Глицерин-связанные пэгилированные сахара и гликопептиды

Изобретение относится к области медицины. Предложен пептидный конъюгат, содержащий гликозилированный пептид, который ковалентно связан с фрагментом полиэтиленгликоля (ПЭГ) через интактную гликозильную связывающую группу. Изобретение обеспечивает получение нового химического соединения, содержащего разветвленную молекулу ПЭГ, сиалильную связывающую группу и пептид с пониженной антигенностью. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No.60/828208, поданной 4 октября 2006, которая приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме для любой цели.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В иллюстративном варианте "гликоPEGилированные" молекулы по настоящему изобретению получают в результате опосредствованного ферментами образования конъюгата между гликозилированным или негликозилированным пептидом и ферментативно трансферабельным сахарильным фрагментом, который включает внутри своей структуры модифицирующую группу, такую как полимерная модифицирующая группа, такая как поли(этиленгликоль). Например, в одном из вариантов пептидом является представитель, выбранный из морфогенетических белков кости (например, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), нейротрофинов (например, NT-3, NT-4, NT-5), факторов роста и дифференциации (например, GDF-5), нейротрофического фактора, выделенного из линии глиальных клеток (GDNF), нейротрофического фактора, выделенного из головного мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), протеазы фактора фон Виллебранда (vWF), фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XI, фактора VIII с удаленным В-доменом, слитого белка vWF-фактор VIII с полноразмерным фактором VIII, слитого белка vWF-фактор VIII с удаленным B-доменом фактора VIII, эритропоэтина (EPO), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона альфа, интерферона бета, интерферона гамма, α₁-антитрипсина (ATT, или ингибитора α-1 протеазы), глюкоцереброзидазы, активатора плазминогена тканевого типа (TPA), интерлейкина-2 (IL-2), урокиназы, ДНКазы человека, инсулина, поверхностного белка гепатита B (HbsAg), гормона роста человека, слитого белка рецептора TNF - Fc-участка IgG (Enbrel™), моноклонального антитела против HER2 (Herceptin™), моноклонального антитела к белку F респираторного синцитиального вируса (Synagis™), моноклонального антитела против TNF-α (Remicade™), моноклонального антитела к гликопротеину IIb/IIIa (Reopro™), моноклонального антитела к CD20 (Rituxan™), анти-тромбина III (AT III), хорионического гонадотропина человека (hCG), альфа-галактозидазы (Fabrazyme™), альфа-идуронидазы (Aldurazyme™), фолликулостимулирующего гормона, бета-глюкозидазы, моноклонального антитела против TNF-альфа (MLB 5075), глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоно-подобного пептида-2 (GLP-2), бета-глюкозидазы, альфа-галактозидазы A и фактора роста фибробластов. Полимерная модифицирующая группа присоединена к сахарильному фрагменту (то есть через единственную группу, образованную в результате реакции двух реакционных групп) или через линкерный фрагмент, например замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, и т.д.

Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к конъюгату PEG фрагмента, например, PEG, и пептида, который обладает in vivo активностью, подобной или каким-либо другим образом аналогичной активности терапевтического пептида, разрешенного в настоящей области. В конъюгате по настоящему изобретению PEG фрагмент ковалентно связан с пептидом через интактную гликозильную связывающую группу. Примеры интактных гликозильных связывающих групп включают фрагменты сиаловой кислоты, которые являются PEG производными сиаловой кислоты.

Полимерная модифицирующая группа может быть присоединена в любом положении гликозильного фрагмента пептида. Более того, полимерная модифицирующая группа может быть связана с гликозильным остатком в любом положении аминокислотной последовательности дикого типа или мутантного пептида.

Например, в одном из вариантов настоящего изобретения предложен пептид, который конъюгирован через гликозильную связывающую группу с полимерной модифицирующей группой. Примеры пептидных конъюгатов включают гликозильную связывающую группу формулы, выбранной из:

и

В формулах I, Ia, II или IIa, R² представляет собой H, CH₂OR⁷, COOR⁷, COO^- или OR⁷, где R⁷ представляет собой H, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил. Символы R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R^6' независимо включают H, замещенный или незамещенный алкил, OR⁸, NHC(O)R⁹ и сахарильную группу. Индекс d равен 0 или 1. R⁸ и R⁹ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, сиаловой кислоты. По меньшей мере, один из R³, R⁴, R⁵, R⁶ или R^6' включает полимерную модифицирующую группу, например PEG. В одном из примеров варианта осуществления R⁶ и R^6' вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, являются компонентами боковой цепи сиалильного фрагмента. В следующем примере варианта осуществления указанная боковая цепь изменена с помощью полимерной модифицирующей группы.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа связана с гликозильной связывающей группой, обычно через гетероатом гликозильного ядра (например, N, O) через линкер L, как представлено далее:

R¹ представляет собой полимерную модифицирующую группу, и L выбран из связи и связывающей группы. Индекс w представляет собой целое число, выбранное из 1-6, предпочтительно 1-3 и более предпочтительно 1-2. Примеры связывающих групп включают замещенный или незамещенный алкил, замещенные или незамещенные гетероалкильные фрагменты и сиаловую кислоту. Примером компонента линкера является ацильный фрагмент. Другим примером связывающей группы является аминокислотный остаток (например, цистеин, серин, лизин и короткие олигопептиды, например, Lys-Lys, Lys-Lys-Lys, Cys-Lys, Ser-Lys и т.д.).

Если L представляет собой связь, то ее получают путем взаимодействия реакционноспособной функциональной группы предшественника R¹ и реакционноспособной функциональной группы с комплементарной реакционной способностью предшественника гликозильной связывающей группы. Если L представляет собой связывающую группу ненулевого порядка, то L можно ввести в гликозильный фрагмент перед реакцией с R¹ предшественником. Альтернативно, предшественники R¹ и L можно включить в предварительно сформированную кассету, которая соответствующим образом присоединена к гликозильному фрагменту. Как будет показано далее, выбор и получение предшественников с соответствующими реакционноспособными функциональными группами находится в области знаний специалистов в данной области. Более того, присоединение предшественников осуществляется химическими способами, которые хорошо известны специалистам в данной области.

В одном из вариантов осуществления L представляет собой связывающую группу, которая образована аминокислотой или небольшим пептидом (например, из 1-4 аминокислотных остатков), обеспечивая модифицикацию сахара, в котором полимерный модифицирующий фрагмент присоединен через замещенный алкильный линкер. Примеры линкеров включают глицин, лизин, серин и цистеин. Аминокислотные аналоги, как определено в настоящем описании, также могут использовать в качестве линкерных компонентов. Аминокислоту можно модифицировать дополнительным линкерным компонентом, например алкилом, гетероалкилом, ковалентно связанным через ацильную связь, например, амидом или уретаном, образованными за счет аминного фрагмента аминокислотного остатка.

В одном из примеров вариантов осуществления гликозильная связывающая группа имеет структуру, показанную формулами I или Ia, и R⁵ включает полимерную модифицирующую группу. В другом примере варианта осуществления R⁵ включает как полимерную модифицирующую группу, так и линкер L, присоединяющий полимерную модифицирующую группу к гликозильному ядру. L может иметь линейную или разветвленную структуру. Аналогично, полимерная модифицирующая группа может быть разветвленной или неразветвленной.

Полимерная модифицирующая группа содержит два или более повторяющихся звена, которые могут быть водорастворимыми или практически нерастворимыми в воде. Примеры водорастворимых полимеров, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, включают PEG, например m-PEG, PPG, например, m-PPG, полисиаловую кислоту, полиглутамат, полиаспартат, полилизин, полиэтиленимин, биоразлагаемые полимеры (например полилактид, полиглицерид) и функционализированный PEG, например терминально-функционализированный PEG.

Гликозильное ядро гликозильных связывающих групп, которые можно использовать в пептидных конъюгатах, выбирают как из природных, так и неприродных фураноз и пираноз. Сахариды неприродного происхождения необязательно включают алкилированный или ацилированный гидроксильный и/или аминный фрагмент, например эфирные, сложноэфирные и амидные заместители кольца. Другие сахариды неприродного происхождения включают H, гидроксильный, эфирный, сложноэфирный или амидный заместитель в таком положении кольца, в котором такой заместитель отсутствует в природных сахаридах. Альтернативно, у углевода отсутствует заместитель, который должен был бы присутствовать у углевода при его названия, например, дезоксисахара. Следующие примеры неприродных сахаров включают как окисленные (например, -оновые и -уроновые кислоты), так и восстановленные (сахарные спирты) углеводы. Сахарный фрагмент может быть моно-, олиго- или полисахаридом.

Примеры природных сахаров, которые можно использовать в качестве компонентов гликозильных связывающих групп в соединениях по настоящему изобретению, включают глюкозу, глюкозамин, галактозу, галактозамин, фукозу, маннозу, маннозамин, ксиланозу, рибозу, N-ацетилглюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозу, N-ацетилгалактозамин и сиаловую кислоту.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему группу:

где D представляет собой член, выбранный из -OH и R¹-L-HN-; G представляет собой член, выбранный из H и R¹-L- и -C(O)(C₁-С₆)алкила; R¹ представляет собой фрагмент, содержащий неразветвленный или разветвленный поли(этиленгликолевый) остаток; и L представляет собой линкер, например, связь ("нулевого порядка"), замещенный или незамещенный алкил и замещенный или незамещенный гетероалкил. В иллюстративных вариантах, если D представляет собой OH, то G представляет собой R¹-L-, и если G представляет собой -C(O)(C₁-C₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NH-.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему гликозильную связывающую группу, где гликозильная связывающая группа присоединена к аминокислотному остатку указанного пептида, и где указанная гликозильная связывающая группа содержит сиалильную связывающую группу, с формулой, где группа выбрана из:

и

где

представляют собой модифицирующие группы. R² представляет собой член, выбранный из H, CH₂OR⁷, COOR⁷, COO^- и OR⁷. R⁷ представляет собой член, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. R³ и R⁴ представляют собой члены, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, OR⁸ и NHC(O)R⁹. R⁸ и R⁹ независимо выбран из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и сиалила. L^a представляет собой линкер, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. X⁵, R¹⁶ и R¹⁷ независимо выбран из нереакционноспособной группы и полимерных фрагментов (например, поли(алкиленоксид), например, PEG). Нереакционноспособные группы включают группы, которые рассматривают как практически нереакционноспособные, нейтральные и/или стабильные при физиологических значениях pH, например, H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и тому подобные. Примеры полимерного фрагмента включают разветвленные структуры, представленные формулами IIIa, и их примеры, описанные ниже. Специалистам должно быть понятно, что PEG фрагмент в указанных формулах может быть заменен другими полимерами. Примеры полимеров включают полимеры, относящиеся к семейству поли(алкиленоксидов). X² и X⁴ независимо представляют выбранные фрагменты связи, соединяющие полимерные фрагменты R¹⁶ и R¹⁷ с C. Индекс j представляет собой целое число, выбранное из 1-15.

В другом примере варианта осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

в которой индексы m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-5000. A¹, A², A³, A⁴, A⁵, A⁶, A⁷, A⁸, A⁹, A¹⁰ и A¹¹ представляют собой члены, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, -NA¹²A¹³, -OA¹² и -SiA¹²A¹³. A¹² и A¹³ представляют собой члены, независимо выбранные из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила.

В одном из примеров вариантов осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру, включающую фрагмент, соответствующий следующим формулам:

и

В другом примере варианта осуществления в соответствии с представленными выше формулами полимерная модифицирующая группа имеет структуру, соответствующую следующей формуле:

В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 5000, предпочтительно от около 100 до около 4000, более предпочтительно от около 200 до около 3000, еще более предпочтительно от около 300 до около 2000 и еще более предпочтительно от около 400 до около 1000. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 70, от около 70 до около 150, от около 150 до около 250, от около 250 до около 375 и от около 375 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 10 до около 35, от около 45 до около 65, от около 95 до около 130, от около 210 до около 240, от около 310 до около 370 и около 420 до около 480. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 15 до около 30. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 50 до около 65. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 100 до около 130. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 210 до около 240. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 310 до около 370. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 430 до около 470. В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый представляет собой член, выбранный из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают фрагмент:

и

Настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему гликозильную связывающую группу, где гликозильная связывающая группа присоединена к аминокислотному остатку пептида и где гликозильная связывающая группа включает сиалильную связывающую группу формулы:

где

представляет собой модифицирующую группу. Индекс s представляет собой целое число, выбранное из 1-20. Индекс f представляет собой целое число, выбранное из 1-2500. Q представляет собой член, выбранный из H и замещенного или незамещенного C₁-С₆ алкила.

В одном из примеров варианта осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному сахару следующей формулы:

где R¹ представляет собой полимерный фрагмент; L выбран из связи и связывающей группы; R² представляет собой член, выбранный из H, CH₂OR⁷, COOR⁷ и OR⁷; R⁷ представляет собой член, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила; R³ и R⁴ представляют собой члены, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, OR⁸ и NHC(O)R⁹; и R⁸ и R⁹ независимо выбирают из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, сиаловой кислоты и полисиаловой кислоты. Индекс w представляет собой целое число, выбранное из 1-6, предпочтительно из 1-3 и более предпочтительно из 1-2. Примеры связывающих групп включают замещенный или незамещенный алкил, замещенные или незамещенные гетероалкильные фрагменты и сиаловую кислоту. Примером линкерного компонента является ацильный фрагмент.

Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов пептидов. Указанные способы включают приведение в контакт пептида с модифицированным донором сахара, который содержит модифицирующую группу, ковалентно связанную с сахаром. Модифицированный сахарный фрагмент переносится с донора на аминокислотный или гликозильный остаток пептида под действием фермента. Примеры ферментов включают, но ими не ограничиваются, гликозилтрансферазы, например сиалилтрансферазы. Указанный способ включает приведение в контакт пептида с: a) модифицированным донором сахара и b) ферментом, способным переносить модифицированный сахарный фрагмент от модифицированного донора сахара на аминокислотный или гликозильный остаток пептида, в условиях, позволяющих осуществить перенос модифицированного сахарного фрагмента от донора на аминокислотный или гликозильный остаток пептида, тем самым обеспечивая синтез указанного пептидного конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления перед осуществлением стадии a) пептид приводят в контакт с сиалидазой, тем самым удаляя, по меньшей мере, часть сиаловой кислоты пептида.

В другом предпочтительном варианте пептид приводят в контакт с сиалидазой, гликозилтрансферазой и модифицированным донором сахара. В указанном варианте пептид приводят в контакт с сиалидазой, гликозилтрансферазой и модифицированным донором сахара практически одновременно, вне зависимости от порядка добавления различных компонентов. Реакцию ведут в условиях, подходящих для удаления остатков сиаловой кислоты из пептида за счет сиалидазы и для переноса за счет гликозилтрансферазы модифицированного сахарного фрагмента с модифицированного донора сахара на аминокислотный или гликозильный остаток пептида.

В другом предпочтительном варианте осуществления процессы десиалилирования и конъюгирования осуществляют в одном реакторе и десиалилированный пептид предпочтительно не очищают перед стадией конъюгирования. В другом примере варианта осуществления указанный способ включает далее стадию 'кэппинга', включающую сиалилирование пептидного конъюгата. Указанную стадию осуществляют в том же реакторе, который содержит сиалидазу, сиалилтрансферазу и модифицированный донор сахара без предварительной очистки.

В другом предпочтительном варианте осуществления проводят десиалилирование пептида и асиалопептид очищают. Затем создают условия для реакции конъюгирования очищенного асиалопептида. В другом примере варианта осуществления указанный способ включает дополнительную стадию 'кэппинга', которая включает сиалилирование пептидного конъюгата. Указанную стадию осуществляют в том же реакторе, который содержит сиалидазу, сиалилтрансферазу и модифицированный донор сахара без предварительной очистки.

В другом примере варианта осуществления стадию кэппинга, сиалилирования пептидного конъюгата, осуществляют в том же реакторе, который содержит сиалидазу, сиалилтрансферазу и модифицированный донор сахара без предварительной очистки.

В одном из примеров варианта осуществления контактирование происходит в течение менее 20 часов, предпочтительно менее 16 часов, более предпочтительно менее 12 часов, еще более предпочтительно менее 8 часов и еще более предпочтительно менее 4 часов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к реакционной смеси пептидного конъюгата. Указанная реакционная смесь включает: a) сиалидазу; b) фермент, который является членом, выбранным из гликозилтрансферазы, экзогликозидазы и эндогликозидазы; c) модифицированный сахар и d)пептид.

В другом из примеров варианта осуществления отношение сиалидазы к пептиду выбрано из 0,1 ед./л : 2 мг/мл до 10 ед./л : 1 мг/мл, предпочтительно 0,5 ед./л : 2 мг/мл, более предпочтительно 1,0 ед./л : 2 мг/мл, еще более предпочтительно 10 ед./л : 2 мг/мл, еще более предпочтительно 0,1 ед./л : 1 мг/мл и наиболее предпочтительно 0,5 ед./л : 1 мг/мл, еще более предпочтительно 1,0 ед./л : 1 мг/мл и еще более предпочтительно 10 ед./л : 1 мг/мл.

В одном из примеров варианта осуществления, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% указанного пептидного конъюгата включает, по меньшей мере, два PEG фрагмента. Указанные PEG фрагменты можно добавлять в общий реактор, или их можно добавлять после очистки асиалопептида.

В другом примере варианта осуществления, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% пептидного конъюгата включает, по меньшей мере, один PEG фрагмент. Указанный PEG фрагмент можно добавлять в общий реактор, или его можно добавлять после очистки асиалопептида.

В следующем примере варианта осуществления указанный способ дополнительно включает "кэппинг", или добавление сиаловой кислоты к пептидному конъюгату. В другом примере варианта осуществления добавляют сиалидазу, затем с задержкой в 30 минут, 1 час, 1,5 часа или 2 часа, следует добавление гликозилтрансферазы, экзогликозидазы или эндогликозидазы.

В другом примере варианта осуществления добавляют сиалидазу, затем с задержкой в 30 минут, 1 час, 1,5 часа или 2 часа следует добавление гликозилтрансферазы, экзогликозидазы или эндогликозидазы. Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области из приводимого далее подробного описания.

В другом примере варианта осуществления указанный способ включает: (a) приведение в контакт пептида, включающего гликозильную группу, выбранную из:

и

где а представляет собой целое число от 0 до 10, с модифицированным сахаром формулы:

в контакт с соответствующей трансферазой, которая переносит гликозильную связывающую группу на член, выбранный из GalNAc, Gal и Sia указанной гликозильной группы, в условиях, подходящих для указанного переноса. Примером модифицированного сахара является CMP-сиаловая кислота, модифицированная через линкерный фрагмент полимером, например неразветвленным или разветвленным поли(этиленгликолевым) фрагментом. Радикалы в вышеприведенной формуле практически такие же, что и те, которые приведены в идентичных формулах выше.

Пептид можно получить из практически любого источника, однако в одном из вариантов, перед описанной выше модификацией, пептид экспрессируют в подходящем хозяине. Млекопитающие (например, ВНК, СНО), бактерии (например, Е. coli) и клетки насекомых (например, Sf-9) являются примерами экспрессионных систем, обеспечивающих получение пептида, используемого в представленных далее композициях и способах по настоящему изобретению.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области из приводимого далее подробного описания.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

ФИГ. 1 иллюстрирует получение конъюгата СМР-сиаловая кислота-глицерин PEG 40 кДа.

ФИГ. 2 иллюстрирует условия реакции для получения конъюгата СМР-сиаловая кислота-глицерин PEG 40 кДа.

ФИГ. 3 иллюстрирует процесс очистки конъюгата СМР-сиаловая кислота-глицерин PEG 40 кДа, который является эффективным, крупномасштабным и дает продукт высокой степени числоты (>90%).

ФИГ. 4 иллюстрирует процесс очистки, включающий Q-сефарозу для конъюгата СМР-сиаловая кислота-глицерин PEG 40 кДа. Параметры процесса включают:

Крупные бусы Q-сефарозы (6 л, 18×23 см)

Бикарбонатная форма смолы

Подвижная фаза А: вода

Подвижная фаза В: 1,0 н NaCl

УФ: 274 нм

Загрузка: примерно 15 г СМР-3А-глицерин-РЕG-40 кДа

Смесь (30 г) после ТГФ (проводимость: 0,53 мС)

Скорость загрузки: 60 мл/мин

Элюирование:

1,67 CV подвиржная фаза А

2 CV градиент с 10%-80% подвижной фазой В при 125 мл/мин.

Объем элюента обессоливают, используя TFF

Millipore 1 кДа Pellicon 2 "MINI"

(2 × PLAC 1 кДа регинерированная целлюлозная мембрана; Screen Tyoe V; 0,1 м²)

Обессоленный продукт сушат вымораживанием

ФИГ. 5 представляет собой ¹Н ЯМР спектр конъюгата СМР-сиаловая кислота-глицерин PEG 40 кДа.

ФИГ. 6 представляет собой таблицу примеров сиалилтрансфераз, которые используют при получении гликоконъюгатов по настоящему изобретению, например для гликоРЕGилирования пептидов модифицированной сиаловой кислотой.

ФИГ. 7 представляет собой таблицу пептидов, к которым одна или более из гликозильных связывающих групп может быть присоединена с целью получения пептидных конъюгатов по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Аббревиатуры

PEG, поли(этиленгликоль); PPG, поли(пропиленгликоль); Ara, арабинозил; Fru, фруктозил; Fuc, фукозил; Gal, галактозил; GalNAc, N-ацетилгалактозаминил; Glc, глюкозил; GlcNAc, N-ацетилглюкозаминил; Man, маннозил; ManAc, маннозаминилацетат; Xyl, ксилозил; NeuAc, сиалил или N-ацетилнейраминил; Sia, сиалил или N-ацетилнейраминил; и их производные и аналоги.

Определения

Если нет других указаний, все использованные в настоящем описании технические и научные термины обычно имеют те же самые значения, которые хорошо известны специалистам в данной области настоящего изобретения. Обычно, используемая в настоящем описании номенклатура и используемые лабораторные процедуры в области клеточных культур, молекулярной генетики, органической химии и химии и гибридизации нуклеиновых кислот такие же, как хорошо известные и обычно используемые в указанных областях. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов используют стандартные методики. Стандартные методики и процедуры обычно осуществляют в соответствии с общепринятыми способами в данной области и в соответствии с различными общими ссылками (см. Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., приведенный в качестве ссылки), которые представлены в настоящем документе. Используемая номенклатура и лабораторные процедуры аналитической химии и органического синтеза, описываемые далее, хорошо известны и обычно используются в указанной области. Для химического синтеза и химического анализа используют стандартные методики или их модификации.

Все описываемые в настоящем описании олигосахариды описаны с использованием названий или сокращений для невосстанавливающего сахарида (т.е. Gal), далее по конфигурации гликозидной связи (α или β), кольцевой связи (1 или 2), положению в кольце восстанавливающего сахарида, вовлеченного в связь (2, 3, 4, 6 или 8), и затем название или сокращение восстанавливающего сахарида (т.е. GlcNAc). Каждый сахарид является предпочтительно пиранозой. Для обзора стандартной номенклатуры в области гликобиологии см. Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999).

Известно, что олигосахариды содержат восстанавливающий конец и невосстанавливающий конец, независимо от того, является ли указанный сахарид на восстанавливающем конце действительно восстанавливающим сахаром. В соответствии с принятой номенклатурой олигосахариды изображают в настоящем описании с невосстанавливающим концом слева и восстанавливающим концом справа.

