(3) минеральное масло;

(4) неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен (блок-сополимера РОЕ-РОР) и/или любой их комбинации.

2. Эмульсия типа «масло-в-воде» (O/W), включающая:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, используемый для приготовления вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине;

(2) неионогенное липофильное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы этоксилированного спирта жирного ряда, блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен (блок-сополимера РОЕ-РОР) и/или любой их комбинации;

(3) минеральное масло;

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда.

3. Эмульсия согласно абзацу 1 или 2, где липофильный этоксилированный спирт жирного ряда содержит этиленоксид (ЕО), составляющий приблизительно 43% или меньше молекулярной массы (мас./мас.).

4. Эмульсия согласно абзацу 2, где липофильный блок-сополимер РОЕ-РОР содержит приблизительно 35% (мас./мас.) или меньше этиленоксида, или

5. Эмульсия согласно абзацу 2, где гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда содержит больше 43% (мас./мас.) этиленоксида (ЕО).

6. Эмульсия согласно абзацу 1, где гидрофильный блок-сополимер РОЕ-РОР содержит приблизительно 55% (мас./мас.) или больше этиленоксида.

7. Эмульсия согласно абзацу 3, где этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой С9-С22 спирт жирного ряда (и предпочтительно выбран из группы, состоящей из олеилового, цетилового, стеарилового, изостеарилового, лаурилового спирта и их комбинаций), предпочтительно олеиловый спирт и более предпочтительно олеиловый спирт, этоксилированный 1-4 ЕО.

8. Эмульсия согласно абзацу 5, где этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой С9-С22 спирт жирного ряда (и предпочтительно выбран из группы, состоящей из олеилового, цетилового, стеарилового, изостеарилового, лаурилового спирта и их комбинаций), предпочтительно олеиловый спирт и более предпочтительно олеиловый спирт, этоксилированный 5-21 ЕО.

9. Эмульсия согласно абзацу 4, где молекулярная масса (ММ) блок-сополимера РОЕ-РОР составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 8000.

10. Эмульсия согласно абзацу 6, где молекулярная масса (ММ) блок-сополимера РОЕ-РОР составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 16000.

11. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-10, где неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой этоксилированный спирт жирного ряда.

12. Эмульсия согласно абзацу 11, где этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой Brij® 76, Brij® 56, Brij® 96/97, Brij® 98, Brij® 721, Brij® 58, Brij® 35, Brij® 78 (Uniqema), Volpo® N5, Volpo® CS6, Volpo® CS12, Volpo® CS20, Volpo® CS25, Volpo® CS23 (Croda), BL9-EX, BC-7, BT-5, BT-7, BT-9, BT-12, BD-IO, BO-7V, BC 5,5, BT-5, BL-21, BL-25, BC-15TX, ВС-23, ВС-25ТХ, ВО-15V, BO-50V, BB-20, (Nikko Chemicals) или любую их комбинацию.

13. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-12, где неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой блок-сополимер РОЕ-РОР.

14. Эмульсия согласно абзацу 13, где блок-сополимер РОЕ-РОР представляет собой Lutrol® F1 27 [Poloxamer 407], Lutrol® F68 [Poloxamer 188], Lutrol® Fl 08 [Poloxamer 338], Lutrol® F98 [Poloxamer 278], Lutrol ®F87 [Poloxamer 227], Lutrol® F88 [Poloxamer 228], Lutrol® F77 [Poloxamer 207], Lutrol® F38 [Poloxamer 108] (BASF), Tetronics®T1 307, Tetronics®Tl 107, Tetronics®T908 (BASF) или любую их комбинацию.

15. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-14, где неионогенное липофильное поверхностно-активное вещество представляет собой этоксилированный спирт жирного ряда.

16. Эмульсия согласно абзацу 15, где этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой Brij® 30, Brij® 92/93, Brij® 72, Brij® 52 (Uniqema), Volpo® L3, Volpo® N3, Volpo® L4 (Croda), BS-4, BD-2, BD-4, BT-3 (Nikko Chemicals) или любую их комбинацию.

17. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-16, где неионогенное липофильное поверхностно-активное вещество представляет собой блок-сополимер РОЕ-РОР.