Термин "сиаловая кислота" или "сиалил" относится к любому члену семейства карбоксилированных сахаров, содержащих девять атомов углерода. Обычным членом семейства сиаловых кислот является N-ацетилнейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулопираноз-1-оновая кислота (часто используется как аббревиатура Neu5Ac, NeuAc, или NANA). Вторым членом указанного семейства является N-гликолил-нейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа NeuAc является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-деоксинонулосоновая кислота (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Включены также 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-C₁-C₆ ацил-Neu5Ac, подобные 9-О-лактил-Neu5Ac или 9-О-ацетил-Neu5Ac, 9-деокси-9-фтор-Neu5Ac и 9-азидо-9-деокси-Neu5Ac. Обзор семейства сиаловых кислот представлен, например, в Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). Синтез и использование соединений сиаловых кислот в процедуре сиалилирования раскрыты в международной патентной заявке WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992.

Термин "пептид" относится к полимеру, в котором мономерами являются аминокислоты и они соединены вместе за счет амидных связей; альтернативно указанный термин относится к полипептиду. Кроме того, к термину также относятся неприродные аминокислоты, например β-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. В рамках настоящего изобретения можно также использовать аминокислоты, которые не являются геннокодируемыми. Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать аминокислоты, которые в результате модификации включают реакционноспособные группы, сайты гликозилирования, полимеры, терапевтические фрагменты, биологические молекулы и т.п. Все использованные в настоящем изобретении аминокислоты могут быть либо D-, либо L-изомерами. L-изомер, как правило, является предпочтительным. Кроме того, в настоящем изобретении используют также другие пептидомиметики. Как используется в настоящем описании, термин "пептид" относится как к гликозилированным, так и негликозилированным пептидам. Термин также включает пептиды, которые экспрессируют пептид, гликозилированый системой не полностью. Для общего обзора см. Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of amino acids, peptides and proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). Список некоторых пептидов по настоящему изобретению приведен на фиг.7.

Термин "пептидный конъюгат" относится к соединениям по настоящему изобретению, в которых пептид конъюгирован с модифицированным сахаром, как будет показано далее.

Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и имитирующим аминокислоты соединениям, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты являются аминокислотами, которые кодируются за счет генетического кода, также аминокислотами, которые были модифицированы позднее, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Термин аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют ту же химическую структуру, что и природные аминокислоты, то есть α углерод связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные R группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют химическую структуру природных аминокислот. Имитирующие аминокислоты соединения относятся к химическим соединениям, которые обладают структурой, которая отличается от обычной структуры аминокислот, но функция которых аналогична функции природных аминокислот.

Как используется в настоящем описании, термин "модифицированный сахар" или "модифицированный сахарный остаток" относится природному или неприродному углеводу, который ферментативно связан с аминокислотным или гликозильным остатком пептида в способе по настоящему изобретению. Модифицированный сахар выбран из ферментных субстратов, включая, но ими не ограничиваясь, нуклеотиды сахаров (моно-, ди- и три-фосфаты), активированные сахара (например, гликозилгалогениды, гликозилмезилаты) и сахара, которые не являются ни активированным сахарами, ни нуклеотидами. "Модифицированный сахар" представляет собой сахар, ковалентно связанный с функциональной "модифицирующей группой". Подходящие модифицирующие группы включают, но ими не ограничиваются, PEG фрагменты, терапевтические фрагменты, диагностические фрагменты, биомолекулы и т.п. Модифицирующая группа предпочтительно не представляет собой неприродный или не модифицированный углевод. Местоположение функционализирования модифицирующей группой выбирают таким образом, чтобы ее наличие не мешало ферментативному присоединению "модифицированного сахара" к пептиду.

Как используется в настоящем описании, термин "полимерный фрагмент" относится к водорастворимому или к нерастворимому в воде полимеру. Термин "водорастворимый" относится к фрагментам, которые обладают некоторой детектируемой степенью растворимости в воде. Способы качественного и/или количественного определения растворимости в воде хорошо известны специалистам в данной области. Примеры водорастворимых полимеров включают пептиды, сахариды, поли(эфиры), поли(амины), поли(карбоновые кислоты) и т.п. Пептиды могут содержать смешанные последовательности, состоящие из одной аминокислоты, например, поли(лизин). Примером полисахарида является поли(сиаловая кислота). Примером поли(простого эфира) является поли(этиленгликоль). Поли(этиленимин) служит примером полиамина, и поли(акриловая) кислота является представительным примером поли(карбоновой кислоты). Предпочтительные водорастворимые полимеры являются практически не флуоресцентными, или их флуоресценция столь мала, что они не пригодны для использования в качестве флуоресцентного маркера в анализах. Можно использовать полимеры, которые не являются природными сахарами. Кроме того, можно использовать другие природные сахара, которые модифицированы за счет ковалентного присоединения других объектов (например, поли(этиленгликоля), поли(пропиленгликоля), поли(аспартата), биомолекул, терапевтических фрагментов, диагностических фрагментов и т.д.). Термин водорастворимый полимер включает также такие виды, как сахариды (например, декстран, амилоза, гиалуроновая кислота, поли(сиаловая кислота), гепараны, гепарины и т.д.); поли(аминокислоты), например, поли(глутаминовая кислота); нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры (например, поли(акриловая кислота), поли(простые эфиры), например, поли(этиленгликоль); пептиды, белки и т.п. Примеры нерастворимых в воде полимеров включают, но ими не ограничиваются, полифосфазины, поли(виниловые спирты), полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинилгалогениды, поливинилпирролидон, полигликолиды, полисилоксаны, полиуретаны, поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат), поли(октадецилакрилат), полиэтилен, полипропилен, поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид), поли(этилентерефталат), поли(винилацетат), поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон, плуроник(и) и поливинилфенолы и их сополимеры. Кроме того, возможно также использование других природных сахаров, которые модифицированы за счет ковалентного присоединения других фрагментов (например, поли(этиленгликоля), поли(пропиленгликоля), поли(аспартата), биомолекул, терапевтического фрагмента, диагностического фрагмента и т.д.). Дополнительные примеры водорастворимых и нерастворяющихся в воде полимеров раскрыты в рассматриваемой заявке.

Полимерный скелет водорастворимого полимера может быть поли(этиленгликолем) (т.е. PEG). Однако следует понимать, что другие родственные полимеры также пригодны для использования в практике настоящего изобретения и что использование термина PEG или поли(этиленгликоль) является включающим, а не исключающим в этом отношении. Термин PEG включает поли(этиленгликоль) в любой из его форм, включая алкокси PEG, бифункциональные PEG, PEG с многочисленными разветвлениями, вилкообразные PEG, разветвленные PEG, PEG с подвесками (т.е. PEG или родственные полимеры, содержащие одну или более из функциональных групп, подвешенных к полимерному скелету), или PEG, содержащие разлагаемые связи.

Такой полимер может быть линейным или разветвленным. Разветвленные полимеры обычно известны специалистам. Обычно разветвленный полимер содержит фрагмент центрального скелета и множество линейных или разветвленных полимерных цепочек, связанных с центральным скелетом. PEG обычно используют в разветвленных формах, которые можно получить за счет добавления этиленоксида к различным полиолям, таким как глицерин, пентаэритритол и сорбит. Фрагмент центрального скелета можно также получить из нескольких аминокислот, таких как лизин. Разветвленный поли(этиленгликоль) может быть представлен в общем виде как R(-PEG-OH)_m, где R представляет собой фрагмент скелета, такой как глицерин или пентаэритритол, и m представляет собой количество ответвлений. PEG молекулы с многочисленными ответвлениями, такие как те, что раскрыты в патенте США No. 5932462, содержание которого включено сюда для ссылки во всей своей полноте, также можно использовать в качестве полимерного скелета. В одном из примеров варианта осуществления разветвленный полимер сам присоединен к разветвленному фрагменту (например, цистеин, серин, лизин и олигомеры лизина).

В настоящем изобретении можно также использовать многие другие полимеры. Для целей настоящего изобретения особенно пригодны полимерные скелеты, которые являются непептидными и водорастворимыми и содержат от около 2 до около 300 сайтов для присоединения. Примеры подходящих полимеров включают, но ими не ограничиваются, другие поли(алкиленгликоли), такие как поли(пропиленгликоль) ("PPG"), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксипропилметакриламид), поли(α-гидроксикислота), поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли(N-акрилоилморфолин), такие как раскрыты в патенте США No. 5629384, содержание которого включено сюда для ссылки во всей своей полноте, и сополимеры, терполимеры и их смеси. Хотя молекулярный вес каждой из цепочек полимерного скелета может меняться, обычно он находится в интервале от около 100 Да до около 100000 Да, часто от около 6000 Да до около 80000 Да.

Термин "площадь под кривой" или "AUC" как используется в настоящем описании в контексте, относящемся к введению пептидного лекарственного средства пациенту, определяют как полную площадь под кривой, которая описывает концентрацию лекарственного препарата в системной циркуляции пациента как функцию времени с момента ноль до бесконечности.

Термин "период полувыведения" или "t1/2", как используется в настоящем описании в контексте, относящемся к введению пептидного лекарственного средства пациенту, определяют как время, необходимое для того, чтобы концентрация лекарственного средства в плазме пациента уменьшилась до половины. Может существовать более одного периода полувыведения, связанного с пептидным лекарственным средством, в зависимости от многочисленных механизмов клиренса, перераспределения и других механизмов, хорошо известных специалистам. Обычно альфа и бета периоды полувыведения определяют таким образом, что альфа фаза связана с перераспределением, и бета фаза связана клиренсом. Однако в отношении белковых лекарственных средств, которые, по большей части, связаны с кровообращением, могут существовать, по меньшей мере, два клиренсовых периода полувыведения. Для некоторых гликозилированных пептидов быстрая бета фаза клиренса может быть опосредствована рецепторами на макрофагах или эндотелиальными клетками, которые распознают концевые галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, маннозу или фукозу. Медленная бета фаза клиренса может происходить за счет почечной гломерулярной фильтрации для молекул с эффективным радиусом < 2 нм (приблизительно 68 кДа) и/или за счет специфического или не специфического захвата и метаболизма в тканях. ГликоPEGилирование может создавать кэпы на конечных сахарах (например, галактозе или N-ацетилгалактозамине) и, тем самым, блокировать альфа фазу клиренса за счет рецепторов, которые распознают указанные сахара. Это может также приводить к созданию эффективного радиуса большего размера и, тем самым, уменьшить объем распределения и захвата тканями, пролонгируя таким образом позднюю бета фазу. Таким образом, точное влияние гликоPEGилирования на альфа фазу и бета фазу периода полувыведения может меняться в зависимости от размера, состояния гликозилирования и других параметров, которые хорошо известны специалистам. Другие разъяснения по поводу термина "период полувыведения" можно найти в Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120).

Термин "гликоконъюгирование", как используется в настоящем описании, относится ферментативно опосредствованному конъюгированию модифицированных сахаров с аминокислотами или гликозильными остатками полипептидов, например с G-CSF пептидом по настоящему изобретению. Подродом "гликоконъюгирования" является "гликоPEGилирование," при котором модифицирующей группой модифицированного сахара является поли(этиленгликоль), и алкилпроизводное (например, m-PEG) или его реакционноспособное производное (например, H₂N-PEG, HOOC-PEG).

Термины "в крупном масштабе" и "в промышленном масштабе" используют взаимозаменяемо, и они относятся к реакционному циклу, в результате которого получают, по меньшей мере, около 250 мг, предпочтительно, по меньшей мере, около 500 мг и более предпочтительно, по меньшей мере, около 1 г гликоконъюгата по завершению одного цикла реакции.

Термин "гликозильная связывающая группа", как используется в настоящем описании, относится к гликозильным остаткам, к которым ковалентно присоединена модифицирующая группа (например, PEG фрагмент, терапевтический фрагмент, биомолекула); гликозильная связывающая группа соединяет модифицирующую группу с остальной частью конъюгата. В способах настоящего изобретения "гликозильная связывающая группа" становится ковалентно связанной с гликозилированным или негликозилированным пептидом, тем самым, связывая указанный агент с аминокислотой и/или гликозильным остатком пептида. "Гликозильную связывающую группу" обычно получают из "модифицированного сахара" в результате ферментативного присоединения "модифицированного сахара" к аминокислотному и/или гликозильному остатку пептида. Гликозильная связывающая группа может быть полученной из сахарида структурой, которая разлагается в процессе образования кассеты модифицирующая группа-модифицированный сахар (например, окисление -> образование шиффового основания -> восстановление), или гликозильная связывающая группа может остаться интактной. Термин "интактная гликозильная связывающая группа" относится к связывающей группе, которую получают из гликозильного фрагмента, в котором сахаридный мономер, который связывает модифицирующую группу с остальной частью конъюгата, не разрушен, например, окислением, например, под действием метапериодата натрия. "Интактные гликозильные связывающие группы" настоящего изобретения можно получить из природных олигосахаридов за счет добавления гликозильного звена (звеньев) или за счет удаления одного или более из гликозильных звеньев из исходной структуры сахарида.

Термин "негликозидная модифицирующая группа", как используется в настоящем описании, относится к модифицирующей группе, которая не включает природного сахара, связанного непосредственно с гликозильной связывающей группой.

Термин "направляющий фрагмент", как используется в настоящем описании, относится к образцам, которые будут селективно локализованы в конкретной ткани или в участке организма. Указанная локализация опосредствуется за счет специфического распознавания молекулярных детерминант, размера молекул направляющего агента или конъюгата, ионных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий и т.п. Другие механизмы направления агента в конкретную ткань или в участок организма хорошо известны специалистам. Примеры направляющих фрагментов включают антитела, фрагменты антител, трансферрин, HS-гликопротеин, факторы коагуляции, сывороточные белки, β-гликопротеины, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO и т.п.

Как используется в настоящем описании, термин "терапевтический фрагмент" означает любой агент, который можно использовать для лечения, включая, но ими не ограничиваясь, антибиотики, противовоспалительные агенты, противоопухолевые лекарственные средства, цитотоксины и радиоактивные агенты. "Терапевтические фрагменты" включают пролекарственные формы биоактивных агентов, конструкции, в которых более чем один терапевтический фрагмент связан с носителем, например поливалентные агенты. Терапевтические фрагменты также включают белки и конструкции, которые включают белки. Примеры белков включают, но ими не ограничиваются, гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (GCSF), гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GMCSF), интерферон (например, интерферон-α, -β, -γ), интерлейкин (например, интерлейкин II), сывороточные белки (например, факторы VII, VIIa, VIII, IX и X), хорионический гонадотропин человека (HCG), фолликулостимулирующий гормон (FSH) и лютеинизирующий гормон (LH) и слитые белки антител (например, рецептор фактора некроза опухоли ((TNFR)/Fc домен слитого белка)).

Как используется в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый носитель", включает любой материал, который, будучи объединен с конъюгатом, сохраняет активность конъюгата и не реагирует с иммунными системами субъектов. Примеры включают, но ими не ограничиваются, любые из стандартных фармацевтических носителей, таких как буферированный фосфатом солевой раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия типа масло-в-воде, и различные типы смачивающих агентов. Другие носители могут также включать стерильные растворы, таблетки, включая таблетки в оболочке и капсулы. Обычно такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые типы глины, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, смолы, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки или красители или другие ингредиенты. Композиции, включающие такие носители, приготавливают обычными, хорошо известными способами.

Как используется в настоящем описании, термин "введение" означает пероральное введение, введение в виде суппозитория, введение при кожном контакте, внутривенное введение, интраперитонеальное введение, внутримышечное введение, введение в область поражения или подкожное введение, интраназальное введение или имплантацию субъекту устройства с замедленным высвобождением, например, с помощью мини осмотической помпы. Введение может осуществляться любым способом, включая парэнтеральное и через слизистую (например, перорально, назально, вагинально, ректально или трансдермально). Парэнтеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, чрезкожное, подкожное, внутрибрюшинное, интравентрикулярное и интракраниальное введение. Кроме того, в тех случаях, когда инъекция предназначена для лечения опухоли, например, чтобы вызвать апоптоз, введение можно осуществить непосредственно в опухоль и/или в ткани, окружающие опухоль. Другие способы доставки включают, но ими не ограничиваются, использование липосомальных композиций, внутривенных вливаний, трансдермальных пластырей и т.д.

Термины "облегчение" или "облегчать" относятся к любому признаку успеха лечения патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как уменьшение, ремиссия или ослабление симптомов или улучшение физического или ментального здоровья пациента. Ослабление симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физических исследований и/или психиатрических оценок.

Термин "терапия" относится к "лечению" заболевания или состояния, включая профилактику заболевания или состояния, наблюдающегося у животного, которое может быть предрасположено к заболеванию, но оно еще не проявилось или отсутствуют симптомы заболевания (профилактическое лечение), к ингибированию заболевания (замедлению или остановке его развития), обеспечивающую избавление от симптомов или побочных эффектов заболевания (включая паллиативное лечение) и выздоровление от заболевания (приводя к регрессии заболевания).

Термин "эффективное количество" или "количество, эффективное для" или "терапевтически эффективное количество" или любой грамматический эквивалент термина означает количество, которое, будучи введено животному для лечения заболевания, оказывается достаточным для лечения указанного заболевания.

Термин "выделенный" относится к материалу, который практически или в основном не содержит компонентов, которые используют для получения указанного материала. Для пептидных конъюгатов по настоящему изобретению термин "выделенный" относится к материалу, который существенно или практически не содержит компоненты, которые обычно сопровождают указанный материал в смеси, которую используют для получения пептидного конъюгата. Термины "выделенный" и "чистый" используют взаимозаменяемо. Обычно выделенные пептидные конъюгаты по настоящему изобретению имеют степень чистоты, предпочтительно выраженную как интервал значений. Нижнее значение интервала значений степени чистоты для пептидных конъюгатов составляет около 60%, около 70% или около 80% и верхнее значение интервала значений степени чистоты составляет около 70%, около 80%, около 90%, или более чем около 90%.

Если степень чистоты пептидных конъюгатов составляет более чем около 90%, их степени чистоты также предпочтительно выражают как интервал значений. Нижнее значение интервала значений степени чистоты составляет около 90%, около 92%, около 94%, около 96% или около 98%. Верхнее значение интервала значений степени чистоты составляет около 92%, около 94%, около 96%, около 98% или около 100%.

Степень чистоты определяют любым известным специалистам способом анализа (например, по интенсивности полос при электрофорезе на окрашенном серебром геле, на полиакриламидном геле, ВЭЖХ или аналогичными способами).

Выражение "практически каждый член популяции", как используется в настоящем описании, описывает характеристику популяции пептидных конъюгатов по настоящему изобретению, в которой выбранный процент модифицированных сахаров, добавленных к пептиду, добавляют для умножения идентичных акцепторных сайтов пептида. Выражение "практически каждый член популяции" говорит о "гомогенности" сайтов пептида, конъюгированного с модифицированным сахаром, и относится к конъюгатам по настоящему изобретению, которые гомогенны, по меньшей мере, на около 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на около 90% и более предпочтительно, по меньшей мере, на около 95%.

Термин "гомогенность" относится к структурному постоянству по всей популяции акцепторных фрагментов, с которыми конъюгированы модифицированные сахара. Так, о пептидном конъюгате по настоящему изобретению, в котором каждый фрагмент модифицированного сахара конъюгирован с акцепторным сайтом, имеющим такую же структуру, что и акцепторный сайт, с которым конъюгирован другой модифицированный сахар, говорят, что указанный пептидный конъюгат характеризуется 100% гомогенности. Гомогенность обычно выражают как интервал значений. Низшее значение интервала значений гомогенности для пептидных конъюгатов составляет около 60%, около 70% или около 80%, и верхнее значение интервала значений гомогенности составляет около 70%, около 80%, около 90% или более чем около 90%.

Если гомогенность пептидных конъюгатов составляет более чем или равна около 90%, указанную гомогенность также предпочтительно выражают как интервал значений. Низшее значение интервала значений гомогенности составляет около 90%, около 92%, около 94%, около 96% или около 98%. Верхнее значение интервала значений гомогенности составляет около 92%, около 94%, около 96%, около 98% или около 100% гомогенность. Степень чистоты пептидных конъюгатов обычно определяют одним или более из способов, известных специалистам в данной области, например, используя жидкостную хроматографию-масс спектрометрию (ЖХ-МС), матричную лазерную десорбционную спектрометрию с определением масс по времени полета (MALDITOF), капиллярный электрофорез и т.п.

Термины "существенно однородная гликоформа" или "существенно однородный характер гликозилирования", когда речь идет о видах гликопептидов, относятся к процентам акцепторных фрагментов, которые гликозилированы представляющей интерес гликозилтрансферазой (например, фукозилтрансферазой). Например, в случае α1,2 фукозилтрансферазы, наблюдается практически однородный характер фукозилирования, если существенно все (как определено далее) Galβ1,4-GlcNAc-R и их сиалилированные аналоги являются фукозилированными в пептидных конъюгатах по настоящему изобретению. В представленных далее фукозилированных структурах связь Fuc-GlcNAc бывает обычно α1,6 или α1,3, причем α1,6 обычно предпочтительна. Специалистам следует понимать, что исходный материал может содержать гликозилированные акцепторные фрагменты (например, фукозилированные Galβ1,4-GlcNAc-R фрагменты). Так, рассчитанный процент глиозилирования будет включать акцепторные фрагменты, которые гликозилированы способами настоящего изобретения, также как и те акцепторные фрагменты, которые уже были гликозилированными в исходном материале.

Термин "существенно" в вышеприведенных определениях или "существенно однородный" обычно означает, что, по меньшей мере, около 40%, по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 80%, или более предпочтительно, по меньшей мере, около 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 95% акцепторных фрагментов для конкретной гликозилтрансферазы являются гликозилированными.

В тех случаях, когда группы заместителей специфицированы своими обычными химическими формулами, записанными слева направо, они также охватывают химически идентичные заместители, которые были бы при записи структур справа налево, например, -CH₂О- можно также читать как -OCH₂-.

Термин "алкил" сам по себе или как часть другого заместителя означает, если нет других указаний, неразветвленную или разветвленную цепочку, или циклический углеводородный радикал, или их комбинацию, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, содержащие обозначенное число атомов углерода (т.е. C₁-C₁₀ означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, но ими не ограничиваются, группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, их гомологи и изомеры, например, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенная алкильная группа содержит одну или более двойные связи или тройные связи. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, но ими не ограничиваются, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Термин "алкил", если нет других указаний, также подразумевает включение тех производных алкила, которые более подробно определены далее, такие как "гетероалкил." Алкильные группы, которые ограничены углеводородными группами, именуют как "гомоалкил".

Термин "алкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из алкана, как представлено, но этим не ограничено, -CH₂CH₂CH₂CH₂-, и включает далее группы, раскрытые далее как "гетероалкилен". Обычно алкильная (или алкиленовая) группа содержит от 1 до 24 атомов углерода, причем те группы, которые содержат 10 или менее атомов углерода, предпочтительны в настоящем изобретении. "Низший алкил" или "низший алкилен" являются более короткими цепочками алкильной или алкиленовой групп, обычно они содержат восемь или менее атомов углерода.

Термины "алкокси", "алкиламино" и "алкилтио" (или тиоалкокси) используют в их обычном смысле, и они относятся к тем алкильным группам, которые присоединены к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу, или атом серы, соответственно.