18. Эмульсия согласно абзацу 17, где блок-сополимер РОЕ-РОР представляет собой Pluronic® L121 [Poloxamer 401], Pluronic® L101 [Poloxamer 331], Pluronic® L81 [Poloxamer 221], Pluronic® L62 [Poloxamer 182], Pluronic® L43 [Poloxamer 123], Pluronic® P103 [Poloxamer 333], Pluronic® L123 [Poloxamer 403], Lutrol® L63 [Poloxamer 183], Lutrol® P122 [Poloxamer 402], Lutrol® L92 [Poloxamer 272], Lutrol® L72 [Poloxamer 202], Lutrol® L42 [Poloxamer 122], Lutrol® L61 [Poloxamer 181] (BASF), Tetronics®T1301, Tetronics®T701, Tetronics®T901 (BASF) или любую их комбинацию.

19. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-18, где суммарная концентрация поверхностно-активных веществ (по массе на объем эмульсии) составляет от приблизительно 0,2% до приблизительно 6,5%, конкретно от приблизительно 1% до приблизительно 6%, предпочтительно от приблизительно 1,5% до приблизительно 5%, более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3%.

20. Эмульсия типа «масло-в-воде» (O/W), включающая:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, используемый для приготовления вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине;

(2) неионогенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда;

(3) минеральное масло;

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше, чем приблизительно 43% и меньше, чем приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида (ЕО);

(5) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий приблизительно 71% (мас./мас.) или больше этиленоксида (ЕО).

21. Эмульсия согласно абзацу 20, где неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше, чем приблизительно 43% и меньше, чем приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида (ЕО), представляет собой этоксилированный (5-14 ЕО) олеиловый спирт.

22. Эмульсия согласно абзацу 20 или 21, где неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида (ЕО), представляет собой олеиловый спирт, этоксилированный 15 ЕО или больше.

23. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 20-22, где концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, содержащего больше, чем приблизительно 43% и меньше, чем приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида (выражаемая в процентах отношения массы к объему эмульсии (мас./об.)), составляет от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,0%, конкретно от приблизительно 1,5% до приблизительно 4,5%, более предпочтительно от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,5% (мас./об.).

24. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 20-23, где концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, содержащего приблизительно 71% или больше (мас./мас.) этиленоксида составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 3,0%, конкретно от приблизительно 0,05% до приблизительно 2,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,0% (мас./об.).

25. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 20-24, где концентрация неионогенного липофильного этоксилированного спирта жирного ряда составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5%, конкретно от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,0%, предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,2% (мас./об.).

26. Эмульсия типа «масло-в-воде» (0/W), включающая:

(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, используемый для приготовления вакцины, способный индуцировать иммунный ответ в хозяине;

(2) неионногенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда;

(3) минеральное масло;

(4) неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда;

(5) неионогенный гидрофильный блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен.

27. Эмульсия согласно абзацу 26, где гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой предпочтительно этоксилированный спирт жирного ряда, содержащий больше, чем приблизительно 43% и меньше, чем приблизительно 71% (мас./мас.) этиленоксида.

28. Эмульсия согласно абзацу 27, где спирт жирного ряда представляет собой олеиловый спирт, этоксилированный 5-14 ЕО.

29. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 26-28, где концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, выражаемая в процентах отношения массы спирта к объему эмульсии (мас./об.), составляет от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,0%, конкретно от приблизительно 1,5% до приблизительно 4,5%, более предпочтительно от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,5%.

30. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 26-29, где концентрация неионогенного гидрофильного блок-сополимера полиоксиэтилен-полиоксипропилен составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 2,0%, более конкретно от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,5% (мас./об.).

31. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 26-30, где концентрация неионогенного липофильного этоксилированного спирта жирного ряда составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5%, конкретно от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,0%, предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,5%, более предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,2% (мас./об.).

32. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 1-31, которая имеет температуру инверсии фаз (PIT) больше или равную 25°С.

33. Эмульсия согласно абзацу 32, PIT которой составляет от приблизительно 28°С до приблизительно 65°С, более конкретно от приблизительно 33°С до приблизительно 60°С.

34. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 26-30, которая содержит по объему на объем эмульсии (об./об.) от приблизительно 2% до приблизительно 50% масляной фазы, включающей масло(а) и поверхностно-активные вещества, конкретно от приблизительно 4% до приблизительно 40%, предпочтительно от приблизительно 8% до приблизительно 35% и более предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 30% масляной фазы.

35. Эмульсия согласно абзацу 34, где масло представляет собой минеральное масло.

36. Эмульсия согласно абзацу 35, где минеральное масло представляет собой парафиновое масло, такое как изопарафиновое масло и/или нафтеновое масло, сквалан, сквален, пристан, полиизобутен, гидрированный полиизобутен, полидецен, полиизопрен и т.п.

37. Эмульсия согласно абзацу 34 или 35, где минеральное масло содержит линейную или разветвленную углеродную цепь, содержащую более 15 атомов углерода, предпочтительно от 15 до 32, и не содержит ароматических соединений.

38. Эмульсия согласно абзацу 37, где масло позиционируется на рынке под названием MARCOL® 52, или MARCOL® 82 (Esso) или "DRAKEOL® 6VR" (Penreco).

39. Эмульсия согласно любому одному из абзацев 34-38, где масло представляет собой смесь масел, содержащую, по меньшей мере, два масла в любом соотношении.

40. Эмульсия согласно абзацу 39, где смесь масел содержит, по меньшей мере, одно растительное масло.

41. Эмульсия согласно абзацу 40, где растительное масло составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 33% масляной фазы, предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 15% об./об.

42. Эмульсия согласно абзацу 40 или 41, где растительное масло представляет собой арахисовое масло, ореховое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, соевое масло, масло энотеры и т.п.

43. Эмульсия, содержащая парафиновое масло, олеиловый спирт, этоксилированный 2-3 ЕО, в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества, олеиловый спирт, этоксилированный 10 ОЕ, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества, и блок-сополимер РОЕ-РОР с содержанием ЕО приблизительно 70-80% и ММ, составляющей приблизительно 9800-16000, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества.

44. Эмульсия согласно абзацу 43, где концентрация парафинового масла составляет от 5% до 50%, предпочтительно от 15% до 30% (об./об.); концентрация олеилового спирта, этоксилированного 2-3 ЕО, составляет от 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.); концентрация олеилового спирта, этоксилированного 10 ЕО, составляет от 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.); и концентрация блок-сополимера РОЕ-РОР с содержанием ЕО приблизительно 70-80% и ММ приблизительно 9800-16000 составляет от 0,01% до 2%, предпочтительно от 0,05% до 1,5% (мас./об.).

45. Эмульсия, содержащая парафиновое масло, олеиловый спирт, этоксилированный 2-3 ЕО, в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества, и олеиловый спирт, этоксилированный 10 ОЕ, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества и блок-сополимер РОЕ-РОР с содержанием ЕО приблизительно 70-80% и ММ приблизительно 9800-16000 в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества.

46. Эмульсия согласно абзацу 45, где концентрация парафинового масла составляет от 5% до 50%, предпочтительно от 15% до 30% (об./об.); концентрация олеилового спирта, этоксилированного 2-3 ЕО, составляет от 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.); концентрация олеилового спирта, этоксилированного 10 ЕО, составляет от 0,2% до 3%, предпочтительно от 0,5% до 3% (мас./об.); и концентрация блок-сополимера РОЕ-РОР с содержанием ЕО приблизительно 70-80% и ММ приблизительно 9800-16000 составляет от 0,01% до 2%, предпочтительно от 0,05% до 1,5% (мас./об.).

47. Эмульсия, содержащая парафиновое масло, олеиловый спирт, этоксилированный 2-3 ЕО, в качестве неионогенного липофильного поверхностно-активного вещества и олеиловый спирт, этоксилированный 5-6 ОЕ, в качестве неионогенного гидрофильного поверхностно-активного вещества.

48. Эмульсия согласно абзацу 47, где концентрация парафинового масла составляет от 5 до 50%, предпочтительно от 15 до 35% (об./об.), концентрация этоксилированного (2-3 ЕО) олеилового спирта составляет от 0,1 до 3%, предпочтительно от 0,5% до 2% (мас./об.) и концентрация этоксилированного (5-6 ЕО) олеилового спирта составляет от 1% до 5%, предпочтительно от 2,0% до 4,5% (мас./об.).

49. Способ приготовления композиции вакцины, включающий смешивание антигена или иммуногена, способного индуцировать иммунный ответ в хозяине с эмульсией согласно любому одному из абзацев 1-48.

50. Способ индуцирования иммунного ответа в хозяине, включающий введение хозяину эмульсии согласно любому одному из абзацев 1-48 или композиции вакцины согласно абзацу 49.