Термин "гетероалкил" сам по себе или в комбинации с другим термином означает, если нет других указаний, стабильную неразветвленную или разветвленную цепочку, или циклический углеводородный радикал, или их комбинации, состоящие из указанного числа атомов углерода и, по меньшей мере, одного гетероатома, выбранного из группы, состоящий из O, N, Si и S, и где атомы азота и серы могут быть необязательно окислены, и гетероатом азота может быть необязательно кватернизован. Гетероатом (гетероатомы) O, N и S и Si могут занимать положение внутри гетероалкильной группы или могут занимать положение, при котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примеры включают, но ими не ограничиваются, -CH₂-CH₂-О-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-О-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ и -CH=CH-N(CH₃)-CH₃. Вплоть до двух гетероатомов могут располагаться последовательно, так как, например, в -CH₂-NH-OCH₃ и -CH₂-О-Si(CH₃)₃. Аналогично, термин "гетероалкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из гетероалкила, как представлено, но ими не ограничено, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- и -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-. В гетероалкиленовых группах гетероатомы также могут быть расположены или на одном или на обоих концах цепочки (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т.п). Кроме того, для алкиленовых и гетероалкиленовых связывающих групп не подразумевается ориентация связывающих групп направлением, в котором записана формула связывающей группы. Например, формула -C(O)₂R'- справедлива как для -C(O)₂R'-, так и для -R'C(O)₂-.

Термины "циклоалкил" и "гетероциклоалкил", сами по себе или в комбинации с другими терминами, представляют, если нет других указаний, циклические версии терминов "алкил" и "гетероалкил", соответственно. Дополнительно, в случае гетероциклоалкила, гетероатом может занимать положение, по которому гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примеры циклоалкилов включают, но ими не ограничиваются, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкилов включают, но ими не ограничиваются, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п.

Термины "гало" или "галоген", сами по себе, или как часть другого заместителя, означают, если нет других указаний, атомы фтора, хлора, брома или йода. Дополнительно подразумевается, что термины, такие как "галогеноалкил", включают моногалогеноалкилы и полигалогеноалкилы. Например, термин "галоген(С_1-4)алкил" включает, но ими не ограничивается, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил, и т.п.

Термин "арил" означает, если нет других указаний, полиненасыщенный, ароматический заместитель, который может быть одним кольцом или несколькими кольцами (предпочтительно от 1 до 3 колец), которые конденсированы вместе или ковалентно связаны. Термин "гетероарил" относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N, O, и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, и где атом (атомы) азота необязательно кватернизованы. Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через гетероатом. Неограничивающие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5- изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил, тетразолил, бензо[b]фуранил, бензо[b]тиенил, 2,3-дигидробензо[1,4]диоксин-6-ил, бензо[1,3]диоксол-5-ил и 6-хинолил. Заместители для каждой из вышеуказанных арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы приемлемых заместителей, которые раскрыты далее.

Для краткости термин "арил", когда его используют в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиоокси, арилалкил), включает как арильные, так и гетероарильные кольца, как определено выше. Так термин "арилалкил" включает те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил, пиридилметил и т.п.), включая такие алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) был заменен, например, на атом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).

Каждый из вышеуказанных терминов (например, "алкил", "гетероалкил", "арил" и "гетероарил") включает как замещенные, так и незамещенные формы указанных радикалов. Предпочтительные заместители для каждого типа радикалов приведены далее.

Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая такие группы, которые часто именуют как алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) обычно именуют как "алкильная группа заместителей", и они могут быть одной или более из различных групп, выбранных из, без ограничения: -OR', =О, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -галоген, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R',

-CО₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSО₂R', -CN и -NО₂ в количестве от нуля до (2m'+1), где m' представляет собой полное число атомов углерода в таком радикале. R', R", R'" и R"" каждый предпочтительно независимо относится к водороду, замещенному или незамещенному гетероалкилу, замещенному или незамещенному арилу, например арилу, замещенному 1-3 галогенами, замещенному или незамещенному алкилу, алкокси или тиоалкокси группам, или арилалкильным группам. Если соединение по настоящему изобретению включает более чем одну R группу, например, каждую из R групп независимо выбирают как каждую из R', R", R'" и R"" групп, если присутствует более одной такой группы. Если R' и R" присоединены к одному и тому же атому азота, они могут быть объединены с атомом азота с образованием 5-, 6- или 7-членного кольца. Например, -NR'R" включает, но ими не ограничивается, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалисту должно быть понятно, что термин "алкил" включает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, отличающимися от водорода, такие как галогеноалкил (например, -CF₃ и -CH₂CF₃) и ацил (например, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂ОCH₃ и т.п).

Подобно заместителям, раскрытым для алкильных радикалов, заместители арильных и гетероарильных групп обычно именуют как "арильная группа заместителей". Указанные заместители выбирают из, например: галогена, -OR', =О, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -галогена, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CО₂R', -CONR'R", -ОC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSО₂R', -CN и -NО₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, фтор(С_1-С₄)алкокси и фтор(C₁-C₄)алкила, в количестве в интервале от нуля до полного числа свободных валентностей в системе ароматических колец; и где R', R", R'" и R"" предпочтительно независимо выбирают из водорода, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила. Если соединение по настоящему изобретению включает более одной R группы, например, каждую из R групп независимо выбирают как каждую из R', R", R'" и R"" групп, если присутствует более одной из указанных групп. В представленных далее схемах символ X представляет собой "R", как раскрыто выше.

Два из заместителей соседних атомов арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -T-C(O)-(CRR')_u-U-, где T и U независимо представляют собой -NR-, -О-, -CRR'- или простую связь, и u равен целому числу от 0 до 3. Альтернативно, два из заместителей у соседних атомов арильного или гетероарильного кольца могут необязательно быть заменены заместителем формулы -A-(CH₂)_r-B-, где A и B независимо представляют -CRR'-, -О-, -NR-, -S-, -S(О), -S(O)₂-, -S(O)₂NR'- или простую связь, и r представляет собой целое число от 1 до 4. Одна из простых связей образованного таким образом нового кольца может быть необязательно заменена двойной связью. Альтернативно, два из заместителей на соседних атомах арильного или гетероарильного кольца необязательно могут быть заменены заместителем формулы -(CRR')_z-X-(CR"R'")_d-, где z и d независимо представляют собой целые числа от 0 до 3, и X представляет собой -О-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, или -S(O)₂NR'-. Заместители R, R', R" и R"' предпочтительно независимо выбирают из водорода или замещенного или незамещенного (C₁-С₆) алкила.

Как используется в настоящем описании, термин "гетероатом" включает кислород (O), азот (N), серу (S) и кремний (Si).

Как используется в настоящем описании, пептид фактора VII относится как к пептиду фактора VII, так и к пептиду фактора VIIa. Указанные термины обычно относятся к вариантам и мутантам указанных пептидов, включая добавления, делеции, замещения и слитые белковые мутанты. Если используют и фактор VII, и фактор VIIa, применение должно быть иллюстрировано двумя типами рода "пептид фактора VII".

Настоящее изобретение включает соли соединений по настоящему изобретению, которые получают из относительно нетоксичных кислот или оснований, в зависимости от конкретных заместителей, раскрытых в настоящем описании указанных соединений. Если соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислотные функциональности, соли присоединения оснований можно получить, осуществляя контактирование нейтральной формы такого соединения с достаточным количеством нужного основания, или в чистом виде, или в подходящем инертном растворителе. Примеры солей присоединения оснований включают соли натрия, калия, лития, кальция, аммония, органического амина, или соли магния, или аналогичные соли. Если соединения по настоящему изобретению содержат относительно основные функциональности, соли присоединения кислот можно получить, осуществляя контактирование нейтральной формы такого соединения с достаточным количеством нужной кислоты, или в чистом виде или в подходящем инертном растворителе. Примеры солей присоединения кислот включают те, что получены из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, азотная, угольная, моноосновная карбоновая, фосфорная, моноосновная фосфорная, ортофосфорная кислота, серная, моноосновная серная, йодистоводородная или фосфористая кислоты и т.п., также как и соли, полученные из относительно нетоксичных органических кислот, подобных уксусной, пропионовой, изомасляной, малеиновой, малоновой, бензойной, янтарной, пробковой, фумаровой, молочной, миндальной, фталевой, бензолсульфоновой, p-толуолсульфоновой, лимонной, винной, метансульфоновой кислотам и т.п. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и т.п., и соли органических кислот, подобных глюкуроновой или галактуроновой кислотам и т.п. (см., например, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)). Некоторые конкретные соединения по настоящему изобретению содержат как основные, так и кислотные функциональности, которые позволяют превращать соединения в соли присоединения оснований или кислот.

Нейтральные формы соединений предпочтительно регенерируют, осуществляя контактирование соли с основанием или кислотой и выделяя исходные соединения обычным образом. Исходные формы соединения отличаются от различных форм солей некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях.

Термин "солевой противоион", как используется в настоящем описании, относится к положительно заряженным ионам, которые ассоциированы с соединением по настоящему изобретению, если один из его фрагментов заряжен отрицательно (например, COO-). Примеры солевых противоионов включают H⁺, H₃О⁺, аммиак, калий, кальций, литий, магний и натрий.

Как используется в настоящем описании, термин "CMP-SA-PEG" представляет собой молекулу цитидинмонофосфата, которая конъюгирована с сиаловой кислотой, которая включает фрагмент полиэтиленгликоля. Если длина цепочки полиэтиленгликоля не специфицирована, тогда возможно наличие PEG с любой длиной цепочки (например, 1 кДа, 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа). Примером CMP-SA-PEG служит соединение 5 на схеме 1.

I. Введение

Для повышения эффективности рекомбинантных пептидов, используемых для терапевтических целей, в настоящем изобретении предложены конъюгаты гликозилированных и негликозилированных пептидов с модифицирующей группой. Модифицирующие группы можно выбирать из полимерных модифицирующих групп, таких как, например, PEG (m-PEG), PPG (m-PPG) и т.д., терапевтических фрагментов, диагностических фрагментов, направляющих фрагментов и т.п. Модификация пептидов, например, водорастворимой полимерной модифицирующей группой может повысить стабильность и время пребывания рекомбинантных пептидов в организме человека, и/или снизить антигенность рекомбинантных пептидов.

Пептидные конъюгаты по настоящему изобретению можно получить в результате ферментативного присоединения модифицированного сахара к гликозилированному или негликозилированному пептиду. Сайт гликозилирования и/или модифицированная гликозильная группа обеспечивают место для конъюгирования модифицированного сахара, содержащего модифицирующую группу, с пептидом, например, путем гликоконъюгирования.

Рассматриваемые способы настоящего изобретения также обеспечивают возможность сборки пептидных конъюгатов и гликопептидных конъюгатов, которые обладают существенно гомогенным характером производных. Ферменты, которые используют в настоящем изобретении, обычно являются селективными для конкретного аминокислотного остатка, комбинаций аминокислотных остатков, конкретных гликозильных остатков, или комбинаций гликозильных остатков пептидов. Указанные способы имеют также применение для крупномаштабного получения конъюгатов пептидов. Так, рассматриваемые способы настоящего изобретения обеспечивают практические средства для крупномасштабного получения пептидных конъюгатов, обладающих заранее выбранным однородным характером производных. Способы настоящего изобретения особенно подходят для модификации терапевтических пептидов, включая, но ими не ограничиваясь, гликопептиды, которые не полностью гликозилированы во время их получения в клетках в клеточной культуре (например, в клетках млекопитающих, в клетках насекомых, в клетках растений, в клетках грибов, в клетках дрожжей, или в клетках прокариотов) или трансгенных растений или животных.

Настоящее изобретение также предлагает конъюгаты гликозилированных и негликозилированных пептидов с увеличенным терапевтическим периодом полувыведения за счет, например, уменьшения скорости выведения или уменьшения скорости захвата иммунной или ретикулоэндотелиальной системой (RES). Кроме того, способы настоящего изобретения предоставляют средство для маскировки антигенных детерминант на пептидах, тем самым, уменьшая или исключая иммунную реакцию хозяина против указанного пептида. Селективное присоединение направляющих агентов можно также использовать для направления пептида к конкретной ткани или рецептору клеточной поверхности, которые специфичны для конкретного направляющего агента.

Определение оптимальных условий для получения пептидных конъюгатов с водорастворимыми полимерами, например, включает оптимизацию многочисленных параметров, которые зависят от особенностей пептида и водорастворимого полимера. Например, если указанным полимером является поли(этиленгликоль), например разветвленный поли(этиленгликоль), баланс предпочтительно устанавливается между количеством используемого в реакции полимера и вязкостью реакционной смеси, определяемой присутствием указанного полимера: если концентрация полимера слишком высока, реакционная смесь становится вязкой, что приводит к замедлению скорости массового переноса и скорости реакции.

Кроме того, хотя добавление избытка фермента интуитивно очевидно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что если фермент присутствует в слишком большом избытке, указанный избыточный фермент становится загрязняющей примесью, удаление которой требует дополнительных стадий очистки и материалов, и неоправданно повышает стоимость конечного продукта.

Кроме того, обычно бывает желательным получать пептид с контролируемой степенью модификации. В некоторых случаях желательно добавлять преимущественно один модифицированный сахар. В других случаях желательно добавлять преимущественно два модифицированных сахара. Так, условия реакции предпочтительно регулируют таким образом, чтобы влиять на степень конъюгирования модифицирующих групп с пептидом.

В настоящем изобретении предложены условия, при которых выход пептида, обладающего заданной степенью конъюгирования, оказался максимальным. Условия в предпочтительных вариантах настоящего изобретения также учитывают стоимость различных реагентов и материалов и время, необходимое для очистки продукта: представленные далее условия реакций оптимизированы для достижения высоких выходов нужного продукта при минимальных затратах на стоимость реагентов.

II. Композиции вещество/пептидный конъюгат

В первом аспекте в настоящем изобретении предложен конъюгат модифицированного сахара и пептида. В настоящем изобретении предложен также конъюгат модифицирующей группы и пептида. Пептидный конъюгат может принимать одну из нескольких форм. В одном из примеров варианта осуществления пептидный конъюгат может включать пептид и модифицирующую группу, связанную с аминокислотой пептида через гликозильную связывающую группу. В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат может включать пептид и модифицирующую группу, связанную с гликозильным остатком пептида через гликозильную связывающую группу. В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат может включать пептид и гликозильную связывающую группу, которая связана и с гликопептидным углеводом, и непосредственно с аминокислотным остатком пептидного скелета. В еще одном примерном варианте осуществления пептидный конъюгат может включать пептид и модифицирующую группу, связанную непосредственно с аминокислотным остатком пептида. В указанном варианте осуществления пептидный конъюгат может не содержать гликозильной группы. В любом из этих вариантов пептид может быть или может не быть гликозилированным.

Структура конъюгатов по настоящему изобретению обычно соответствует следующей формуле:

в которой символы a, b, c, d и s представляют собой положительное, не равное нулю целое число; и t представляет собой 0 или положительное целое число. "Агент", или модифицирующая группа, может быть терапевтическим агентом, биоактивным агентом, детектируемой меткой, полимерной модифицирующей группой, такой как водорастворимый полимер (например, PEG, m-PEG, PPG и m-PPG) или т.п. "Агент" или модифицирующая группа может быть пептидом, например, ферментом, антителом, антигеном, и т.д. Линкер может быть любым из широкого круга связывающих групп, infra. Альтернативно, линкер может быть простой связью или может быть "линкером нулевого порядка".

II.A. Пептид

Пептидом в пептидном конъюгате является представитель, выбранный из пептидов, представленных на ФИГ. 7. В этих случаях пептидом в пептидном конъюгате является представитетель, выбранный из морфогенетических белков кости (например, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), нейротрофинов (например, NT-3, NT-4, NT-5), факторов роста и дифференциации (например, GDF-5), нейротрофического фактора, выделенного из линии глиальных клеток (GDNF), нейротрофического фактора, выделенного из головного мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), протеазы фактора фон Виллебранда (vWF), фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XI, фактора VIII с делецией В-домена, слитого белка vWF-фактор VIII, содержащего полноразмерный фактор VIII, слитого белка vWF-фактор VIII с делецией В-домена у фактора VIII, эритропоэтина (EPO), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагально колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона альфа, интерферона бета, интерферона гамма, α₁-антитрипсина (ATT, или ингибитор α-1 протеазы, глюкоцереброзидазы, активатора ткане-типического плазминогена (TPA), интерлейкина-2 (IL-2), урокиназы, ДНКазы человека, инсулина, поверхностного белка гепатита В (HbsAg), гормона роста человека, слитого белка рецептора TNF - Fc-участка IgG (Enbrel™), моноклонального антитела против HER2 (Herceptin™), моноклонального антитела к белку F респиратороного синцитиального вируса (Synagis™), моноклонального антитела против TNF-α (Remicadе™), моноклонального антитела к гликопротеину IIb/IIIa (Reopro™), моноклонального антитела к CD20 (Rituxan™), анти-тромбина III (AT III), хорионического гонадотропина человека (hCG), альфа-галактозидазы (Fabrazyme™), альфа-ибуронидазы (Aldurazyme™), фолликулостимулирующего гормона, бета-глюкозидазы, моноклонального антитела против TNF-альфа, глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоно-подобного пептида-2 (GLP-2), бета-глюкозидазы, альфа-галактозидазы A и фактора роста фибробластов. В некоторых вариантах осуществления пептид в пептидном конъюгате представляет собой фактор VIII. В других вариантах осуществления пептид в пептидном конъюгате представляет собой интерферон альфа.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру, включающую фрагмент в соответствии со следующими формулами:

и

В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 5000, предпочтительно от около 100 до около 4000, более предпочтительно от около 200 до около 3000, еще более предпочтительно от около 300 до около 2000 и еще более предпочтительно от около 400 до около 1000. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 70, от около 70 до около 150, от около 150 до около 250, от около 250 до около 375 и от около 375 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 10 до около 35, от около 45 до около 65, от около 95 до около 130, от около 210 до около 240, от около 310 до около 370 и от около 420 до около 480. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 15 до около 30. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 50 до около 65. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 100 до около 130. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляет собой целые числа, выбранные из от около 210 до около 240. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 310 до около 370. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляет собой целые числа, выбранные из от около 430 до около 470. В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый представляет собой член, выбранный из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с настоящим вариантом включают фрагмент:

и

В одном из примеров варианта осуществления, в котором модифицирующая группа представляет собой разветвленный водорастворимый полимер, такая, как изображена выше, обычно предпочтительно, чтобы концентрация сиалидазы составляла от около 1,5 до около 2,5 Ед/л реакционной смеси. Более предпочтительно, чтобы количество сиалидазы составляло около 2 Ед/л.

В другом предпочтительном варианте осуществления осуществляют контактирование от около 5 до около 9 грамм пептидного субстрата с определенным количеством сиалидазы, как определено выше.

Модифицированный сахар присутствует в реакционной смеси в количестве от около 1 грамма до около 6 грамм, предпочтительно от около 3 грамм до около 4 грамм. Обычно предпочтительно поддерживать концентрацию модифицированного сахара, содержащего модифицирующий фрагмент разветвленного водорастворимого полимера, например фрагмент, представленный выше, менее чем около 0,5 мМ.

В некоторых вариантах модифицирующая группа представляет собой разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль), с молекулярным весом от около 20 кДа до около 60 кДа, более предпочтительно от около 30 кДа до около 50 кДа, и еще более предпочтительно около 40 кДа. В других вариантах осуществления модифицирующая группа представляет собой разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль), с молекулярным весом, по меньшей мере, около 80 кДа, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 120 кДа, по меньшей мере, около 140 кДа, по меньшей мере, около 160 кДа. В еще другом варианте осуществления разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль) имеет молекулярный вес, по меньшей мере, около 200 кДа, например, от, по меньшей мере, около 80 кДа до, по меньшей мере, около 200 кДа, включая, по меньшей мере, около 160 кДа и, по меньшей мере, около 180 кДа. Специалистам должно быть понятно, что молекулярный вес полимеров часто является полидисперсным, таким образом, выражение "около" в контексте молекулярного веса предпочтительно включает интервал значений около указанной величины. Например, предпочтительной модифицирующей группой с молекулярным весом около 40 кДа является группа с молекулярным весом от около 35 кДа до около 45 кДа. Специалистам должно быть понятно, что идентичности с разветвленными PEG структурами, представленными выше, приведены просто для четкости иллюстраций, PEG может быть заменен по существу любым полимерным фрагментом, включая, без ограничений те примеры, которые приведены выше для определения термина "полимерный фрагмент".

Что касается концентрации гликозилтрансферазы, то в рассматриваемом предпочтительном варианте осуществления, с представленными выше используемыми модифицирующими группами, отношение гликозилтрансферазы к пептиду составляет около 40 мкг/мл трансферазы на около 200 мкМ пептида.

II. B. Модифицированные сахара

В одном из примеров варианта осуществления пептиды по настоящему изобретению, такие как фактор VIII, интерферон альфа и пептиды, перечисленные на ФИГ. 7, подвергают взаимодействию с модифицированным сахаром, получая таким образом пептидный конъюгат. Модифицированный сахар включает "сахарный донорный фрагмент" также как "сахарный фрагмент переноса". Сахарный донорный фрагмент представляет собой любую часть модифицированного сахара, которая будет присоединена к пептиду, или через гликозильный фрагмент или через фрагмент аминокислоты, как конъюгат по настоящему изобретению. Сахарный донорный фрагмент включает такие атомы, которые химически изменяются во время их превращения из модифицированного сахара в гликозильную связывающую группу пептидного конъюгата. Сахарный фрагмент переноса представляет собой любую часть модифицированного сахара, которая не будет присоединена к пептиду как конъюгат по настоящему изобретению. Например, модифицированный сахар по настоящему изобретению представляет собой PEGилированный сахарный нуклеотид, PEG-сиаловая кислота CMP. Для PEG-сиаловая кислота CMP, сахарный донорный фрагмент, или PEG-сиалил донорный фрагмент, включает PEG-сиаловую кислоту, тогда как сахарный фрагмент переноса, или сиалильный фрагмент переноса, включает CMP.

В модифицированных сахарах, используемых в настоящем изобретении, сахарильный фрагмент предпочтительно представляет собой сахарид, деокси-сахарид, амино-сахарид или N-ацил сахарид. Термин "сахарид" и его эквиваленты "сахарил", "сахар" и "гликозил" относится к мономерам, димерам, олигомерам и полимерам. Сахарный фрагмент может быть также функционализирован модифицирующей группой. Модифицирующая группа конъюгирована с сахарильным фрагментом, обычно за счет конъюгирования с амином, сульфгидрилом или гидроксилом, например, первичным гидроксильным фрагментом на сахаре. В одном из примеров варианта осуществления модифицирующая группа присоединена через аминофрагмент на сахаре, например, через амид, уретан или мочевину, которые образованы в результате реакции амина с реакционноспособным производным модифицирующей группы.

Любой сахарильный фрагмент можно использовать в качестве сахарного донорного фрагмента модифицированного сахара. Сахарильный фрагмент может быть известным сахаром, таким как манноза, галактоза или глюкоза, или видом, обладающим стереохимией известного сахара. Общие формулы указанных модифицированных сахаров имеют вид:

и

Другие сахарильные фрагменты, которые можно использовать при создании композиций по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, фукозу и сиаловую кислоту, также как аминосахара, такие как глюкозамин, галактозамин, маннозамин, 5-аминные аналоги сиаловой кислоты и т.п. Сахарильный фрагмент может быть природной структурой, или может быть модифицирован для обеспечения сайта для конъюгирования модифицирующей группы. Например, в одном из вариантов осуществления модифицированный сахар обеспечивает производное сиаловой кислоты, в которой 9-гидрокси фрагмент заменен на амин. Указанный амин легко преобразуется активированным аналогом выбранной модифицирующей группы.