51. Набор для осуществления способа согласно абзацу 49 или 50, включающий эмульсию согласно любому одному из абзацев 1-48 или композицию вакцины согласно абзацу 49 и инструкции для осуществления способа.

Таким образом, подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, и понятно, что изобретение, определенное вышеуказанными абзацами, не ограничено конкретными деталями, изложенными в вышеупомянутом описании, поскольку множество очевидных их изменений можно осуществить не выходя за пределы существа и объема настоящего изобретения.

1. Иммуногенная композиция, представляющая собой эмульсию типа «масло-в-воде» (O/W), включающая:
(1) водный раствор, содержащий антиген или иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ у хозяина;
(2) неионогенный липофильный этоксилированный С9-С22 спирт жирного ряда, этоксилированный 1-4 ЕО;
(3) минеральное масло, содержащее линейную или разветвленную углеродную цепь, содержащую от 15 до 32 атомов углерода;
(4) неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество, представляющее собой этоксилированный С9-С22 спирт жирного ряда, этоксилированный 5-21 ЕО,
где суммарная концентрация поверхностно-активных веществ (по массе на объем эмульсии) составляет от 0,2 до 6,5%, концентрация масляной фазы, включающей масло(а) и поверхностно-активные вещества, составляет от 2 до 50% и температура инверсии фаз (PIT) составляет от 25 до 65°С.

2. Иммуногенная композиция по п.1, в которой этоксилированный спирт жирного ряда выбран из группы, состоящей из олеилового, цетилового, стеарилового, изостеарилового, лаурилового спирта и их комбинаций, предпочтительно представляет собой олеиловый спирт.

3. Иммуногенная композиция по п.1, в которой неионогенный липофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой Brij® 30, Brij® 92/93, Brij® 72, Brij® 52 (Uniqema), Volpo® L3, Volpo® N3, Volpo® L4 (Croda), BS-4, BD-2, BD-4, BT-3 (Nikko Chemicals) или любую их комбинацию.

4. Иммуногенная композиция по п.1, в которой неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой Brij® 76, Brij® 56, Brij® 96/97, Brij® 98, Brij® 721, Brij® 58, Brij® 35, Brij® 78 (Uniqema), Volpo® N5, Volpo® CS6, Volpo® CS12, Volpo® CS20, Volpo® CS25, Volpo® CS23 (Croda), BL9-EX, ВС-7, BT-5, BT-7, BT-9, BT- 12, BD-10, BO-7V, BC5,5, BT-5, BL-21, BL-25, BC-15TX, ВС-23, ВС-25ТХ, ВО-15V, BO-50V, BB-20, (Nikko Chemicals) или любую их комбинацию.

5. Иммуногенная композиция по п.1, в которой суммарная концентрация поверхностно-активных веществ (по массе на объем эмульсии) составляет от 1 до 6%, предпочтительно от 1,5 до 5%, более предпочтительно от 2 до 3%.

6. Иммуногенная композиция по п.1, в которой неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой олеиловый спирт, этоксилированный 5-14 ЕО.

7. Иммуногенная композиция по п.1, в которой неионогенный гидрофильный этоксилированный спирт жирного ряда представляет собой олеиловый спирт, этоксилированный 15-21 ЕО.

8. Иммуногенная композиция по п.1, в которой концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, содержащего 5-14 ЕО, составляет от 1,0 до 5,0%, предпочтительно от 1,5 до 4,5%, более предпочтительно от 2,0 до 3,5%.

9. Иммуногенная композиция по п.1, в которой концентрация неионогенного гидрофильного этоксилированного спирта жирного ряда, содержащего 15-21 ЕО, составляет от 0,01 до 3,0%, предпочтительно от 0,05 до 2,5%, более предпочтительно от 0,1 до 2,0% (масс/об).

10. Иммуногенная композиция по п.1, в которой концентрация неионогенного липофильного этоксилированного спирта жирного ряда составляет от 0,1 до 2,5%, предпочтительно от 0,2 до 2,0%, более предпочтительно от 0,2 до 1,5%, более предпочтительно от 0,2 до 1,2% (масс/об).

11. Иммуногенная композиция по п.1, имеющая температуру инверсии фаз (PIT) от 33 до 60°С.

12. Иммуногенная композиция по п.1, содержащая по объему на объем эмульсии (об/об) от 4 до 40% масляной фазы, включающей масло(а) и поверхностно-активные вещества, предпочтительно от 8 до 35%, более предпочтительно от 15 до 30%.