Примеры модифицированных сахаров, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в PCT патентной заявке No. PCT/US05/002522, которая включена в данное описание в качестве ссылки.

В следующем примере варианта осуществления в настоящем изобретении используют модифицированные сахара, в которых в 6-гидроксильное положение превращают соответствующий аминный фрагмент, который содержит кассету линкер-модифицирующая группа, такая как те, что представлены выше. Примеры гликозильных групп, которые можно использовать в качестве ядер указанных модифицированных сахаров, включают Glu, Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man и т.п. Примеры модифицированных сахаров в соответствии с рассматриваемым вариантом имеют формулу:

в которой R¹¹-R¹⁴ представляют собой члены, независимо выбранные из H, OH, C(O)CH₃, NH и NHC(O)CH₃. R¹⁰ представляет собой связь с другим гликозильным остатком (-O-гликозил) или с аминокислотой фактор VII/фактор VIIa пептид (-NH-(фактор VII/фактор VIIa)). R¹⁴ представляет собой OR¹, NHR¹ или NH-L-R¹. R¹ и NH-L-R¹ имеют указанные выше значения.

II. C. Гликозильные связывающие группы

В одном из примеров варианта осуществления настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, образованному модифицированным сахаром по настоящему изобретению и пептидом. В другом примере варианта осуществления модифицирующая группа модифицированного сахара включает фрагмент:

и пептид в пептидном конъюгате представляет собой член, выбранный из пептидов, представленных на ФИГ. 7. В еще одном примерном варианте пептид в пептидном конъюгате представляет собой член, выбранный из морфогенетических белков кости (например, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), нейротрофинов (например, NT-3, NT-4, NT-5), факторов роста и дифференциации (например, GDF-5), нейротрофического фактора, выделенного из линии глиальных клеток (GDNF), нейротрофического фактора, выделенного из головного мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), протеазы фактора фон Виллебранда (vWF), фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XI, фактора VIII с удаленным В-доменом, гидридного белка vWF-фактор VIII, содержащего полноразмерный фактор VIII, слитого белка vWF-фактор VIII, в котором у фактора VIII удален В-домен, эритропоэтина (EPO), фактора, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона альфа, интерферона бета, интерферона гамма, α₁-антитрипсина (ATT, или ингибитора α-1 протеазы), глюкоцереброзидазы, активатора плазминогена тканевого типа (TPA), интерлейкина-2 (IL-2), урокиназы, ДНКазы человека, инсулина, поверхностного белка гепатита В), гормона роста человека, слитого белка рецептора TNF - Fc-участка IgG (Enbrel™), моноклонального антитела против HER2 (Herceptin™), моноклонального антитела к белку F респираторного синцитиального вируса (Synagis™), моноклонального антитела против TNF-α (Remicade™), моноклонального антитела к гликопротеину IIb/IIIa (Reopro™), моноклонального антитела к CD20 (Rituxan™), анти-тромбина III (AT III), хорионического гонадотропина человека (hCG), альфа-галактозидазы (Fabrazyme™), альфа-идуронидазы (Aldurazyme™), фолликулостимулирующего гормона, бета-глюкозидазы, моноклонального антитела против TNF-альфа, глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоно-подобного пептида-2 (GLP-2), бета-глюкозидазы, альфа-галактозидазы A и фактора роста фибробластов. В некоторых вариантах осуществления пептид представляет собой фактор VIII или интерферон-альфа. В указанном варианте осуществления сахарный донорный фрагмент (такой как сахарильный фрагмент и модифицирующая группа) модифицированного сахара становится "гликозильной связывающей группой". "Гликозильная связывающая группа" может альтернативно относиться к гликозильному фрагменту, который помещают между пептидом и модифицирующей группой.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа включает фрагмент, структура которого соответствует следующим формулам:

и

В одном из примеров варианта осуществления модифицирующая группа модифицированного сахара включает фрагмент:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый представляет члены, выбранные из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с рассматриваемым вариантом осуществления включают фрагменты:

и

Как должно быть понятно специалистам в данной области, PEG фрагменты в каждой из представленных выше структур можно заменить любыми другими полимерными фрагментами, включая, без ограничений, те, что представлены в настоящем описании как "полимерные фрагменты".

Благодаря разнообразию способов, доступных для добавления и/или модификации гликозильных остатков у пептида, гликозильные связывающие группы могут иметь практически любую структуру. В приводимом далее описании настоящее изобретение иллюстрируется со ссылкой на использование выбранных производных фуранoзы и пиранозы. Как должно быть понятно специалистам в данной области, центральной частью обсуждения является четкость иллюстраций того, что представленные далее структуры и композиции в целом применимы для рода гликозильных связывающих групп и модифицированных сахаров. Гликозильная связывающая группа может включать практически любой моно- или олигосахарид. Гликозильные связывающие группы могут быть присоединены к аминокислоте или через боковую цепь, или через пептидный скелет. Альтернативно гликозильные связывающие группы могут быть присоединены к пептиду через сахарильный фрагмент. Указанный сахарильный фрагмент может быть частью O-связанной или N-связанной гликановой структуры пептида.

В одном из примеров варианта осуществления настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, включающему интактную гликозильную связывающую группу, описываемую формулой, которую выбирают из:

и

В формулах I и Ia R² представляет собой H, CH₂OR⁷, COOR⁷ или OR⁷, где R⁷ представляет собой H, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил. Когда COOR⁷ представляет собой карбоновую кислоту или карбоксилат, обе формы представляют обозначением одной структуры COO^- или COOH. В формулах I, Ia, II или IIa символы R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R^6' независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, OR⁸, NHC(O)R⁹. Индекс d равен 0 или 1. R⁸ и R⁹ независимо выбран из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, сиаловой кислоты или полисиаловой кислоты. По меньшей мере, один из R³, R⁴, R⁵, R⁶ или R^6' включает модифицирующую группу. Указанная модифицирующая группа может быть полимерным модифицирующим фрагментом, например PEG, связанным через связь или связывающую группу. В одном из примеров варианта осуществления R⁶ и R^6' вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, представляют собой компоненты пировиноградной боковой цепи сиаловой кислоты. В следующем примере варианта осуществления пировиноградная боковая цепь функционализирована полимерной модифицирующей группой. В другом примере варианта осуществления R⁶ и R^6' вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, являются компонентами боковой цепи сиаловой кислоты и полимерная модифицирующая группа представляет собой компоненту R⁵.

В одном из примеров варианта осуществления в настоящем изобретении используют гликозильную связывающую группу формулы:

где J представляет собой гликозильный фрагмент, L представляет собой связь или линкер и R¹ представляет собой модифицирующую группу, например полимерную модифицирующую группу. Примерами связей служат такие связи, которые образованы между NH₂ фрагментом у гликозильного фрагмента и группой комплементарной реакционной способности у модифицирующей группы. Например, если R¹ включает фрагмент карбоновой кислоты, указанный фрагмент можно активировать и присоединить к NH₂ фрагменту гликозильного остатка, получая связь со структурой NHC(O)R¹. J предпочтительно представляет собой гликозильный фрагмент, который "интактен", т.е. не разложился при экспонировании в условиях, в которых происходит расщепление пиранозных или фуранозных структур, например, в условиях окисления, например, периодатом натрия.

Примеры линкеров включают алкильные и гетероалкильные фрагменты. Указанные линкеры включают связывающие группы, например связывающие группы на основе ацила, например, -C(O)NH-, -OC(O)NH- и т.п. Указанные связывающие группы представляют собой связи, образованные между компонентами видов по настоящему изобретению, например, между гликозильным фрагментом и линкером (L), или между линкером и модифицирующей группой (R¹). Другими примерами связывающих групп являются простые эфиры, простые тиоэфиры и амины. Например, в одном из вариантов линкер представляет собой аминокислотный остаток, такой как остаток глицина. Фрагмент карбоновой кислоты глицина превращают в соответствующий амид, осуществляя взаимодействие с амином гликозильного остатка, и указанный амин глицина превращают в соответствующий амид или уретан, осуществляя взаимодействие с активированной карбоновой кислотой или карбонатом модифицирующей группы.

Примеры видов NH-L-R¹ имеют формулу:

-NH{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH}_tR¹, где индексы s и t представляют собой независимо 0 или 1. Индексы a, b и d независимо представляют собой целые числа от 0 до 20, и c представляет собой целое число от 1 до 2500. Другие аналогичные линкеры основаны на видах, в которых -NH фрагмент заменен другой группой, например, -S, -O или -CH₂. Как должно быть понятно специалистам в данной области, один или более из заключенных в скобки фрагментов, соответствующих индексам s и t, может быть заменен замещенным или незамещенным алкильным или гетероалкильным фрагментом.

Более конкретно, в настоящем изобретении используют соединения, в которых NH-L-R¹ представляет собой: NHC(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NHC(O)О(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NH(CH₂)_аNHC(О)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_CO(CH₂)_dNHR¹, NHC(O)(CH₂)_aNHR¹, NH(CH₂)_aNHR¹ и NHR¹. В приведенных формулах индексы a, b и d независимо выбирают из целых чисел от 0 до 20, предпочтительно от 1 до 5. Индекс c представляет собой целое число от 1 до около 25000.

В одном из примеров варианта осуществления c выбирают таким образом, чтобы PEG фрагмент соответствовал приблизительно 1 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, 40 кДа или 45 кДа.

Для удобства гликозильные связывающие группы в остальной части указанного раздела основаны на сиалилильном фрагменте. Однако как должно быть понятно специалистам в данной области, другие гликозильные фрагменты, такие как маннозил, галактозил, глюкозил или фукозил, можно использовать вместо сиалильного фрагмента.

В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой интактную гликозильную связывающую группу, в которой гликозильный фрагмент или фрагменты, образующие связывающую группу, не разлагаются в химических (например, под действием метапериодата натрия) или ферментативных (например, под действием оксидазы) процессах. Выбранные конъюгаты по настоящему изобретению включают модифицирующую группу, которая присоединена к аминному фрагменту амино-сахарида, например маннозамину, глюкозамину, галактозамину, сиаловой кислоте и т.д. Примеры кассет модифицирующая группа-интактная гликозильная связывающая группа, в соответствии с указанным, основаны на структуре сиаловой кислоты, такой как в формулах:

и

В представленных выше формулах R¹ и L имеют указанные выше значения. Дальнейшие подробности относительно структуры примеров R¹ групп представлены далее.

В еще одном примерном варианте осуществления конъюгат образуется между пептидом и модифицированным сахаром, в котором модифицирующая группа присоединена через линкер в положении 6-углерода модифицированного сахара. Так, иллюстративные гликозильные связывающие группы в соответствии с указанным вариантом имеют формулу:

где радикалы имеют указанные выше значения. Гликозильные связывающие группы включают, без ограничений, глюкозу, глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, галактозу, галактозамин, N-ацетилгалактозамин, маннозу, маннозамин, N-ацетилманнозамин и т.п.

В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предложен пептидный конъюгат, включающий следующую гликозильную связывающую группу:

где D представляет собой член, выбранный из -OH и R¹-L-HN-; G представляет собой член, выбранный из H и R¹-L- и -C(O)(C₁-C₆)алкила; R¹ представляет собой фрагмент, включающий неразветвленный или разветвленный остаток поли(этиленгликоля); и L представляет собой линкер, например, связь ("нулевой порядок"), замещенный или незамещенный алкил и замещенный или незамещенный гетероалкил. В иллюстративных вариантах, если D представляет собой OH, то G представляет собой R¹-L-, и если G представляет собой -C(O)(C₁-C₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NH-.

В одном из вариантов настоящего изобретения предложен пептидный конъюгат, включающий следующую гликозильную связывающую группу:

D представляет собой член, выбранный из -OH и R¹-L-HN-; G представляет собой член, выбранный из R¹-L- и -C(O)(C₁-C₆)алкил-R¹; R¹ представляет собой фрагмент, включающий член, выбранный из неразветвленного остатка поли(этиленгликоля) и разветвленного остатка поли(этиленгликоля); и M представляет собой член, выбранный из H, солевого противоиона и одиночного отрицательного заряда; L представляет собой линкер, который представляет собой член, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В одном из примеров варианта осуществления, если D представляет собой OH, то G представляет собой R¹-L-. В другом примере варианта осуществления, если G представляет собой -C(O)(C₁-C₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NH-.

В любом из соединений по настоящему изобретению группа COOH может быть альтернативно группой COOM, где M представляет собой член, выбранный из H, отрицательного заряда и солевого противоиона.

В настоящем изобретении предложен пептидный конъюгат, который включает гликозильную связывающую группу формулы:

где D и G имеют указанные выше значения.

В других вариантах гликозильная связывающая группа имеет формулу:

где D и G имеют указанные выше значения и индекс t равен 0 или 1.

В еще одном примере варианта осущестления гликозильная связывающая группа имеет формулу:

где D и G имеют указанные выше значения и индекс t равен 0 или 1.

В еще одном примере варианта осуществления гликозильная связывающая группа имеет формулу:

где D и G имеют указанные выше значения и индекс p представляет собой целое число от 1 до 10; и a равен 0 или 1.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает гликозильный фрагмент, выбранный из формул:

и

где индекс a и линкер L^a имеют указанные выше значения. Индекс p равен целому числу от 1 до 10. Индексы t и a независимо равны 0 или 1. Каждая из указанных групп может быть включена в качестве компонент представленных выше моно-, би-, три- и тетра-антенулярных сахаридных структур. AA представляет собой аминокислотный остаток пептида. Как должно быть понятно специалистам в данной области, PEG фрагмент в указанных формулах может быть заменен другой не реакционноспособной группой и полимерными фрагментами. Примеры полимеров включают полимеры семейства поли(алкилeноксидов). Нереакционноспособные группы включают группы, которые рассматривают как практически нереакционноспособные, нейтральные и/или стабильные при физиологических значениях pH, например, H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и т.п. Примеры полимерных фрагментов включают разветвленные структуры, представленные формулой IIIa и ее вариантами.

В одном из примеров варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 20 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 5 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 10 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 40 кДа. В других вариантах осуществления модифицирующая группа представляет собой разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль), с молекулярным весом, по меньшей мере, около 80 кДа, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 120 кДа, по меньшей мере, около 140 кДа или, по меньшей мере, около 160 кДа. В еще одном варианте разветвленный поли(алкиленоксид), например поли(этиленгликоль), имеет молекулярный вес, по меньшей мере, около 200 кДа, например, по меньшей мере, от около 80 кДа до, по меньшей мере, около 200 кДа, включая, по меньшей мере, около 160 кДа и, по меньшей мере, около 180 кДа. В одном из примеров варианта осуществления разветвленный полимер сам присоединен к разветвленному фрагменту (например, цистеину, серину, лизину и олигомерам лизина).

В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-10кДа фрагмент на основе остатка цистеина, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединена к пептиду. В другом примере варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-10 кДа фрагмент на основе остатка лизина, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-10 кДа фрагмент на основе остатка цистеина, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-10 кДа фрагмент на основе остатка лизина, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-5 кДа фрагмент на основе остатка цистеина, и одна, две или три из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-5 кДа фрагмент на основе остатка лизина, и одна, две или три из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-40 кДа фрагмент на основе остатка цистеина, и одна, две или три из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой разветвленный SA-PEG-40 кДа фрагмент на основе остатка лизина, и одна, две или три из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно присоединены к пептиду.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает гликозильный фрагмент, выбранный из формул:

и

где, по меньшей мере, один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру, представленную членом, выбранным из

и

где переменные имеют указанные выше значения. Как должно быть понятно специалистам в данной области, ссылка на представленные выше разветвленные PEG структуры приведена просто для четкости иллюстрации, и PEG может быть заменен практически любым полимерным фрагментом, включая, без ограничений, виды, представленные в определении "полимерный фрагмент".

В одном из примеров варианта осуществления, по меньшей мере, один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбран из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают:

и

В одном из примеров варианта осуществления только один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру, которая включает раскрытые выше модифицирующие группы.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает гликозильный фрагмент, выбранный из формул:

где R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает гликозильный фрагмент, выбранный из формул:

где L-(R¹)_w представляет собой член, выбранный из

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления L-(R¹)_W имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбран из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают:

и

В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 1000. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 70, от около 70 до около 150, от около 150 до около 250, от около 250 до около 375 и от около 375 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 10 до около 35, от около 45 до около 65, от около 95 до около 130, от около 210 до около 240, от около 310 до около 370 и от около 420 до около 480. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 15 до около 30. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 50 до около 65. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 100 до около 130. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 210 до около 240. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 310 до около 370. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 430 до около 470.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает гликозильный фрагмент, выбранный из формул:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления образцы в соответствии с указанным вариантом включают:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления гликоPEGилированный пептидный конъюгат по настоящему изобретению выбирают из представленных далее формул:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В представленных выше формулах индекс t представляет собой целое число от 0 до 1 и индекс p представляет собой целое число от 1 до 10. Символ R¹⁵ представляет собой H, OH (например, Gal-OH), сиалильный фрагмент, сиалильную связываюшую группу (то есть сиалильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (Sia-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный сиалильный фрагмент (например, Sia-Sia-L-R¹) ("Sia-Sia^p")), галактозильный фрагмент, галактозильную связывающую группу (то есть галактозильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (Gal-L-R¹) или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный галактозильный фрагмент (например, Sia-Gal-L-R¹) ("Sia-Gal^p")), галактозаминильный фрагмент, галактозаминильную связывающую группу (то есть галактозаминильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (GalNAc-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный галактозаминильный фрагмент (например, Sia-GalNAc-L-R¹) ("Sia-GalNAc^p")), глюкозильный фрагмент, глюкозильную связывающую группу (то есть глюкозильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (Glc-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный глюкозильный фрагмент (например, Sia-Glc-L-R¹) ("Sia-Glc^p")), глюкозаминильный фрагмент, глюкозаминильную связывающую группу (то есть глюкозаминильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (GlcNAc-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный глюкозаминильный фрагмент (например, Sia-GlcNAc-L-R¹) ("Sia-GlcNAc^p")), маннозильный фрагмент, маннозильную связывающую группу (то есть маннозильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (Man-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный маннозильный фрагмент (например, Sia-Man-L-R¹) ("Sia-Man^p")), фукозильный фрагмент, фукозильную связывающую группу (то есть фукозильная связывающая группа-полимерная модифицирующая группа (Fuc-L-R¹), или сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный фукозильный фрагмент (например, Sia-Fuc-L-R¹) ("Sia-Fuc^p")). Примеры полимерных модифицированных сахарильных фрагментов имеют структуру в соответствии с формулами I, Ia, II или IIa. Примеры пептидных конъюгатов по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, один гликан, содержащий R¹⁵, который включает структуру в соответствии с формулами I, Ia, II и IIa. Кислород со свободной валентностью в формулах I, Ia, II или IIa предпочтительно присоединен через гликозидную связь к углероду в Gal или GalNAc фрагменте. В следующем примере варианта осуществления кислород присоединен к углероду в положении 3 остатка галактозы. В одном из примеров варианта осуществления модифицированная сиаловая кислота связана α2,3- с остатком галактозы. В другом примере варианта осуществления сиаловая кислота связана α2,6- с остатком галактозы.

В одном из примеров варианта осуществления сиалильная связывающая группа представляет собой сиалильный фрагмент, с которым связан полимерный модифицированный сиалильный фрагмент (например, Sia-Sia-L-R¹) ("Sia-Sia^p"). В настоящем описании гликозильная связывающая группа связана с галактозильным фрагментом через сиалильный фрагмент:

Примерные виды в соответствии с указанным фрагментом получают, осуществляя конъюгирование Sia-L-R¹ с концевой сиаловой кислотой гликана, используя фермент, который образует Sia-Siа связи, например, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III и ST8Sia-IV.

В другом примере варианта осуществления гликаны у пептидных конъюгатов имеют формулу, которую выбирают из группы:

и их комбинаций.

В каждой из приведенных выше формул R¹⁵ имеет обсуждавшиеся выше значения. Кроме того, примерный пептидный конъюгат по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, один гликан с R¹⁵ фрагментом, структура которого соответствует формулам I, Ia, II или IIa.

В другом примере варианта осуществления гликозильная связывающая группа включает, по меньшей мере, одну гликозильную связывающую группу формулы:

и

где R¹⁵ представляет собой сиалильную связывающую группу; и индекс p представляет собой целое число, выбранное из 1-10.

В одном из примеров варианта осуществления гликозильный связывающий фрагмент имеет формулу:

где b представляет собой целое число от 0 до 1. Индекс s представляет собой целое число от 1 до 10; и индекс f представляет собой целое число от 1 до 2500.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа представляет собой PEG. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 20 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 5 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 10 кДа. В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент имеет молекулярный вес около 40 кДа. В других примерах вариантов осуществления модифицирующая группа представляет собой разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль), с молекулярным весом, по меньшей мере, около 80 кДа, предпочтительно, по меньшей мере, около 100 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 120 кДа, по меньшей мере, около 140 кДа или, по меньшей мере, около 160 кДа. Еще в другом варианте осуществления разветвленный поли(алкиленоксид), например, поли(этиленгликоль), имеет, по меньшей мере, около 200 кДа, например, от, по меньшей мере, около 80 кДа до, по меньшей мере, около 200 кДа, включая, по меньшей мере, около 160 кДа и, по меньшей мере, около 180 кДа.

В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой линейный SA-PEG-10 кДа фрагмент, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно связана с пептидом. В другом примере варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой линейный SA-PEG-20 кДа фрагмент, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно связаны с пептидом. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой линейный SA-PEG-5 кДа фрагмент, и одна, две или три из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно связаны с пептидом. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой линейный SA-PEG-40 кДа фрагмент, и одна или две из указанных гликозильных связывающих групп ковалентно связаны с пептидом.

В другом примере варианта осуществления гликозильная связывающая группа представляет собой сиалильную связывающую группу формулы:

В другом примере варианта осуществления Q представляет собой член, выбранный из H и CH₃. В другом примере варианта осуществления указанная гликозильная связывающая группа имеет формулу:

и

где R¹⁵ представляет собой указанную сиалильную связывающую группу; и индекс p представляет собой целое число, выбранное из 1-10. В одном из примеров варианта осуществления гликозильная связывающая группа включает формулу:

где индекс b представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1. В одном из примеров варианта осуществления индекс s равен 1; и индекс f представляет собой целое число от около 200 до около 300.

II. D. Модифицирующие группы

Пептидные конъюгаты по настоящему изобретению включают модифицирующую группу. Указанная группа может быть ковалентно связана с пептидом через аминокислоту или гликозильную связывающую группу. В другом примере варианта осуществления, если модифицирующая группа включает фрагмент:

и пептид в пептидном конъюгате представляет собой член, выбранный из пептидов, представленных на фиг.7.