13. Иммуногенная композиция по п.1, в которой минеральное масло представляет собой парафиновое масло, предпочтительно изопарафиновое масло и/или нафтеновое масло, сквалан, сквален, пристан, полиизобутен, гидрированный полиизобутен, полидецен и полиизопрен.

14. Иммуногенная композиция по п.1, в которой минеральное масло представляет собой MARCOL® 52, MARCOL® 82 (Esso) или "DRAKEOL® 6VR" (Penreco).

15. Иммуногенная композиция по п.1, в которой масло представляет собой смесь масел, содержащую, по меньшей мере, два масла в любом соотношении.

16. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одно растительное масло.

17. Иммуногенная композиция по п.16, в которой растительное масло составляет от 0,1 до 33% масляной фазы, предпочтительно от 5 до 15% об/об.

18. Иммуногенная композиция по п.16 или 17, в которой растительное масло представляет собой арахисовое масло, ореховое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, соевое масло и масло энотеры.

19. Иммуногенная композиция по п.1, в которой антиген или иммуноген представляет собой Mycoplasma hyopneumoniae, свиной цирковирус 2 или Helicobacter pylori.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к модифицированным аденилатциклазным токсинам Bordetella, которые являются дефектными в отношении связывания CD11b/CD18, и к их применению в приготовлении фармацевтической композиции для лечения коклюша и/или для защиты против инфекции Bordetella.

Изобретение относится к соединению формулы (I): к его соли или гидрату, где R1 представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, или циклоалкильную группу, содержащую 3-6 атомов углерода; причем алкильная группа необязательно замещена атомом галогена; R 2 представляет атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; R3 представляет алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода или циклоалкильную группу, содержащую 3-6 атомов углерода; причем алкильная группа необязательно замещена атомом галогена; R4 и R5 независимо представляют атом водорода, атом галогена, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, алкоксигруппу, содержащую 1-6 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую 2-6 атомов углерода; причем алкильная группа необязательно замещена атомом галогена; и при условии, что R4 и R5 не являются одновременно атомами водорода; или заместители R4 и R5 вместе представляют (а) 3-6-членную циклическую структуру, включающую атом углерода, общий для R4 и R5, с образованием спироциклической структуры с пирролидиновым кольцом; или (b) экзометиленовую группу, связанную с пирролидиновым кольцом с помощью двойной связи; R6 и R7 независимо представляют атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода; R8 представляет галоген-замещенную алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, или циклоалкильную группу, содержащую 3-6 атомов углерода; причем циклоалкильная группа может быть замещена атомом галогена; R9 представляет атом водорода; X1 представляет атом водорода или атом галогена; и А представляет атом азота или фрагмент, представленный формулой (II): ,где X2 представляет атом водорода, алкильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода, или алкоксигруппу, содержащую 1-6 атомов углерода; или X2 вместе с R8 представляет циклическую структуру, содержащую часть ядра, причем образованное таким образом кольцо необязательно содержит атом кислорода и является замещенным алкильной группой, содержащей 1-6 атомов углерода.

Изобретение относится к новым соединениям - производным бензохинонов формулы (I): где каждый R1 и R2 представляет собой O-С(O)фенил; где фенил замещен 1 заместителем, выбранным из галоида, нитро, C1-С6алкила или С1-С6алкокси, и к их фармацевтически приемлемым солям.
Изобретение относится к области медицины и касается усовершенствований везикул внешней мембраны менингококков (ОМV), направленных против конкретных эпидемических штаммов, которые могут быть чрезвычайно эффективно использованы для борьбы с локальными вспышками заболевания.

Изобретение относится к оксазолидиноновым антимикробным производным соединениям, которые активны в отношении грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий при слабой активности ингибирования моноаминоксидазы (МАО).
Изобретение относится к фармакологическим средствам и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике. .
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, обладающего антихеликобактерным действием. .

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к новым производным гемина общей формулы (I), их фармацевтически приемлемым солям, способу получения, фармацевтическим и дезинфицирующим композициям.
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и касается лечения пневмонии у подростков. .
Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедической стоматологии. .

Изобретение относится к минеральным солям, таким как гидроксиды (например, гидроокиси), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. .

Изобретение относится к области микробиологии и касается бактеринов, имеющих сниженную липазную активность убитых бактерий Leptospira, способов получения таких бактеринов и вакцины, содержащей такой бактерин
Наверх