В другом примере варианта осуществления пептидом в пептидном конъюгате является представитель, выбранный из морфогенетических белков кости (например, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), нейротрофинов (например, NT-3, NT-4, NT-5), факторов роста и дифференциации (например, GDF-5), нейротрофического фактора, выделенного из линии глиальных клеток (GDNF), нейротрофического фактора, выделенного из головного мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), протеазы фактора фон Виллебранда (vWF), фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XI, фактора VIII без B-домена, слитого белка vWF-фактор VIII, содержащего полноразмерный фактор VIII, слитого белка vWF-фактор VIII с удаленным B-доменом фактора VIII, эритропоэтина (EPO), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона альфа, интерферона бета, интерферона гамма, α₁-антитрипсина (ATT, или ингибитор α-1 протеазы), глюкоцереброзидазы, активатора плазминогена тканевого типа (TPA), интерлейкина-2 (IL-2), урокиназы, ДНКазы человека, инсулина, поверхностного белка гепатита B (HbsAg), гормона роста человека, слитого белка рецептора TNF - Fc-участка IgG (Enbrel™), моноклонального антитела против HER2 (Herceptin™), моноклонального антитела к белку F респираторного синцитиального вируса (Synagis™), моноклонального антитела против TNF-α (Remicade™), моноклонального антитела к гликопротеину IIb/IIIa (Reopro™), моноклонального антитела к CD20 (Rituxan™), анти-тромбина III (AT III), хорионического гонадотропина человека (hCG), альфа-галактозидазы (Fabrazyme™), альфа-идуронидазы (Aldurazyme™), фолликулостимулирующего гормона, бета-глюкозидазы, моноклонального антитела против TNF-альфа (MLB 5075), глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоно-подобного пептида-2 (GLP-2), бета-глюкозидазы, альфа-галактозидазы A и фактора роста фибробластов. Термин "модифицирующие группы" может охватывать различные структуры, включая направляющие фрагменты, терапевтические фрагменты, биомолекулы. Кроме того, термин "модифицирующие группы" включает полимерные модифицирующие группы, которые представляют собой полимеры, которые могут изменять свойства пептида, такие как его биодоступность и/или его срок полувыведения из организма.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру, которая включает следующие формулы:

и

В другом примере варианта осуществления в соответствии с представленной выше формулой полимерная модифицирующая группа включает фрагмент в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый представляет собой член, выбранный из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают фрагменты:

и

Для удобства модифицирующие группы в остальной части указанного раздела будут в основном основываться на полимерных модифицирующих группах, таких как водорастворимые и нерастворяющиеся в воде полимеры. Однако, как должно быть понятно специалистам в данной области, другие модифицирующие группы, такие как направляющие фрагменты, терапевтические фрагменты и биомолекулы, можно использовать вместо полимерных модифицирующих групп. Кроме того, как должно быть понятно специалистам в данной области, ссылка на использование представленных выше разветвленных PEG структур сделана просто для простоты иллюстрации, и PEG может быть заменен практически любым полимерным фрагментом, включая, без ограничений, виды, представленные в настоящем описании в определении "полимерный фрагмент".

II. D. i. Линкеры модифицирующих групп

Линкеры модифицирующих групп служат для присоединения модифицирующей группы (например, полимерной модифицирующей группы, направляющего фрагмента, терапевтического фрагмента и биомолекулы) к пептиду. В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа связана с гликозильной связывающей группой обычно через гетероатом, например, азот ядра, через линкер L, как представлено далее:

R¹ представляет собой полимерный фрагмент и L выбран из связи и связывающей группы. Индекс w представляет собой целое число, выбранное из 1-6, предпочтительно 1-3 и более предпочтительно 1-2. Примеры связывающих групп включают замещенный или незамещенный алкил, замещенные или незамещенные гетероалкильные фрагменты и сиаловую кислоту. Примерным компонентом линкера является ацильный фрагмент.

Примеры соединений по настоящему изобретению имеют структуру в соответствии с представленными выше формулами I, Ia, II или IIa, где, по меньшей мере, один из R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ или R^6' имеет формулу:

В другом примере рассматриваемого варианта осуществления, по меньшей мере, один из R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ или R^6' имеет формулу:

где s представляет собой целое число от 0 до 20 и R¹ представляет собой линейный полимерный модифицирующий фрагмент.

В одном из примеров варианта осуществления конструкция полимерная модифицирующая группа-линкер представляет собой разветвленную структуру, которая включает две или более полимерные цепочки, присоединенные к центральному фрагменту. В указанном варианте осуществления конструкция имеет формулу:

где R¹ и L имеют указанные выше значения и w' представляет собой целое число от 2 до 6, предпочтительно от 2 до 4 и более предпочтительно от 2 до 3.

Если L представляет собой связь, она образована между реакционноспособной функциональной группой предшественника R¹ и реакционноспособной функциональной группой комплементарной реакционной способности сахарильного ядра. Если L представляет собой линкер ненулевого порядка, вместо L может быть предшественник на гликозильном фрагменте до реакции с предшественником R¹. Альтернативно, предшественники R¹ и L могут быть включены в предварительно сформированную кассету, которую затем присоединяют к гликозильному фрагменту. Как указано в настоящем описании, выбор и получение предшественников с соответствующими реакционноспособными функциональными группами находятся в сфере знаний специалистов в данной области. Кроме того, присоединение предшественников происходит в результате химических реакций, хорошо известных специалистам.

В одном из примеров варианта осуществления L представляет собой связывающую группу, которая образована из аминокислоты или небольшого пептида (например, остатков 1-4 аминокислот), обеспечивая получение модифицированного сахара, в котором полимерная модифицирующая группа присоединена через замещенный алкильный линкер. Примеры линкеров включают глицин, лизин, серин и цистеин. PEG фрагмент может быть присоединен к аминному фрагменту линкера через амидную или уретановую связь. PEG связан с атомом серы или кислорода цистеина и серина через тиоэфирную или эфирную связи, соответственно.

В одном из примеров варианта осуществления R⁵ включает полимерную модифицирующую группу. В другом примере варианта осуществления R⁵ включает и полимерную модифицирующую группу и линкер L, соединяющий модифицирующую группу с остальной частью молекулы. Как обсуждалось выше, L может быть линейной или разветвленной структурой. Аналогично, полимерная модифицирующая группа может быть разветвленной или неразветвленной.

II. D. ii. Водорастворимые полимеры

Многие водорастворимые полимеры известны специалистам в данной области и их можно использовать в практике настоящего изобретения. Термин водорастворимый полимер включает такие соединения, как сахариды (например, декстран, амилозу, гиалуроновую кислоту, поли(сиаловую кислоту), гепараны, гепарины и т.д.); поли(аминокислоты), например, поли(аспаргиновую кислоту) и поли(глутаминовую кислоту); нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры (например, поли(акриловую кислоту), поли(простые эфиры), например, поли(этиленгликоль); пептиды, белки и т.п. Настоящее изобретение можно осуществить, используя любые водорастворимые полимеры с одним ограничением: используемый полимер должен включать сайт, по которому можно присоединить остальную часть конъюгата.

Способы активации полимеров можно также найти в WO 94/17039, патент США No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, патент США No. 5219564, патент США No. 5122614, WO 90/13540, патент США No. 5281698 и WO 93/15189, и для конъюгации активированных полимеров и пептидов, например: коагуляционный фактор VIII (WO 94/15625), гемоглобин (WO 94/09027), переносящие кислород молекулы (патент США No. 4412989), рибонуклеаза и супероксиддисмутаза (Veronese at al, App. Biochem. Biotech. 11: 141-45(1985)).

Примерами водорастворимых полимеров являются полимеры, в которых существенная доля полимерных молекул в образце полимера характеризуется приблизительно одинаковым молекулярным весом; такие полимеры являются "гомодисперсными."

Настоящее изобретение далее иллюстрируют со ссылкой на конъюгат поли(этиленгликоля). Доступны некоторые обзоры и монографии, относящиеся к функционализации и конъюгированию PEG. См., например, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); и Bhadra, et.al, Pharmazie, 57:5-29 (2002). Способы получения реакционноспособных PEG молекул и образования конъюгатов с использованием реакционноспособных молекул известны специалистам. Например, в патенте США No. 5672662 раскрыт водорастворимый и нерастворимый в воде конъюгат активного сложного эфира полимерной кислоты, выбранной из линейных или разветвленных поли(алкиленоксидов), поли(оксиэтилинированных полиолей), поли(олефиновых спиртов) и поли(акриломорфолина).

В патенте США No. 6376604 представлен способ получения водорастворимого 1-бензотриазолилкарбонатного сложного эфира водорастворимого и непептидного полимера в результате реакции по концевому гидроксилу полимера с ди(1-бензотриазолил)карбонатом в органическом растворителе. Активный сложный эфир используют для образования конъюгатов с биологически активным агентом, таким как белок или пептид.

В WO 99/45964 раскрыт конъюгат, включающий биологически активный агент и активированный водорастворимый полимер, включающий полимерный скелет, в котором, по меньшей мере, один конец связан с полимерным скелетом стабильной связью, где, по меньшей мере, один конец включает разветвленный фрагмент, содержащий проксимальные реакционноспособные группы, связанные с разветвленным фрагментом, в котором биологически активный агент связан с, по меньшей мере, одной из проксимальных реакционноспособных групп. Другие разветвленные поли(этиленгликоли) раскрыты в WO 96/21469, патент США No. 5932462 раскрывает конъюгат, образованный с молекулой разветвленного PEG, которая включает разветвленный конец, который включает реакционноспособные функциональные группы. Свободные реакционноспособные группы могут реагировать с биологически активными соединениями, такими как белок или пептид, образуя конъюгаты поли(этиленгликоля) и биологически активных соединений. В патенте США No. 5446090 раскрыт бифункциональный PEG линкер и его использование при формировании конъюгатов, содержащих пептид у каждого конца PEG линкера.

Конъюгаты, которые включают разлагаемые PEG связи, раскрыты в WO 99/34833 и WO 99/14259, также как в патенте США No. 6348558. Такие разлагаемые связи можно использовать в настоящем изобретении.

Известные специалистам способы полимерной активации используют в контексте настоящего изобретения при образовании представленных в настоящем описании разветвленных полимеров и также при конъюгировании указанных разветвленных полимеров с другими соединениями, например, сахарами, нуклеотидами сахаров и т.п.

Примерами водорастворимых полимеров являются поли(этиленгликоли), например метокси-поли(этиленгликоль). Поли(этиленгликоль), который используют в настоящем изобретении не ограничен какой-либо конкретной формой или интервалом молекулярных весов. Для молекул неразветвленного поли(этиленгликоля) молекулярный вес составляет предпочтительно от 500 до 100000. Предпочтительно используют соединения с молекулярным весом 2000-60000 и предпочтительно от около 5000 до около 40000.

II. D. iii. Разветвленные водорастворимые полимеры

В другом варианте полимерный модифицирующий фрагмент представляет собой разветвленную PEG структуру, содержащую более одного линейного или разветвленного присоединенного PEG фрагмента. Примеры разветвленных PEG раскрыты в патенте США No. 5932462; в патенте США No. 5342940; в патенте США No. 5643575; в патенте США No. 5919455; в патенте США No. 6113906; в патенте США No. 5183660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); и Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998.

Примеры полимерных модифицирующих фрагментов включают структуры, основу которых составляют аминокислоты, содержащие боковые цепи, например серин, цистеин, лизин и небольшие пептиды, например, lys-lys. В некоторых вариантах осуществления полимерный модифицирующий фрагмент представляет собой разветвленный PEG фрагмент, который основан на олигопептиде, таком как три-лизиновый пептид. Примеры аминокислот, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают лизин, цистеин и серин. В таких вариантах осуществления каждая полимерная субъединица, присоединенная к пептидной структуре, может быть или линейным PEG фрагментом, или разветвленным PEG фрагментом. Например, три-лизин может быть моно-, ди-, три- или тетра-PEGилирован линейными PEG фрагментами, разветвленными PEG фрагментами, или комбинациями линейных и разветвленных PEG фрагментов. Примеры разветвленных структур включают следующие фрагменты:

Как должно быть понятно специалистам в данной области свободный амин в ди-лизиновых структурах может также быть PEGилирован через амидную или уретановую связь или линейным PEG фрагментом, или разветвленным PEG фрагментом.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что при добавлении представленных выше линейных PEG структур, разветвленные полимеры, примеры которых приведены в предыдущем разделе, могут также быть присоединены к разветвленному фрагменту (например, цистеину, серину, лизину и олигомерам лизина) вместо одной или более линейных PEG структур. Кроме того, как должно быть понятно специалистам в данной области, ссылка на представленные выше PEG структуры дана просто для простоты иллюстрации, причем PEG может быть заменен практически любым полимерным фрагментом, включая, без ограничений, представленные выше образцы в определении "полимерный фрагмент".

В настоящем изобретении может быть использован PEG с любым молекулярным весом, например, 1 кДа, 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, 40 кДа и 45 кДа. В настоящем изобретении может быть также использован PEG с большим молекулярным весом, включая значения вплоть до около 200 кДа, например, по меньшей мере, около 180 кДа, около 160 кДа, около 140 кДа, около 120 кДа, около 100 кДа, около 90 кДа, около 80 кДа, и около 70 кДа. В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес PEG составляет около 80 кДа. В других вариантах осуществления молекулярный вес PEG составляет, по меньшей мере, около 200 кДа, по меньшей мере, около 180 кДа, по меньшей мере, около 160 кДа, или, по меньшей мере, около 140 кДа.

Каждый PEG фрагмент разветвленного полимерного модифицирующего фрагмента может иметь молекулярный вес, как определено выше, или полный молекулярный вес всех PEG фрагментов полимерного модифицирующего фрагмента может иметь определенные выше значения. Например, в некоторых вариантах осуществления каждый PEG фрагмент разветвленного полимерного модифицирующего фрагмента может составлять около 80 кДа или полный молекулярный вес всех PEG фрагментов полимерного модифицирующего фрагмента может составлять около 80 кДа. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления каждый PEG фрагмент разветвленного полимерного модифицирующего фрагмента может составлять около 200 кДа или полный молекулярный вес всех PEG фрагментов полимерного модифицирующего фрагмента может составлять около 200 кДа.

Примеры образцов в соответствии с указанным вариантом осуществления имеют формулы:

где индексы e, f и f' независимо представляют выбранные целые числа от 1 до 2500; и индексы q, q' и q" представляют собой независимо выбранные целые числа от 1 до 20.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, разветвленные полимеры, которые используют в настоящем изобретении, включают варианты тех, что представлены выше. Например, представленный выше конъюгат ди-лизин-PEG может включать три полимерные субъединицы, причем третья связана с α-амином, изображенным как не модифицированный в вышеприведенной структуре. Аналогично, в объем изобретения включено использование три-лизина, функционализированного тремя или четырьмя полимерными субъединицами, отмеченными полимерным модифицирующим фрагментом соответствующим образом.

Как обсуждалось выше, PEG, использованные в конъюгатах по настоящему изобретению, могут быть линейными или разветвленными. Примерный предшественник, который используют для создания разветвленных PEG-содержащих пептидных конъюгатов в соответствии с указанным вариантом настоящего изобретения, имеет формулу:

Другой пример предшественника, который можно использовать для образования разветвленных PEG-содержащих пептидных конъюгатов в соответствии с указанным вариантом настоящего изобретения, имеет формулу:

Образцы разветвленных полимеров в соответствии с указанной формулой являются практически чистыми водорастворимыми полимерами. X^3' представляет собой фрагмент, который включает ионизируемую (например, OH, COOH, H₂PO₄, HSO₃, HPO₃ и их соли и т.д.) или другую реакционноспособную функциональную группу, например, infra. C представляет собой углерод. X⁵, R¹⁶ и R¹⁷ независимо выбирают из не реакционноспособных групп и полимерных фрагментов (например, поли(алкиленоксида), например, PEG). Нереакционноспособные группы включают группы, которые, как считают, являются практически нереакционноспособными, нейтральными и/или стабильными при физиологических значениях pH, например, H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и т.п. Пример полимерного фрагмента включает разветвленные структуры, представленные формулой IIIa и ее примерами. Как должно быть понятно специалистам в данной области, PEG фрагмент в указанных формулах может быть заменен другими полимерами. Примеры полимеров включают полимеры из семейства поли(алкиленоксидов), (например, H, незамещенного алкила, незамещенного гетероалкила) и полимерные ответвления (например, PEG). X² и X⁴ являются связывающими фрагментами, которые предпочтительно существенно не реакционноспособны в физиологических условиях, которые могут быть одинаковыми или различными. Примеры линкеров не включают ни ароматические, ни сложноэфирные фрагменты. Альтернативно, указанные связи могут включать один или более из фрагментов, которые сконструированы так, чтобы разлагаться в физиологически значимых условиях, например сложные эфиры, дисульфиды и т.д. X² и X⁴ присоединяют полимерные ответвления R¹⁶ и R¹⁷ к C. Если X³ подвергают взаимодействию с реакционноспособной функциональной группой комплементарной реакционной способности на линкере, сахаре или кассете линкер-сахар, X^3' превращается в компонент связывающего фрагмента X³.

Примеры связывающих фрагментов для X², X³ и X⁴ независимо выбраны и включают S, SC(О)NH, HNC(О)S, SC(О)О, O, NH, NHC(O), (O)CNH и NHC(О)О и OC(О)NH, CH₂S, CH₂О, CH₂CH₂О, CH₂CH₂S, (CH₂)₀О, (CH₂)₀S или (CH₂)₀Y'-PEG , где Y' представляет собой S, NH, NHC(O), C(О)NH, NHC(О)О, OC(О)NH, или O, и o представляет собой целое число от 1 до 50. В одном из примеров варианта осуществления связывающие фрагменты X² и X⁴ являются различными связывающими фрагментами.

В одном из примеров варианта осуществления предшественник (формула III), или его активированное производное, подвергают взаимодействию с сахаром и, тем самым, связывают его с сахаром, активированным сахаром или сахарным нуклеотидом в результате реакции между X^3' и группой с комплементарной реакционной способностью на сахарном фрагменте, например амине. Альтернативно, X^3' реагирует с реакционноспособной функциональной группой на предшественнике линкера, L. Один или более из R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ или R⁶' в формулах I, Ia, II или IIa может включать разветвленный полимерный модифицирующий фрагмент, или указанный фрагмент связан через L.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру, включающую фрагмент в соответствии со следующими формулами:

и

В другом примере варианта осуществления в соответствии с представленной выше формулой разветвленный полимер имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбран из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерной модифицирующей группы в соответствии с указанным вариантом включают фрагмент:

и

В одном из примеров варианта осуществления фрагмент:

представляет собой линкерное ответвление, L. В указанном варианте примерный линкер получают из природной или неприродной аминокислоты, аминокислотного аналога или имитатора аминокислоты, или небольшого пептида, образованного из одного или более таких видов. Например, некоторые разветвленные полимеры, встречающиеся в соединениях по настоящему изобретению, имеют формулу:

X^a представляет собой связывающий фрагмент, который образован в результате реакции реакционноспособной функциональной группы, например, X^3', на предшественнике разветвленного полимерного модифицирующего фрагмента, и реакционноспособной функциональной группой сахарного фрагмента, или предшественника линкера. Например, если X^3' представляет собой карбоновую кислоту, ее можно активировать и связать непосредственно с аминной группой - подвеской у аминосахарида (например, Sia, GalNH₂, GlcNН₂, ManNH₂ и т.д.), образуя X^a, то есть амид. Дополнительные примеры реакционноспособных функциональных групп и активированных предшественников раскрыты далее. Индекс c представляет собой целое число от 1 до 10. Другие символы имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления X^a представляет собой связывающий фрагмент, образованный с другим линкером:

где X^b представляет собой второй связывающий фрагмент и его независимо выбирают из группы значений, представленных для X^a, и, аналогично L, L¹ представляет собой связь, замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкил.

Примеры образцов для X^a и X^b включают S, SC(О)NH, HNC(О)S, SC(О)О, O, NH, NHC(O), C(О)NH и NHC(О)О, и OC(О)NH.

В другом примере варианта осуществления X⁴ представляет собой пептидную связь с R¹⁷, который представляет собой аминокислоту, ди-пептид (например, Lys-Lys) или три-пептид (например, Lys-Lys-Lys), где альфа-аминный фрагмент(фрагменты) и/или гетероатом(гетероатомы) в боковой цепи модифицированы полимерным модифицирующим фрагментом.

В следующем примере варианта осуществления пептидные конъюгаты по настоящему изобретению включают фрагмент, например R¹⁵ фрагмент, который имеет формулу, которая выбрана из

и

и

где значения радикалов, представленных различными символами, имеют обсуждавшиеся выше значения. L^a представляет собой связь или линкер, как обсуждалось выше для L и L¹, например замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероалкильный фрагмент. В одном из примеров варианта осуществления L^a представляет собой фрагмент боковой цепи сиаловой кислоты, которая функционализирована полимерным модифицирующим фрагментом, как показано. Примеры L^a фрагментов включают замещенные или незамещенные алкильные цепочки, которые включают один или более из OH или NH₂.

В еще одном примерном варианте осуществления настоящего изобретения предложены пептидные конъюгаты, содержащие фрагмент, например R¹⁵ фрагмент формулы:

и

где значения радикалов, представленных различными символами, имеют обсуждавшиеся выше значения. Как должно быть понятно специалистам в данной области, линкерное ответвление в формулах VIII и IX одинаково применимо к другим, представленным в настоящем описании модифицированным сахарам. В одном из примеров варианта осуществления образцы, представленные формулами VIII и IX, представляют собой R¹⁵ фрагменты, присоединенные к представленным далее гликановым структурам.

В еще одном примере вариантов осуществления пептидный конъюгат включает R¹⁵ фрагмент, формула которого представляет собой член, выбранный из:

и

где значения радикалов, представленных различными символами, имеют обсуждавшиеся выше значения. Примерный образец для L^a представляет собой -(CH₂)_jC(О)NH(CH₂)_hC(О)NH-, где индексы h и j независимо выбраны из целых чисел от 0 до 10. Дальнейшие примеры образцов представляют собой -C(О)NH-. Индексы m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от 0 до 5000. A¹, A², A³, A⁴, A⁵, A⁶, A⁷, A⁸, A⁹, A¹⁰ и A¹¹ представляют собой члены, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, -NA¹²A¹³, -OA¹² и -SiA¹²A¹³. A¹² и A¹³ представляют собой члены, независимо выбранные из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила.

Представленные выше варианты настоящего изобретения иллюстрируются далее примерами со ссылкой на образцы, в которых полимер представляет собой водорастворимый полимер, в частности поли(этиленгликоль) ("PEG"), например, метокси-поли(этиленгликоль). Как должно быть понятно специалистам в данной области, центр внимания в следующих разделах для четкости иллюстрации сосредоточен на представленных далее фрагментах, использующих PEG в качестве примерных полимеров, что в равной степени применимо к вариантам, в которых используют полимер, который отличается от PEG.

В одном из примеров варианта осуществления фрагмент R¹⁵ имеет формулу, которая представляет собой член, выбранный из группы:

В каждой из представленных выше структур линкерный фрагмент -NH(CH₂)_a- может присутствовать или отсутствовать.

В других примерах вариантов осуществления пептидный конъюгат включает фрагмент R¹⁵, выбранный из группы:

В каждой из представленных выше формул индексы e и f независимо выбирают из целых чисел от 1 до 2500. В следующих примерах вариантов осуществления e и f выбирают так, чтобы получить фрагмент PEG с молекулярным весом около 1 кДа, 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, 40 кДа и 45 кДа. В настоящем изобретении можно также использовать PEG большего молекулярного веса, включая вплоть до около 200 кДа, такие как, по меньшей мере, около 180 кДа, около 160 кДа, около 140 кДа, около 120 кДа, около 100 кДа, около 90 кДа, около 80 кДа и около 70 кДа. В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес PEG составляет около 80 кДа. В других вариантах осуществления молекулярный вес PEG составляет, по меньшей мере, около 200 кДа, по меньшей мере, около 180 кДа, по меньшей мере, около 160 кДа, или, по меньшей мере, около 140 кДа. Символ Q представляет собой замещенный или незамещенный алкил (например, C₁-С₆ алкил, например, метил), замещенный или незамещенный гетероалкил или H.

Другие разветвленные полимеры имеют структуры, основанные на ди-лизиновых (Lys-Lys) пептидах, например:

и три-лизиновых (Lys-Lys-Lys) пептидах, например,

В каждой из представленных выше формул индексы e, f', и f" представляют целые числа, независимо выбранные из 1-2500. Индексы q, q' и q" представляют целые числа, независимо выбранные из 1-20. Как должно быть понятно специалистам в данной области, кроме представленных выше линейных PEG структур разветвленные полимеры, примеры которых представлены в предыдущих разделах, могут быть также присоединены к разветвленному фрагменту (например, лизину и олигомерам лизина) вместо одной или более из линейных PEG структур.

В другом примере варианта осуществления модифицирующая группа:

имеет формулу, которая представляет собой член, выбранный из:

и

где Q представляет собой член, выбранный из H и замещенного или незамещенного C₁-С₆ алкила. Индексы е и f представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500, и индекс q представляют собой целое число, выбранное из 0-20.

В другом примере варианта осуществления модифицированная группа :

имеет формулу, представляющую группу, выбранную из

где Q представляет собой член, выбранный из H и замещенного или незамещенного C₁-С₆ алкила. Индексы f и f' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500, и индексы q и q' представляют собой целое число, выбранное из 1-20.

В другом примере варианта осуществления разветвленный полимер имеет структуру, включающую фрагмент в соответствии со следующей формулой:

где индексы m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-5000. A¹, A², A³, A⁴, A⁵, A⁶, A⁷, A⁸, A⁹, A¹⁰ и A¹¹ представляют собой целые числа, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, -NA¹²A¹³, -OA¹² и -SiA¹²A¹³. A¹² и A¹³ представляют собой члены, независимо выбранные из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила.

Формула IIIa представляет собой подмножество формулы III. Структуры, раскрываемые формулой IIIa, также включены в формулу III.

В одном из примеров варианта осуществления полимерная модифицирующая группа имеет структуру, включающую фрагмент в соответствии со следующими формулами:

и

В другом примере варианта осуществления в соответствии с представленной выше формулой разветвленный полимер имеет структуру, включающую фрагмент в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² представляют собой члены, независимо выбранные из -OH и -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают фрагмент:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В иллюстративном варианте модифицированный сахар представляет собой сиаловую кислоту, и выбранные модифицированные сахарные соединения, используемые в настоящем изобретении, имеют формулы:

и

Индексы a, b и d представляют собой целые числа от 0 до 20. Индекс c представляет собой целое число от 1 до 2500. Представленные выше структуры могут быть компонентами R¹⁵.

В другом иллюстративном варианте осуществления первичный гидроксильный фрагмент сахара функционализирован модифицирующей группой. Например, 9-гидроксил сиаловой кислоты можно превратить в соответствующий амин и функционализировать для получения соединения в соответствии с настоящим изобретением. Формулы в соответствии с указанным вариантом включают:

Представленные выше структуры могут быть компонентами R¹⁵.

Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано в предыдущих разделах со ссылкой на PEG, специалистам в данной области должно быть понятно, что целый ряд полимерных модифицирующих фрагментов можно использовать в соединениях и в способах, которые представлены в настоящем описании.

В выбранных вариантах осуществления R¹ или L-R¹ представляют собой разветвленный PEG, например, один из образцов, представленных выше. В одном из примеров варианта осуществления разветвленная PEG структура основана на цистеиновом пептиде. Иллюстративные модифицированные сахара в соответствии с указанным вариантом включают:

где X⁴ представляет собой связь или O. В каждой из представленных выше структур алкиламинный линкер -(CH₂)_aNH- может присутствовать или отсутствовать. Представленные выше структуры могут быть компонентами R¹⁵/R^15'.

Как уже обсуждалось, модифицированные полимерами сиаловые кислоты, используемые в настоящем изобретении, могут быть также линейными структурами. Так, в настоящем изобретении предложены конъюгаты, которые включают фрагмент сиаловой кислоты, полученный из такой структуры, как:

где индексы q и e имеют указанные выше значения.

Примерами модифицированных сахаров являются сахара, модифицированые водорастворимыми или нерастворяющимися в воде полимерами. Примеры полимеров, которые можно использовать в настоящем изобретении, представлены далее.

В другом примере варианта осуществления пептид получают из клеток насекомых, преображенных путем добавления GlcNAc и Gal к маннозному ядру и гликоPEGилированных с помощью сиаловой кислоты, содержащей линейный PEG фрагмент, получая в итоге пептид, который включает, по меньшей мере, один фрагмент формулы:

где индекс t представляет собой целое число от 0 до 1; индекс s представляет собой целое число от 1 до 10; и индекс f представляет собой целое число от 1 до 2500.

В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предложен пептидный конъюгат, включающий следующую гликозильную связывающую группу:

D представляет собой член, выбранный из -OH и R¹-L-HN; G представляет собой член, выбранный из R¹-L- и -C(О)(C₁-С₆)алкил-R¹; R¹ представляет собой фрагмент, включающий член, выбранный из неразветвленного остатка поли(этиленгликоля) и остатка разветвленного поли(этиленгликоля); и M представляет собой член, выбранный из H, солевого противоиона и единичного отрицательного заряда; L представляет собой линкер, который представляет собой член, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В одном из примеров варианта осуществления, если D представляет собой OH, то G представляет собой R¹-L-. В другом примере варианта осуществления, если G представляет собой -C(О)(C₁-С₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NH-.

В одном из примеров варианта осуществления L-R¹ имеет формулу:

где a представляет собой целое число, выбранное из 0-20.

В одном из примеров варианта осуществления R¹ имеет структуру, которая включает фрагмент, выбранный из:

и

где e, f, m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q представляет собой целое число, выбранное из 0-20.

В одном из примеров варианта осуществления R¹ имеет структуру, которая является членом, выбранным из:

где e, f и f' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q и q' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-20.

В другом примере варианта осуществления R¹ имеет структуру, которая представляет собой член, выбранный из:

и

где e, f и f' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q и q' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-20.

В другом примере варианта осуществления R¹ имеет структуру, которая представляет собой член, выбранный из:

где e и f представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500.

В другом примере варианта осуществления гликозильный линкер имеет формулу:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один из указанных гликозильных линкеров в соответствии с формулой, выбранной из:

где D и G имеют указанные выше значения, AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептидного конъюгата и t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один из указанных гликозильных линкеров, где каждый из указанных гликозильных линкеров имеет структуру, которая представляет собой член, независимо выбранный из следующих формул:

где D и G имеют указанные выше значения, AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептидного конъюгата и t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один из указанных гликозильных линкеров в соответствии с формулой, выбранной из:

и

где D и G имеют указанные выше значения, AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептидного конъюгата и t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 0 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 1 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один из указанных гликозильных линкеров в соответствии с формулой, выбранной из:

и

где D и G имеют указанные выше значения, AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептидного конъюгата и t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 0 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 1 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G.

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один из указанных гликозильных линкеров в соответствии с формулой, выбранной из:

где D и G имеют указанные выше значения, AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептидного конъюгата и t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 0 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G. В одном из примеров варианта осуществления отсутствует член, выбранный из 1 и 2 сиалильных фрагментов, которые не включают G.

В другом примере варианта осуществления в настоящем изобретении предложен пептид, который получен в подходящем хозяине. В настоящем изобретении предложены также способы экспрессирования указанного пептида. В другом примере варианта осуществления хозяином является экспрессионная система млекопитающих.

В другом примере варианта осуществления в настоящем изобретении предложен способ лечения состояния нуждающегося в этом субъекта, причем указанное состояние характеризуется тем, что подавляет способность к свертыванию крови у указанного субъекта, причем указанный способ включает стадию введения субъекту такого количества пептидного конъюгата по настоящему изобретению, которое эффективно для облегчения указанного состояния у указанного субъекта. В другом примере варианта осуществления указанный способ включает введение указанному млекопитающему некоторого количества пептидного конъюгата, полученного в соответствии с раскрытыми в настоящем описании способами.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ создания пептидного конъюгата, включающего раскрытый в настоящем описании гликозильный линкер. Указанный способ включает (a) приведение в контакт пептида, содержащего гликозильный фрагмент:

с раскрытым в настоящем описании PEGилированным нуклеотидным сахаром и ферментом, который переносит PEGилированный сахар на Gal указанного гликозильного фрагмента в условиях, подходящих для указанного переноса.

В другом примере варианта осуществления фрагмент:

имеет формулу, которая представляет собой член, выбранный из:

где e, f, m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q представляет собой целое число, выбранное из 0-20.

В другом примере варианта осуществления фрагмент:

имеет формулу, которая представляет собой член, выбранный из:

где e, f и f' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q и q' представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-20.

В другом примере варианта осуществления гликозильный линкер включает формулу:

В другом примере варианта осуществления пептидный конъюгат включает, по меньшей мере, один гликозильный линкер формулы:

где АА представляет собой аминокислотный остаток указанного пептида; t представляет собой целое число, выбранное из 0 и 1; и R¹⁵ представляет собой модифицированный сиалильный фрагмент.

В другом примере варианта осуществления указанный способ включает, до стадии (a): (b) экспрессирование указанного пептида в подходящем хозяине.

II. D.iv. Нерастворяющиеся в воде полимеры

В другом варианте осуществления, аналогичном обсуждавшемуся выше, модифицированные сахара включают скорее нерастворяющийся в воде полимер, чем водорастворимый полимер. Конъюгаты по настоящему изобретению могут также включать один или более из нерастворяющихся в воде полимеров. Указанный вариант осуществления настоящего изобретения иллюстрируется на примере использования конъюгата в качестве носителя, вместе с которым доставляется терапевтический пептид контролируемым способом. Полимерные системы доставки лекарств известны специалистам. См., например, Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Как должно быть понятно специалистам в данной области, практически любую известную систему доставки лекарств можно использовать для конъюгатов по настоящему изобретению.

Представленные выше структуры для R¹, L-R¹, R¹⁵, R¹⁵' и других радикалов одинаково применимы к нерастворяющимся в воде полимерам, которые могут быть включены в линейные и разветвленные структуры без ограничений, используя химические методы, хорошо известные специалистам в данной области.

Примеры нерастворяющихся в воде полимеров включают, но ими не ограничиваются, полифосфазины, поли(виниловые спирты), полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинилгалогениды, поливинилпирролидон, полигликолиды, полисилоксаны, полиуретаны, поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат), поли(октадецилакрилат) полиэтилен, полипропилен, поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид), поли(этилентерефталат), поли(винилацетат), поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон, плуроник(и) и поливинилфенол и их сополимеры.

Синтетически модифицированные природные полимеры, которые можно использовать в конъюгатах по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, алкилцеллюлозы, гидроксиалкилцеллюлозы, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы и нитроцеллюлозы. Наиболее предпочтительные члены широкого класса синтетических модифицированных природных полимеров включают, но ими не ограничиваются, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксибутилметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетатбутират целлюлозы, ацетатфталат целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, триацетат целлюлозы, натриевую соль сульфата целлюлозы и полимеры акриловых и метакриловых сложных эфиров и альгиновую кислоту.

Указанные и другие полимеры, обсуждавшиеся в настоящем описании, можно легко получить из коммерческих источников, таких как Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polysciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, WI.), Fluka (Ronkonkoma, NY), и BioRad (Richmond, CA), или синтезировать из мономеров, полученных из указанных источников, используя стандартные методики.

Примеры биоразлагаемых полимеров, которые можно использовать в конъюгатах по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, поли(этилентерефталат), поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту), поли(лактид-co-капролактон), поли(лактид-co-гликолид), полиангидриды, полиортосложные эфиры, их смеси и сополимеры. Особый интерес для использования представляют композиции, которые образуют гели, такие как коллаген, плуроники и т.п.

Полимеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают "гибридные" полимеры, которые включают нерастворяющиеся в воде материалы, содержащие, в, по меньшей мере, части их структуры, биоразлагающуюся молекулу. Примером такого полимера служит полимер, который включает нерастворяющийся в воде coполимер, который содержит с биоразлагающийся участок, гидрофильный участок и множество сшиваемых функциональных групп в полимерной цепи.

Для целей настоящего изобретения термин "нерастворяющиеся в воде материалы" включает материалы, которые практически не растворяются в воде или в содержащих воду средах. Так, хотя некоторые участки или сегменты сополимера могут быть гидрофильными или даже водорастворимыми, полимерная молекула в целом не растворяется в воде до какой-либо существенной степени.

Для целей настоящего изобретения термин "биоразлагающаяся молекула" включает участок, который способен претерпевать метаболизм или разрушаться и рассасываться и/или удаляться в результате нормальной экскреции из организма. Такие метаболиты или разрушенные продукты являются предпочтительно практически нетоксичными для организма.

Биоразлагаемый участок может быть или гидрофобным или гидрофильным, до тех пор, пока coполимерная композиция как целое не становится водорастворимой. Так, биоразрагаемый участок выбирают на основании предпочтительности того, чтобы полимер как целое оставался нерастворяющимся в воде. Соответственно, характеристические свойства, т.е. типы содержащихся функциональных групп и относительное содержание биоразрагаемых участков и гидрофильных участков, выбирают таким образом, чтобы нужная биоразрагаемая композиция оставалась нерастворяющейся в воде.

Примеры рассасывающихся полимеров включают, например, синтетически полученные рассасывающиеся блок-сополимеры поли(α-гидроксикарбоновая кислота)/поли(оксиалкилен) (см. Cohn et al., патент США No. 4826945). Указанные сополимеры не являются сшитыми и растворяются в воде, так что организм может выводить и разлагать указанные блок-coполимерные композиции. См. Younes et al., J Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); и Cohn et al., J Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988).

Предпочтительные в настоящее время биоразлагаемые полимеры включают один или более из компонентов, выбранных из поли(сложных эфиров), поли(гидроксикислот), поли(лактонов), поли(амидов), поли(сложный эфир-амидов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(ортосложных эфиров), поли(карбонатов), поли(фосфазинов), поли(фосфосложных эфиров), поли(тиосложных эфиров), полисахаридов и их смесей. Еще более предпочтительные биоразлагаемые полимеры включают поли(гидрокси)кислотные компоненты. Из поли(гидрокси)кислот предпочтительны полимолочная кислота, полигликолевая кислота, поликапроновая кислота, полимасляная кислота, поливалериановая кислота и их сополимеры и смеси.

Кроме того, для создания фрагментов, которые абсорбируются in vivo ("биоразлагаемые"), предпочтительные полимерные покрытия для использования в указанных способах настоящего изобретения могут также образовывать экскретируемый и/или метаболизируемый фрагмент.

В настоящем изобретении можно также использовать сополимеры более высокого порядка. Например, в патенте США No. 4438253, выданном 20 марта 1984 Casey et al, раскрыты три-блок-сополимеры, полученные в результате трансэтерификации поли(гликолевой кислоты) и заканчивающегося гидроксилом поли(алкиленгликоля). Такие композиции раскрыты для применения в качестве рассасывающихся однониточных сшивок. Гибкость таких композиций регулируется за счет включения в структуру сополимера ароматического ортокарбоната, такого как тетра-p-толилортокарбонат.

Можно также использовать другие полимеры на основе молочной и/или гликолевой кислоты. Например, Spinu, в патенте США No. 5202413, выданном 13 апреля 1993, раскрывает биоразлагаемые мульти-блок-сополимеры, содержащие последовательно упорядоченные блоки полилактида и/или полигликолида, полученные в результате полимеризации с раскрытием кольца лактида и/или гликолида или у олигомерного диола или у диаминового остатка с последующим удлинением цепи ди-функциональным соединением, таким как диизоцианат, диацилхлорид или дихлорсилан.

Биоразлагаемые участки покрытий, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно сконструировать таким образом, чтобы они были гидролитически и/или ферментативно расщепляемыми. Для целей настоящего изобретения термин "гидролитически расщепляемый" относится к способности сополимера, особенно биоразрагаемого участка, гидролизоваться в воде, или в содержащей воду среде. Аналогично, термин "ферментативно расщепляемый" в том смысле, как использован в настоящем описании, относится к способности сополимера, особенно биоразрагаемого участка, расщепляться под действием эндогенных или экзогенных ферментов.

После попадания в организм гидрофильный участок может быть преобразован в экскретируемый и/или метаболизируемый фрагмент. Так, гидрофильный участок может включать, например, простые полиэфиры, полиалкиленоксиды, полиоли, поли(винилпирролидин), поли(виниловый спирт), поли(алкилоксазолины), полисахариды, углеводы, пептиды, белки и их сополимеры и смеси. Кроме того, гидрофильный участок может также быть, например, поли(алкилен)оксидом. Такие поли(алкилен)оксиды могут включать, например, поли(этилен)оксид, поли(пропилен)оксид и их смеси и сополимеры.

Полимеры, которые являются компонентами гидрогелей, также можно использовать в настоящем изобретении. Гидрогели представляют собой полимерные материалы, которые способны абсорбировать относительно большие количества воды. Примеры соединений, которые образуют гидрогели, включают, но ими не ограничиваются, полиакриловые кислоты, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, желатин, карагенан и другие полисахариды, гидроксиэтиленметакриловую кислоту (HEMA), также как их производные и т.п. Можно получить гидрогели, которые являются стабильными, биоразлагаемыми и биорассасываемыми. Более того, композиции гидрогелей могут включать субъединицы, которые проявляют одно или более из указанных свойств.

Биосовместимые композиции гидрогелей, целостность которых можно регулировать за счет сшивок, хорошо известны и в настоящее время предпочтительны для использования в указанных способах настоящего изобретения. Например, Hubbell et al., в патентах США No. 5410016, выданном 25 апреля 1995, и No. 5529914, выданном 25 июня 1996, раскрывают водорастворимые системы, которые представляют собой сшитые блок-сополимеры, содержащие водорастворимый центральный блок-сегмент, расположенный между двумя гидролитически лабильными продолжениями. Такие сополимеры заканчиваются на концах фотополимеризуемыми акрилатными функциональностями. Будучи сшитыми такие системы становятся гидрогелями. Водорастворимый центральный блок таких сополимеров может включать поли(этиленгликоль); тогда как гидролитически лабильные удлинения могут быть поли(α-гидрокси кислотой), такой как полигликолевая кислота или полимолочная кислота. См. Sawhney et al, Macromolecules 26: 581-587 (1993).

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный гель представляет собой термообратимый гель. В настоящее время особенно предпочтительны термообратимые гели, включающие компоненты, такие как плуроник(и), коллаген, желатин, гиалуроновую кислоту, полисахариды, полиуретановый гидрогель, гидрогель полиуретан-мочевина и их комбинации.

В еще одном примерном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению включает в качестве компонента липосомы. Липосомы можно получить известными специалистам способами, например, как раскрыто у Eppstein et al., в патенте США No. 4522811. Например, липосомные композиции можно получить, растворяя подходящий липид (липиды) (такие как стеароилфосфатидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, арахадоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, в результате чего остается тонкая пленка высушенного липида на поверхности контейнера. Затем в контейнер вводят водный раствор активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли. Затем контейнер вращают рукой, чтобы освободить липидный материал с боков контейнера и диспергировать липидные агрегаты, в результате чего образуется липосомная суспензия.

Вышеуказанные микрочастицы и способы получения указанных микрочастиц предложены в качестве примера, и они ни коим образом не определяют объем микрочастиц, которые можно использовать в настоящем изобретении. Как должно быть понятно специалистам в данной области, целый ряд микрочастиц, созданных различными способами, можно использовать в настоящем изобретении.

Обсуждавшиеся выше структурные форматы в контексте водорастворимых полимеров, как с разветвленными цепями, так и с неразветвленными, обычно применимы также и к нерастворяющимся в воде полимерам. Так, например, цистеиновые, сериновые, дилизиновые и трилизиновые разветвленные ядра можно функционализировать двумя нерастворяющимися в воде полимерными фрагментами. Указанные способы, которые используют для получения таких образцов, обычно являются близкими аналогами тех способов, которые используют для получения водорастворимых полимеров.

II. D. v. Способы получения полимерных модифицирующих групп

Полимерные модифицирующие группы можно активировать для реакции с гликозильным или сахарильным фрагментом или аминокислотным фрагментом. Примеры структур активированных образцов (например, карбонатов и активных сложных эфиров) включают:

В представленных выше формулах q представляет собой член, выбранный из 1-40. Другие активирующие или отщепляемые группы, подходящие для активирования линейных и разветвленных PEG, которые можно использовать при получении представленных в настоящем описании соединений, включают, но ими не ограничиваются, образцы:

PEG молекулы, которые активированы указанными и другими образцами, и способы получения активированных PEG представлены в WO 04/083259.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, одно или более из m-PEG ответвлений, представленных выше разветвленных полимеров, может быть заменено PEG фрагментом с отличающимся концом, например, OH, COOH, NH₂, C₂-C₁₀-алкил и т.д. Кроме того, представленные выше структуры можно легко модифицировать, встраивая алкильные линкеры (или удаляя атомы углерода) между α-атомом углерода и функциональной группой аминокислотной боковой цепи. Так, "гомо" производные и высшие гомологи, также как низшие гомологи, попадают в объем центральных ядер для разветвленных PEG, которые можно использовать в настоящем изобретении.

Представленные далее разветвленные образцы PEG легко получить способами, такими как те, что представлены далее на схеме:

где X представляет собой O или S и r представляет собой целое число от 1 до 5. Индексы e и f представляют собой независимо выбранные целые числа от 1 до 2500. В одном из примеров варианта осуществления один или оба из указанных индексов выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса полимера составляла около 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, или 40 кДа. PEG большей молекулярной массы также можно использовать в настоящем изобретении, включая вплоть до около 200 кДа, такие как, по меньшей мере, около 180 кДа, около 160 кДа, около 140 кДа, около 120 кДа, около 100 кДа, около 90 кДа, около 80 кДа и около 70 кДа. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет около 80 кДа. В других вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, около 200 кДа, по меньшей мере, около 180 кДа, по меньшей мере, около 160 кДа, или, по меньшей мере, около 140 кДа.

Так, в соответствии с приведенной схемой осуществляют контактирование природной или неприродной аминокислоты с активированным m-PEG производным, в данном случае тозилатом, получая соединение 1 путем алкилирования гетероатома X^d в боковой цепи. Моно-функциональную m-PEG аминокислоту подвергают взаимодействию с реакционноспособным m-PEG производным в условиях N-ацилирования, тем самым, осуществляя сборку разветвленного m-PEG 2. Как должно быть понятно специалистам в данной области, тозилатная отщепляемая группа может быть заменена любой подходящей отщепляемой группой, например галогеном, мезилатом, трифлатом и т.д. Аналогично, реакционноспособный карбонат, который используют для ацилирования амина, может быть заменен на активный сложный эфир, например, N-гидроксисукцинимид, и т.д., или указанную кислоту можно активировать in situ, используя дегидратирующий агент, такой как дициклогексилкарбодиимид, карбонилдиимидазол и т.д.

В других примерах вариантов осуществления фрагмент мочевины заменяют такой группой, как амид.

II. E. Гомодисперсные композиции пептидных конъюгатов по настоящему изобретению

Кроме предоставления пептидных конъюгатов, которые образуются в результате химического или ферментативного добавления гликозильной связывающей группы, в настоящем изобретении предложены композиции веществ, включающие пептидные конъюгаты, которые в высшей степени гомогенны в характере их замещений. Используя указанные способы настоящего изобретения, можно получать пептидные конъюгаты, в которых существенная часть гликозильных связывающих групп и гликозильных фрагментов во всей популяции пептидных конъюгатов присоединена к структурно идентичной аминокислоте или гликозильному остатку. Так, во втором аспекте в настоящем изобретении предложен пептидный конъюгат, содержащий популяцию водорастворимых полимерных фрагментов, которые ковалентно связаны с указанным пептидом через гликозильную связывающую группу, например интактную гликозильную связывающую группу. В примерном пептидном конъюгате по настоящему изобретению практически каждый из членов популяции водорастворимых полимеров связан через гликозильную связывающую группу с гликозильным остатком указанного пептида, и каждый гликозильный остаток указанного пептида, к которому присоединена гликозильная связывающая группа, имеет одну и ту же структуру.

В настоящем изобретении также предложены аналоги конъюгатов, аналогичные тем, которые раскрыты выше, и в которых указанный пептид конъюгирован с модифицирующей группой, например терапевтическим фрагментом, диагностическим фрагментом, направляющим фрагментом, фрагментом токсина или т.п. через гликозильную связывающую группу. Каждой из вышеуказанных модифицирующих групп может быть небольшая молекула, природный полимер (например, полипептид) или синтетический полимер. Если модифицирующая группа присоединена к сиаловой кислоте, обычно предпочтительно, чтобы указанная модифицирующая группа была практически не флуоресцентной.

В одном из примеров варианта осуществления указанные пептиды по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, один O-связанный или N-связанный сайт гликозилирования, который гликозилирован модифицированным сахаром, который включает полимерную модифицирующую группу, например PEG фрагмент. В одном из примеров варианта осуществления PEG ковалентно связан с указанным пептидом через интактную гликозильную связывающую группу, или через не гликозильный линкер, например замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил. Указанная гликозильная связывающая группа ковалентно связана или с аминокислотным остатком, или гликозильным остатком указанного пептида. Альтернативно, гликозильная связывающая группа присоединена к одному или более из гликозильных звеньев гликопептида. В настоящем изобретении предложены также конъюгаты, в которых гликозильная связывающая группа присоединена как к аминокислотному остатку, так и к гликозильному остатку.

Гликаны на указанных пептидах по настоящему изобретению обычно соответствуют тем, которые находятся на пептиде, который продуцируется клетками млекопитающих (BHK, CHO) или клетками насекомых (например, Sf-9), с последующим ремоделированием в соответствии с указанными в настоящем описании далее способами. Например, полученный из насекомых пептид, который экспрессирован с три-маннозильным ядром, позднее контактируют с донором GlcNAc и GlcNAc трансферазой и с донором Gal и Gal трансферазой. Прикрепление GlcNAc и Gal к три-маннозильному ядру осуществляют или в две стадии, или в одну стадию. Модифицированную сиаловую кислоту добавляют к, по меньшей мере, одной ветви гликозильного фрагмента, как обсуждалось в настоящем описании. Для тех Gal фрагментов, которые не функционализированы модифицированной сиаловой кислотой, необязательно осуществляют "кэппинг" в реакции с донором сиаловой кислоты в присутствии сиалилтрансферазы.

В одном из примеров варианта осуществления, по меньшей мере, 60% концевых Gal фрагментов в популяции пептидов оказываются кэппированными сиаловой кислотой, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% оказываются кэппированы сиаловой кислотой.

II. F. Нуклеотидные сахара

В другом аспекте настоящего изобретения также предложены сахарные нуклеотиды. Примеры образцов в соответствии с указанным вариантом включают:

где y представляет собой целое число, выбранное из 0-2, и, по меньшей мере, один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру, которая является членом, выбранным из

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления, по крайней мере, один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбирают из -OH -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом включают фрагмент:

и

В одном из примеров варианта осуществления только один из R², R³, R⁴, R⁵ или R⁶ имеет структуру, которая включает раскрытые выше модифицирующие группы.

В другом примере варианта осуществления образцы в соответствии с указанным вариантом включают:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления образцы в соответствии с указанным вариантом включают:

где L-(R¹)_w представляет собой член, выбранный из:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления L-(R¹)_w имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбирают из -OH -OCH₃.

Примеры полимерных модифицирующих групп в соответствии с указанным вариантом осуществления включают фрагмент:

и

В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 1000. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 1 до около 70, от около 70 до около 150, от около 150 до около 250, от около 250 до около 375 и от около 375 до около 500. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из от около 10 до около 35, от около 45 до около 65, от около 95 до около 130, от около 210 до около 240, от около 310 до около 370 и от около 420 до около 480. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 15 до около 30. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 50 до около 65. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 100 до около 130. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 210 до около 240. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 310 до около 370. В одном из примеров варианта осуществления m и n представляют собой целые числа, выбранные из от около 430 до около 470.

В другом примере варианта осуществления образцы в соответствии с указанным вариантом включают:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления образцы в соответствии с указанным вариантом включают:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления нуклеотидные сахара имеют формулу, которая является членом, выбранным из:

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления нуклеотидный сахар в соответствии с указанным вариантом имеет структуру:

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления нуклеотидный сахар в соответствии с указанным вариантом имеет структуру:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления нуклеотидный сахар основан на следующей формуле:

где R группы и L представляют собой фрагменты, как обсуждалось выше. Индекс "y" представляет собой 0, 1 или 2. В одном из примеров варианта осуществления L представляет собой связь между NH и R¹. Основание представляют собой основание нуклеиновой кислоты.

В одном из примеров варианта осуществления L-R¹ представляет собой член, выбранный из

где переменные имеют указанные выше значения.

В одном из примеров варианта осуществления L-R¹ имеет структуру в соответствии со следующей формулой:

В одном из примеров варианта осуществления A¹ и A² каждый выбирают из -OH и -OCH₃.

III. Способы

Кроме обсуждавшихся выше конъюгатов в настоящем изобретении предложены способы получения указанных и других конъюгатов. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы профилактики, лечения или облегчения болезненного состояния путем введения конъюгата по настоящему изобретению субъекту, подверженному риску развития заболевания, или субъекту, у которого уже существует указанное заболевание.

В примерах вариантов осуществления указанный конъюгат образуется между полимерным модифицирующим фрагментом и гликозилированным или негликозилированным пептидом. Полимер конъюгирован с указанным пептидом через гликозильную связывающую группу, которая встроена между ними, и ковалентно связан как с указанным пептидом (или гликозильным остатком), так и с модифицирующей группой (например, водорастворимым полимером). Указанный способ включает приведение в контакт указанного пептида со смесью, содержащей модифицированный сахар и фермент, например гликозилтрансферазу, которая осуществляет конъюгирование модифицированного сахара с субстратом. Указанную реакцию ведут в условиях, подходящих для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и указанным пептидом. Сахарный фрагмент модифицированного сахара предпочтительно выбирают из нуклеотидных сахаров. Указанный способ синтеза пептидного конъюгата включает объединение a) сиалидазы; b) фермента, способного катализировать перенос гликозильной связывающей группы, такой как гликозилтрансфераза, экзогликозидаза или эндогликозидаза; c) модифицированного сахара; d) пептида, в результате чего происходит синтез пептидного конъюгата. Реакцию ведут в условиях, подходящих для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и указанным пептидом. Сахарный фрагмент модифицированного сахара предпочтительно выбирают из нуклеотидных сахаров.

В одном из примеров варианта осуществления модифицированный сахар, такой, как были указаны выше, является активированным, как соответствующие нуклеотидные сахара. Примеры сахарных нуклеотидов, которые используют в настоящем изобретении в их модифицированной форме, включают нуклеотидные моно-, ди- или трифосфаты или их аналоги. В предпочтительном варианте осуществления модифицированный сахарный нуклеотид выбирают из UDP-гликозида, CMP-гликозида или GDP-гликозида. Еще более предпочтительно, чтобы часть сахарного нуклеотида модифицированного сахарного нуклеотида была выбрана из UDP-галактозы, UDP-галактозамина, UDP-глюкозы, UDP-глюкозамина, GDP-маннозы, GDP-фукозы, CMP-сиаловой кислоты или CMP-NeuAc. В одном из примеров варианта осуществления нуклеотидный фосфат присоединяют к C-1.

В настоящем изобретении также предложено применение сахарных нуклеотидов, модифицированных L-R¹ в положении 6-углерода. Примеры образцов в соответствии с указанным вариантом включают:

где R группы и L представляют обсуждавшиеся выше фрагменты. Индекс "y" представляет собой 0, 1 или 2. В одном из примеров варианта осуществления L представляет собой связь между NH и R¹. Основание представляет собой основание нуклеиновой кислоты.

Примеры нуклеотидных сахаров, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в описании. В другом примере варианта осуществления нуклеотидные сахара, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются такими, в которых углерод в 6-положении модифицирован, включая образцы со стереохимией GDP маннозы, например:

и

где X⁵ представляет собой связь или O, и остальные переменные имеют указанные выше значения. Индекс i представляет собой 0 или 1. Индекс a представляет собой целое число от 1 до 20. Индексы е и f независимо представляют целые числа от 1 до 2500. Q, как обсуждалось выше, представляет собой H или замещенный, или незамещенный C₁-C₆ алкил. Как должно быть понятно специалистам в данной области, производное серина, в котором S заменен на O также попадает в указанный общий фрагмент.

В еще одном примере варианта осуществления в настоящем изобретении предложен конъюгат, в котором модифицированный сахар основан на стереохимии UDP галактозы. Пример нуклеотидного сахара, который можно использовать в настоящем изобретении, имеет следующую структуру:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления нуклеотидный сахар основан на стереохимии глюкозы. Примеры образцов в соответствии с указанным вариантом имеют формулы:

и

где переменные имеют указанные выше значения.

Так, в иллюстративном варианте, где гликозильным фрагментом является сиаловая кислота, в способе по настоящему изобретению используют соединения, содержащие формулы:

где L-R¹ имеет указанные выше значения, и L'-R¹ представляет линкер, связанный с модифицирующей группой. Что касается L, то примеры линкеров в соответствии с L¹ включают связь, алкильный или гетероалкильный фрагменты.

Кроме того, как уже обсуждалось выше, в настоящем изобретении предложено использование нуклеотидных сахаров, которые модифицированы водорастворимым полимером, который может быть неразветвленным или разветвленным. Например, соединения, содержащие представленную далее формулу, можно использовать для получения конъюгатов в объеме настоящего изобретения:

и

где X⁴ представляет собой O или связь.

Обычно группы сахарный фрагмент или кассета сахарный фрагмент-линкер и PEG или кассета PEG-линкер связывают вместе в результате использования реакционноспособных групп, которые обычно трансформируются в процессе связывания в новую органическую функциональную группу или в не реакционноспособные образцы. Сахарная реакционноспособная функциональная группа (группы) расположена в любом положении на сахарном фрагменте. Реакционноспособные группы и классы реакций, которые можно использовать в практике настоящего изобретения, обычно такие, которые хорошо известны специалистам в области химии биологических конъюгатов. Наиболее востребованными в настоящее время классами реакций, которые можно осуществлять с реакционноспособными сахарными фрагментами, являются такие, которые протекают в относительно мягких условиях. Они включают, но ими не ограничиваются, нуклеофильные замещения (например, реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активными сложными эфирами), электрофильные замещения (например, реакции енаминов) и присоединение к углерод-углеродным и углерод-гетероатомным множественным связям (например, реакция Михаэля, присоединение Дильса-Алдера). Указанные и другие реакции, которые можно использовать, обсуждаются, например, у March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; и Feeney et. al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

Подходящие реакционноспособные функциональные группы, подвешенные к сахарным ядрам или модифицирующей группе, включают, но ими не ограничиваются:

(a) карбоксильные группы и их различные производные, включая, но ими не ограничиваясь, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, сложные эфиры N-гидроксибензотриазола, галогениды кислот, ацилимидазолы, сложные тиоэфиры, сложные эфиры p-нитрофенила, алкильные, алкенильные, алкинильные и ароматические сложные эфиры;

(b) гидроксильные группы, которые можно превратить в, например, сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и т.д.

(c) галогеноалькильные группы, где галогенид может быть позднее замещен нуклеофильной группой, такой как, например, амин, карбоксилатный анион, тиольный анион, карбанион или алкоксидный ион, в результате чего получают ковалентное присоединение новой группы к функциональной группе атома галогена;

(d) диенофильные группы, которые способны участвовать в реакциях Дильса-Альдера, такие как, например, малеимидные группы;

(e) альдегидные или кетонные группы, такие, что возможно последующее получение производных в результате образования карбонильных производных, таких как, например, имины, гидразоны, полукарбазоны или оксимы, или в результате таких механизмов, как реакция присоединения Гриньяра или реакция присоединения с участием алкиллития;

(f) сульфонилгалогенидные группы для последующего взаимодействия с аминами, например, для образования сульфонамидов;

(g) тиольные группы, которые можно, например, превратить в дисульфиды или осуществить взаимодействие с ацилгалогенидами;

(h) аминные или сульфгидрильные группы, которые можно, например, ацилировать, алкилировать или окислить;

(i) алкены, с которыми можно, например, осуществить реакции циклоприсоединения, ацилирования, присоединения Михаэля и т.д.; и

(j) эпоксиды, которые можно, например, подвергнуть взаимодействию с аминами и гидроксильными соединениями.

Реакционноспособные функциональные группы можно выбрать таким образом, чтобы они не участвовали в или не мешали бы реакциям, которые необходимы для сборки реакционноспособных сахарных ядер или модифицирующей группы. Альтернативно, можно предотвратить участие в реакции реакционноспособной функциональной группы за счет присутствия защитной группы. Специалистам в данной области должны быть известны способы защиты конкретных функциональных групп таким образом, чтобы они не принимали участия в реакции в выбранных условиях. Примеры подходящих защитных групп можно найти, например, в Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

В приводимом далее обсуждении представлен ряд конкретных примеров модифицированных сахаров, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения. В примерах вариантов осуществления производные сиаловой кислоты используют в качестве сахарных ядер, к которым присоединена модифицирующая группа. Обсуждение сфокусировано на производных сиаловой кислоты только для простоты иллюстрации и это не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения. Как должно быть понятно специалистам в данной области, различные другие сахарные фрагменты можно активировать и получить их производные способами, аналогичными тем, которые представлены далее, с использованием в качестве примера сиаловой кислоты. Так, например, известно множество способов для модификации галактозы, глюкозы, N-ацетилгалактозамина и фукозы, причем можно указать несколько сахарных субстратов, которые легко модифицировать известными специалистам способами. См., например, Elhalabi et all, Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); и Schafer et all, J. Org. Chem. 65: 24 (2000)).

В одном из примеров варианта осуществления модифицированный сахар основан на 6-амино-N-ацетилгликозильном фрагменте.

На представленной выше схеме индекс n представляет собой целое число от 1 до 2500. В одном из примеров варианта осуществления указанный индекс выбирают таким образом, чтобы молекулярный вес полимера составлял около 10 кДа, 15 кДа или 20 кДа. Символ "A" представляет собой активирующую группу, например галоген, компонент активированного сложного эфира (например, N-гидроксисукцинимидного сложного эфира), компонент карбоната (например, p-нитрофенилкарбоната) и т.п. Как должно быть понятно специалистам в данной области, другие PEG-амидные нуклеотидные сахара можно легко получить указанными или аналогичными способами.

Указанный пептид обычно синтезируют заново или рекомбинантно экспрессируют в прокариотных клетках (например, в бактериальных клетках, таких как клетки E. coli) или в эукариотных клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибков или растений. Указанный пептид может быть или полноразмерным белком, или его фрагментом. Кроме того, указанный пептид может быть дикого типа или может быть мутантным пептидом. В одном из примеров варианта осуществления указанный пептид включает мутацию, которая добавляет один или более из N- или O-связанных сайтов гликозилирования к указанной пептидной последовательности.

В указанном способе настоящего изобретения предложена также модификация не полностью гликозилированных пептидов, которые получены рекомбинантно. Многие рекомбинантно полученные гликопротеины не полностью гликозилированы, экспонируя углеводные остатки, которые могут обладать нежелательными свойствами, например иммуногенностью, распознавания RES. Используя модифицированный сахар в способе настоящего изобретения, указанный пептид может быть одновременно далее гликозилирован и может быть получено его производное с использованием, например, водорастворимого полимера, терапевтического агента или т.п. Указанный сахарный фрагмент модифицированного сахара может быть остатком, который можно соответствующим способом конъюгировать с акцептором в полностью гликозилированный пептид, или другой сахарный фрагмент с необходимыми свойствами.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, настоящее изобретение можно применить на практике, используя практически любой пептид или гликопептид из любого источника. Примеры пептидов, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, представлены в WO 03/031464, и содержащихся там ссылках.

Пептиды, модифицированные указанными способами настоящего изобретения, могут быть синтетическими или дикого типа пептидами, или они могут быть мутантными пептидами, полученными известными специалистам способами, такими как сайтнаправленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно бывает N-связанным или O-связанным. Примерная N-связь представляет собой присоединение модифицированного сахара к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к аспарагиновой боковой цепи. Так, присутствие любой из указанных трипептидных последовательностей в полипептидах создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного сахара (например, N-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, GlcNAc, глюкозы, фукозы или ксилозы) к гидроксилу боковой цепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серину или треонину, хотя можно также использовать необычные или неприродные аминокислоты, например 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Кроме того, помимо пептидов указанные способы настоящего изобретения могут быть осуществлены с другими биологическими структурами (например, гликолипидами, липидами, сфингоидами, керамидами, целыми клетками и т.п., содержащими сайт гликозилирования).

Добавление сайтов гликозилирования к пептиду или другой структуре удобно осуществить, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы она содержала один или более из сайтов гликозилирования. Указанное добавление можно также осуществить путем включения одного или более из образцов, представляющих -OH группу, предпочтительно остатков серина или треонина, внутрь последовательности указанного пептида (для O-связанных сайтов гликозилирования). Указанное добавление можно осуществить за счет мутации или в результате полного химического синтеза указанного пептида. Указанную аминокислотную последовательность пептида предпочтительно изменяют за счет изменений на уровне ДНК, в частности, путем мутации ДНК, кодирующей указанный пептид по предварительно выбранным основаниям таким образом, чтобы создать кодоны, которые будут транслироваться в необходимые аминокислоты. Мутацию (мутации) ДНК предпочтительно осуществляют, используя известные специалистам способы.

В одном из примеров варианта осуществления сайт гликозилирования добавляют путем перестановки полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие нужный пептид, можно модулировать в соответствии с протоколами перестановок. Перестановка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, осуществляемой беспорядочной фрагментацией пула родственных генов с последующей повторной сборкой фрагментов в процессе, подобном полимеразной цепной реакции. См., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); и Патенты США No. 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.

Примеры пептидов, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, способов добавления или удаления сайтов гликозилирования, и добавления или удаления гликозильных структур или субструктур, подробно раскрыты в WO03/031464 и родственных США и PCT заявках.

Настоящее изобретение также использует преимущества от добавления к пептиду (или удаления из пептида) одного или более из выбранных гликозильных остатков, после чего модифицированный сахар конъюгируют с, по меньшей мере, одним из выбранных гликозильных остатков указанного пептида. Указанный вариант осуществления можно использовать, например, если желательно получить конъюгат модифицированного сахара с выбранным гликозильным остатком, который или отсутствует на пептиде, или не присутствует в необходимом количестве. Так, прежде чем осуществить присоединение модифицированного сахара к пептиду, выбранный гликозильный остаток конъюгируют с указанным пептидом за счет ферментативного или химического присоединения. В другом варианте осуществления картину гликозилирования гликопептида изменяют до осуществления конъюгирования модифицированного сахара путем удаления углеводного остатка из гликопептида. См., например, WO 98/31826.

Добавление или удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на гликопептиде, осуществляют или химически, или ферментативно. Пример химического дегликозилирования приведен путем экспонирования полипептидного варианта соединению трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентному соединению. Указанная обработка приводит к расщеплению большей части или всего сахара за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), оставляя при этом указанный пептид нетронутым. Химическое дегликозилирование раскрыто Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) и Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981). Ферментативного расщепления углеводных фрагментов на полипептидные варианты можно достичь, используя различные эндо- и экзо-гликозидазы, как раскрыто Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

В одном из примеров варианта осуществления указанный пептид практически полностью десиалилирован нейраминидазой перед осуществлением стадий гликоконъюгации или ремоделирования указанного пептида. После гликоконъюгации или ремоделирования указанный пептид необязательно снова сиалилируют, используя сиалилтрансферазу. В одном из примеров варианта осуществления повторное сиалилирование происходит практически по каждому (например, >80%, предпочтительно более чем в 85%, более чем в 90%, предпочтительно более чем в 95% и более предпочтительно более чем в 96%, 97%, 98% или 99%) концевому сахарильному акцептору в популяции сиалильных акцепторов. В предпочтительном варианте осуществления сахарид обладает практически однородной картиной сиалилирования (т.е. практически однородной картиной гликозилирования).

Химическое добавление гликозильных фрагментов осуществляют известными специалистам способами. Ферментативное добавление сахарных фрагментов предпочтительно осуществляют, используя представленные в настоящем описании способы модификации, заменяя природные гликозильные звенья на модифицированные сахара настоящего изобретения. Другие способы добавления сахарных фрагментов раскрыты в патентах США No. 5876980, 6030815, 5728554, и 5922577.

Примеры точек присоединения для выбранного гликозильного остатка включают, но ими не ограничиваются: (a) консенсусные сайты для N-связанного гликозилирования и сайты для O-связанного гликозилирования; (b) концевые гликозильные фрагменты, которые являются акцепторами для гликозилтрансферазы; (c) аргинин, аспарагин и гистидин; (d) свободные карбоксильные группы; (e) свободные сульфгидрильные группы, такие как те, что находятся в цистеине; (f) свободные гидроксильные группы, такие как те, что находятся в серине, треонине или гидроксипролине; (g) ароматические остатки, такие как те, что из фенилаланина, тирозина, или триптофана; или (h) амидная группа глутамина. Примеры способов использования в настоящем изобретении раскрыты в WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и у Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, pp. 259-306 (1981).

В одном варианте в настоящем изобретении предложен способ связывания двух или более пептидов через связывающую группу. Связывающая группа является любой из необходимых структур и может быть выбрана из структур с неразветвленными и разветвленными цепочками. Предпочтительно, чтобы каждый конец линкера, который присоединен к пептиду, включал модифицированный сахар (т.е. образующуюся интактную гликозильную связывающую группу).

В примерном способе настоящего изобретения два пептида связаны вместе через линкерный фрагмент, который включает полимерный (например, PEG линкер). Указанная конструкция соответствует общей структуре, представленной ранее на схеме. Как раскрыто в настоящем описании, конструкция настоящего изобретения включает две интактные гликозильные связывающие группы (т.е. s + t = 1). Внимание сосредоточено на PEG линкере, который включает две гликозильные группы, только для целей простоты и не должно быть интерпретировано как ограничивающее идентичность линкерных ветвей, используемых в указанном варианте настоящего изобретения.

Так, PEG фрагмент функционализируют по первому концу первым гликозильным звеном и по второму концу вторым гликозильным звеном. Первое и второе гликозильные звенья предпочтительно представляют собой субстраты для различных трансфераз, обеспечивая ортогональное присоединение первого и второго пептидов к первому и второму гликозильным звеньям, соответственно. На практике линкер (гликозил)¹-PEG-(гликозил)² подвергают контактированию с первым пептидом и первой трансферазой, для которой первое гликозильное звено является субстратом, в результате чего образуется (пептид)¹-(гликозил)¹-PEG-(гликозил)². Трансферазу и/или непрореагировавший пептид затем необязательно удаляют из реакционной смеси. Второй пептид и вторую трансферазу, для которой второе гликозильное звено является субстратом, добавляют к конъюгату (пептид)^l-(гликозил)¹-PEG-(гликозил)², образуя (пептид)¹-(гликозил)¹-PEG-(гликозил)²-(пептид)²; по меньшей мере, один из гликозильных остатков является или непосредственно или косвенно O-связанным. Как должно быть понятно специалистам в данной области, представленный выше способ применим также для получения конъюгатов между более чем двумя пептидами, например, за счет использования разветвленных PEG, дендримеров, поли(аминокислот), полисахаридов или т.п.

В одном из примеров варианта осуществления указанный пептид, который модифицирован в соответствии со способом настоящего изобретения, представляет собой гликопептид, который получен в клетках млекопитающего (например, CHO клетках) или в трансгенном животном, и таким образом, содержит N- и/или O-связанные олигосахаридные цепочки, которые не полностью сиалилированы. Олигосахаридные цепочки гликопептида, не содержащие сиаловой кислоты и содержащие концевой галактозный остаток, могут быть PEGилированными, PPGилированными или могут быть модифицированы каким-либо другим образом модифицированной сиаловой кислотой.

На схеме 1 аминогликозид 1 обрабатывают активным эфиром производного защищенной аминокислоты (например, глицина), превращая остаток сахарного амина в соответствующий аддукт защищенной аминокислоты и амида. Указанный аддукт обрабатывают альдолазой для получения α-гидроксикарбоксилата 2. Соединение 2 превращают в соответствующее CMP производное под действием CMP-SA синтетазы, с последующим каталитическим гидрированием CMP производного до получения соединения 3. Амин, введенный в результате образования аддукта глицина, используют как место присоединения PEG, осуществляя взаимодействие соединения 3 с активированным производным PEG или PPG (например, PEG-C(О)NHS, PEG-OC(O)O-p-нитрофенил), и получая образцы, такие как соединения 4 или 5, соответственно.

В одном из примеров варианта осуществления модифицированный сахар можно присоединить к сайту связывания O-гликана на пептиде. Гликозилтрансферазы, которые можно использовать для получения указанного пептидного конъюгата, включают: для Ser56 (-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG - галактозилтрансфераза и сиалилтрансфераза; для Ser56 -Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG - ксилозилтрансфераза; и для Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-SA)m-PEG - GlcNAc трансфераза.

III. A. Конъюгирование модифицированных сахаров с пептидами

Модифицированные PEG сахара конъюгируют с гликозилированным или негликозилированным пептидом, используя соответствующий фермент для осуществления конъюгирования. Предпочтительно, чтобы концентрации модифицированного донорного сахара (сахаров), фермента (ферментов) и акцепторного пептида (пептидов) были выбраны таким образом, чтобы гликозилирование происходило до тех пор, пока не будет израсходован акцептор. Представленные выше рассмотрения, хотя и обсуждались в контексте сиалилтрансферазы, обычно применимы к другим гликозилтрансферазным реакциям. Список предпочтительных сиалилтрансфераз для использования в способах настоящего изобретения представлен на фиг. 6.

Известен ряд способов использования гликозилтрансфераз для синтеза необходимых олигосахаридных структур, и они в целом применимы для целей настоящего изобретения. Примеры способов раскрыты, например, в WO 96/32491, Ito et ai, Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), в патентах США No. 5352670, 5374541, 5545553, (commonly owned) в патентах США No. 6399336, и 6440703, и (commonly owned) опубликованных PCT заявках, WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231, содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки.

Настоящее изобретение осуществляют, используя одну гликозилтрансферазу или комбинацию гликозилтрансфераз. Например, можно использовать комбинацию сиалилтрансферазы и галактозилтрансферазы. В таких вариантах, когда используют более одного фермента, указанные ферменты и субстраты предпочтительно объединяют в исходной реакционной смеси, или ферменты и реагенты для второй ферментативной реакция добавляют к реакционной среде после того, как завершится первая ферментативная реакция (или почти завершится). При осуществлении двух ферментативных реакций последовательно в одном реакторе полные выходы повышаются за счет использования процедур, в которых выделяют промежуточные продукты. Кроме того, уменьшается необходимость в очистке и удалении дополнительных растворителей и побочных продуктов.

В предпочтительном варианте осуществления каждый из первого и второго ферментов представляет собой гликозилтрансферазу. В другом предпочтительном варианте осуществления один фермент представляет собой эндогликозидазу. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления более двух ферментов используют для сборки модифицированного гликопротеина по настоящему изобретению. Указанные ферменты используют для изменения сахаридной структуры на указанном пептиде, в любой точке или до или после добавления модифицированного сахара к указанному пептиду.

В другом варианте осуществления в указанном способе используют одну или более из экзо- или эндогликозидаз. Указанная гликозидаза обычно представляет собой мутант, который конструируют скорее для образования гликозильных связей, а не для их разрушения. Мутантная гликаназа обычно включает замещение аминокислотного остатка на кислотный аминокислотный остаток активного сайта. Например, если эндогликаназа представляет собой эндо-H, тогда остатками замещенного активного сайта обычно будут Asp в положении 130, Glu в положении 132 или их комбинации. Аминокислоты обычно заменяют серином, аланином, аспарагином или глутамином.

Мутантный фермент катализирует реакцию обычно на стадии синтеза, которая аналогична обратной реакции стадии гидролиза эндогликаназы. В указанных вариантах осуществления молекула гликозильного донора (например, нужная олиго- или моно-сахаридная структура) содержит отщепляемую группу, и реакция протекает при добавлении донорной молекулы к GlcNAc остатку на белке. Например, отщепляемая группа может быть галогеном, таким как фтор. В других вариантах осуществления отщепляемая группа представляет собой Asn или Asn-пептидный фрагмент. В других вариантах осуществления GlcNAc остаток на гликозильной донорной молекуле является модифицированным. Например, GlcNAc остаток может включать фрагмент 1,2-оксазолина.

В предпочтительных вариантах осуществления каждый из ферментов, использованных для получения конъюгата по настоящему изобретению, присутствует в каталитическом количестве. Указанное каталитическое количество конкретного фермента меняется в соответствии с концентрацией указанного ферментного субстрата, также как в соответствии с условиями реакции, такими как температура, время и величина pH. Средства для определения каталитического количества для конкретного фермента при предварительно выбранных концентрациях субстрата и условиях реакции хорошо известны специалистам в данной области.

Температура, при которой осуществляют указанный выше процесс, может меняться от температуры непосредственно выше точки замерзания до температуры, при которой происходит денатурация наиболее чувствительного фермента. Предпочтительные интервалы температур составляют от около 0°C до около 55°C и более предпочтительно от около 20°C до около 37°C. В другом примере варианта осуществления один или более из компонентов способа настоящего изобретения осуществляют при повышенной температуре, используя термофильный фермент.

Реакционную смесь поддерживают в течение промежутка времени, достаточного для того, чтобы произошло гликозилирование акцептора, и в результате образовался необходимый конъюгат. Некоторые конъюгаты часто можно детектировать через несколько часов, причем выделяемые количества обычно наблюдаются через 24 часа или меньше. Как должно быть понятно специалистам в данной области, скорость реакции зависит от ряда переменных факторов (например, концентрации ферментов, концентрации донора, концентрации акцептора, температуры, объема растворителя), которые оптимизируют для выбранной системы.

В настоящем изобретении также предложен способ получения модифицированных пептидов в промышленном масштабе. Как используется в настоящем описании, производство в промышленном масштабе обычно соответствует, по меньшей мере, одному грамму конечного очищенного конъюгата.

В приводимом далее обсуждении настоящее изобретение представлено в качестве примера конъюгированием модифицированных фрагментов сиаловой кислоты и гликозилированного пептида. Примерная модифицированная сиаловая кислота отмечена PEG. Представленная далее дискуссия сфокусирована на использовании PEG-модифицированной сиаловой кислоты и гликозилированных пептидов только для ясности иллюстрации и никоим образом не предназначена для ограничения конъюгированием указанных двух партнеров. Как должно быть понятно специалистам в данной области, указанное обсуждение также применимо к добавлению модифицированных гликозильных фрагментов, отличающихся от сиаловой кислоты. Кроме того, указанное обсуждение в равной степени применимо к модификации гликозильного звена агентами, которые отличаются от PEG, включая другие PEG фрагменты, терапевтические фрагменты и биомолекулы.

Ферментативный подход может быть использован для селективного введения PEGилированных или PPGилированных углеводов в пептид или гликопептид. В указанном способе используют модифицированные сахара, содержащие PEG, PPG, или замаскированные реакционноспособные функциональные группы, и объединяют с соответствующей гликозилтрансферазой или гликосинтазой. Путем выбора гликозилтрансферазы, которая создаст необходимую углеводную связь, и используя модифицированный сахар в качестве донорного субстрата, PEG или PPG можно ввести непосредственно в указанный пептидный скелет, в существующие сахарные остатки гликопептида или в сахарные остатки, которые были добавлены к пептиду.

В одном из примеров варианта осуществления акцептор для сиалилтрансферазы присутствует на пептиде, который должен быть модифицирован, или как природная структура, или его помещают туда рекомбинантно, ферментативно или химически. Подходящие акцепторы включают, например, галактозильные акцепторы, такие как Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, лакто-N-тетраоза, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc (лактоза) и другие акцепторы, известные специалистам в данной области (см., например, Paulson et ah, J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)). Примеры сиалилтрансфераз представлены в настоящем описании далее.

В одном варианте осуществления акцептор для сиалилтрансферазы присутствует на гликопептиде, который должен быть модифицирован после in vivo синтеза гликопептида. Такие гликопептиды можно сиалилировать, используя заявленные способы, без предварительной модификации характера гликозилирования указанного гликопептида. Альтернативно, указанные способы настоящего изобретения можно использовать для сиалилирования пептида, который не включает подходящего акцептора; вначале модифицируют указанный пептид известными специалистам в данной области способами так, чтобы он включал акцептор. В одном из примеров варианта осуществления добавляют остаток GalNAc, используя GalNAc трансферазу.

В одном из примеров варианта осуществления галактозильный акцептор собирают, присоединяя галактозный остаток к соответствующему акцептору, связанному с указанным пептидом, например GlcNAc. Указанный способ включает инкубирование указанного пептида, который должен быть модифицирован, с реакционной смесью, которая содержит необходимое количество галактозилтрансферазы (например, Galβ1,3 или Galβ1,4) и соответствующий галактозильный донор (например, UDP-галактозу). Указанной реакции дают протекать практически до завершения, или, альтернативно, реакцию заканчивают, когда добавлено предварительно определенное количество галактозного остатка. Другие способы сборки выбранного сахаридного акцептора будут очевидны специалистам в данной области.

В еще одном варианте осуществления связанные с гликопептидом олигосахариды вначале "урезают" или целиком, или частично, чтобы экспонировать или акцептор для сиалилтрансферазы, или фрагмент, к которому может быть добавлен один или более из соответствующих остатков, чтобы получить подходящий акцептор. Ферменты, такие как гликозилтрансферазы и эндогликозидазы (см., например, патент США No. 5716812), можно использовать для реакций присоединения и "урезания". В другом варианте осуществления указанного способа фрагменты сиаловой кислоты указанного пептида практически полностью удаляют (например, по меньшей мере, 90, по меньшей мере, 95 или, по меньшей мере, 99%), экспонируя акцептор для модифицированной сиаловой кислоты.

В приводимом далее обсуждении указанный способ настоящего изобретения представлен примером с использованием модифицированного сахара, содержащего присоединенный к нему PEG фрагмент. Внимание в обсуждении сконцентрировано на ясности иллюстрации. Как должно быть понятно специалистам в данной области, обсуждение одинаково относится к тем вариантам, в которых модифицированный сахар содержит терапевтический фрагмент, биомолекулу или т.п.

В одном из примеров варианта осуществления настоящего изобретения, в котором углеводный остаток "урезают" перед добавлением модифицированного сахара с высоким содержанием маннозы, его "урезают" до первой генерации биантеннарной структуры. Модифицированный сахар, содержащий PEG фрагмент, конъюгируют с одним или более из остатков сахара экспонируемых "обратным урезанием" ("trimming back"). В одном примере PEG фрагмент добавляют, используя GlcNAc фрагмент, конъюгированный с PEG фрагментом. Модифицированный GlcNAc присоединяют к одному или к обоим концевым маннозным остаткам биантеннарной структуры. Альтернативно, немодифицированный GlcNAc может быть добавлен к одному или к обоим концам разветвленных образцов.

В другом примере варианта осуществления PEG фрагмент добавляют к одному или к обоим концевым маннозным остаткам биантеннарной структуры, используя модифицированный сахар, содержащий галактозный остаток, который конъюгирован с GlcNAc остатком, добавленным к концевым остаткам маннозы. Альтернативно, немодифицированный Gal может быть добавлен к одному или к обоим концевым GlcNAc остаткам.

В еще одном примере PEG фрагмент добавляют к Gal остатку, используя модифицированную сиаловую кислоту, такую как те, что обсуждались выше.

В другом примере варианта осуществления "высокую" маннозную структуру "урезают" до маннозы, из которой разветвляется биантеннарная структура. В одном примере PEG фрагмент добавляют, используя модифицированный полимером GlcNAc. Альтернативно, немодифицированный GlcNAc добавляют к маннозе, а затем добавляют Gal с присоединенным PEG фрагментом. В еще одном варианте немодифицированные GlcNAc и Gal остатки последовательно добавляют к маннозе, а затем добавляют фрагмент сиаловой кислоты, модифицированный PEG фрагментом.

"Высокую" маннозную структуру можно также "урезать" до элементарного три-маннозильного ядра.

В следующем примере варианта осуществления "высокую" маннозу "урезают" до GlcNAc, к которой присоединена первая манноза. GlcNAc конъюгируют с Gal остатком, содержащим PEG фрагмент. Альтернативно, немодифицированный Gal добавляют к GlcNAc, затем добавляют сиаловую кислоту, модифицированную водорастворимым сахаром. В еще одном примере концевой GlcNAc конъюгируют с Gal и с GlcNAc, затем фукозилируют модифицированной фукозой, содержащей PEG фрагмент.

"Высокую" маннозу можно также "урезать " до первого GlcNAc, присоединенного к Asn указанного пептида. В одном примере GlcNAc из GlcNAc-(Fuc)_aостаток конъюгируют с GlcNAc, содержащим водорастворимый полимер. В другом примере GlcNAc из GlcNAc-(Fuc)_aостаток модифицируют Gal, который содержит водорастворимый полимер. В еще одном варианте GlcNAc модифицируют Gal, с последующим конъюгированием с Gal сиаловой кислоты, модифицированной PEG фрагментом.

Другие примеры вариантов осуществления представлены далее в (commonly owned) патентных публикациях США: 20040132640; 20040063911; 20040137557; в патентных заявках США No: 10/369979; 10/410,913; 10/360770; 10/410945 и PCT/US02/32263, причем все включены в данное описание в качестве ссылки.

В представленных выше примерах предложена иллюстрация эффективности представленных в настоящем описании способов. Используя раскрытые в настоящем описании способы, можно "урезать" и создать углеводный остаток практически любой необходимой структуры. Модифицированный сахар может быть добавлен к концам углеводного фрагмента, как представлено выше, или его можно встроить между ядром указанного пептида и концом углевода.

В одном из примеров варианта осуществления присутствующую сиаловую кислоту удаляют из гликопептида, используя сиалидазу, тем самым, открывая все или большинство расположенных в основе галактозильных остатков. Альтернативно, пептид или гликопептид метят галактозными остатками, или олигосахаридным остатком, который оканчивается галактозным звеном. После экспонирования или добавления галактозных остатков используют соответствующую сиалилтрансферазу для добавления модифицированной сиаловой кислоты.

В другом примере варианта осуществления используют фермент, который переносит сиаловую кислоту на сиаловую кислоту. Указанный способ может быть осуществлен без обработки сиалилированного гликана сиалидазой для экспонирования гликановых остатков, расположенных под сиаловой кислотой. Примером модифицированной полимером сиаловой кислоты служит сиаловая кислота, модифицированная поли(этиленгликолем). Другие примеры ферментов, которые добавляют фрагменты сиаловой кислоты и модифицированной сиаловой кислоты на гликаны, которые содержат остаток сиаловой кислоты, или заменяют существующий остаток сиаловой кислоты на гликане, для указанных образцов включают ST3Gal3, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III и ST8Sia-IV.

В еще одном варианте "замаскированная" реакционноспособная функциональность присутствует на сиаловой кислоте. Такая "замаскированная" реакционноспособная группа предпочтительно не затрагивается в условиях, которые используют для присоединения модифицированной сиаловой кислоты к пептиду фактора VII/фактора VIIa. После ковалентного присоединения модифицированной сиаловой кислоты к указанному пептиду маскирующий фрагмент удаляют и указанный пептид конъюгируют с агентом, таким как PEG. Указанный агент конъюгируют с указанным пептидом специфическим способом, используя его реакцию с не замаскированной реакционноспособной группой на модифицированном сахарном остатке.

Любой модифицированный сахар можно использовать с соответствующей ему гликозилтрансферазой, в зависимости от концевых сахаров олигосахаридных боковых цепей гликопептида. Как обсуждалось выше, концевой сахар гликопептида, необходимый для введения PEGилированной структуры, может быть естественно введен во время экспрессирования, или его можно получить после экспрессирования, используя соответствующую гликозидазу (гликозидазы), гликозилтрансферазу (гликозилтрансферазы) или смесь гликозидазы(гликозидаз) и гликозилтрансферазы (гликозилтрансфераз).

В другом примере варианта осуществления UDP-галактоза-PEG подвергают взаимодействию с β1,4-галактозилтрансферазой, тем самым, осуществляя перенос модифицированной галактозы на соответствующую концевую структуру N-ацетилглюкозамина. Концевые GlcNAc остатки на гликопептиде могут образоваться во время экспрессирования, что может происходить в таких экспрессионных системах, как системы млекопитающих, насекомых, растений или грибов, но их также можно получить, обрабатывая гликопептид сиалидазой, и/или гликозидазой, и/или гликозилтрансферазой, в зависимости от необходимости.

В другом примере варианта осуществления GlcNAc трансферазу, такую как GNT1-5, используют для переноса PEGилированного-GlcNAc на концевой остаток маннозы на гликопептиде. В еще одном примере варианта осуществления N- и/или O-связанные гликановые структуры ферментативно удаляют из гликопептида, чтобы экспонировать аминокислоту или концевой гликозильный остаток, который позднее конъюгируют с модифицированным сахаром. Так, например, эндогликаназу используют для удаления N-связанных структур гликопептида для экспонирования концевого GlcNAc как GlcNAc-связанный-Asn на гликопептиде. UDP-Gal-PEG и соответствующую галактозилтрансферазу используют для введения функциональности PEG-галактоза на экспонированный GlcNAc.

В альтернативном варианте модифицированный сахар добавляют непосредственно к указанному пептидному скелету, используя гликозилтрансферазу, которая, как известно, переносит сахарные остатки на указанный пептидный скелет. Примеры гликозилтрансфераз, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, GalNAc трансферазы (GalNAc T1-14), GlcNAc трансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, ксилозилтрансферазы, маннозилтрансферазы и т.п. Использование такого подхода позволяет обеспечить непосредственное добавление модифицированного сахара на пептиды, в которых полностью отсутствуют какие-либо углеводы, или, альтернативно, на существующие гликопептиды. В обоих случаях добавление модифицированного сахара происходит по специфическим позициям на пептидном скелете, что определено специфичностью субстрата гликозилтрансферазы, а не беспорядочно, как происходит во время модификации пептидного скелета белков с использованием химических способов. Целый ряд агентов можно вводить в белки или гликопептиды, в которых отсутствует пептидная последовательность гликозилтрансферазного субстрата, путем конструирования соответствующей аминокислотной последовательности в полипептидной цепи.

В каждом из представленных выше примерах вариантов осуществления можно использовать одну или более из дополнительных стадий химических или ферментативных модификаций с последующим конъюгированием модифицированного сахара с указанным пептидом. В одном из примеров варианта осуществления фермент (например, фукозилтрансферазу) используют, чтобы присоединить гликозильный фрагмент (например, фукозу) к концевому модифицированному сахару, прикрепленному к пептиду. В другом примере ферментативную реакцию используют, чтобы "закрыть" ("cap") сайты, с которыми модифицированный сахар не образовал конъюгата. Альтернативно, химическую реакцию используют, чтобы изменить структуру конъюгированного модифицированного сахара. Например, конъюгированный модифицированный сахар подвергают взаимодействию с агентами, которые стабилизируют или дестабилизируют свою связь с указанным пептидным компонентом, к которому присоединен модифицированный сахар. В другом примере у компонента модифицированного сахара удаляют защитные группы, с последующим его конъюгированием с указанным пептидом. Как должно быть понятно специалистам в данной области, существует ряд ферментативных и химических процедур, которые можно использовать в указанных способах настоящего изобретения на стадии, после того, как модифицированный сахар конъюгируют с указанным пептидом. Кроме того, создание конъюгата модифицированный сахар-пептид входит в объем настоящего изобретения.

Ферменты и условия реакций для получения конъюгатов настоящего изобретения подробно обсуждаются в рассматриваемой патентной заявке, также как в находящихся в совместном владении опубликованных PCT патентных заявках WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231.

В выбранном варианте осуществления пептид, экспрессированный в клетках насекомых, ремоделируют таким образом, чтобы гликаны на ремоделированном гликопептиде включали бы гликозильный остаток GlcNAc-Gal. Добавление GlcNAc и Gal может происходить как в раздельных реакциях, так и в одной реакции в одном реакторе. В указанном примере используют GlcNAc-трансферазу I и Gal-трансферазу I. Модифицированный сиалильный фрагмент добавляют, используя ST3Gal-III.

В другом варианте осуществления добавление GlcNAc, Gal и модифицированного Sia также может происходить в одном реакторе, при использовании представленных выше ферментов. Каждую из стадий ферментативного ремоделирования и гликоPEGилирования осуществляют индивидуально.

Если указанный пептид экспрессируется в клетках млекопитающего, возможно использование различных способов. В одном варианте осуществления указанный пептид конъюгируют без необходимости в ремоделировании до конъюгирования путем осуществления контактирования указанного пептида с сиалилтрансферазой, которая переносит модифицированную сиаловую кислоту непосредственно на сиаловую кислоту на указанном пептиде, образуя Sia-Sia-L-R¹, или заменяя сиаловую кислоту на указанном пептиде на модифицированную сиаловую кислоту, образуя Sia-L-R¹. Примером фермента, который можно использовать в указанном способе, является CST-II. Другие ферменты, которые добавляют сиаловую кислоту к сиаловой кислоте, известны специалистам в данной области, и примеры таких ферментов приведены на представленных в настоящем описании фирурах.

В еще одном способе получения конъюгатов по настоящему изобретению пептид, экспрессированный в клетках млекопитающего, десиалилируют, используя сиалидазу. Экспонированный Gal остаток сиалилируют модифицированной сиаловой кислотой, используя сиалилтрансферазу, специфичную для O-связанных гликанов, получая пептид с O-связанным модифицированным гликаном. Десиалилированный модифицированный пептид необязательно частично или полностью снова сиалилируют, используя сиалилтрансферазу, такую как ST3GalIII.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения PEGилированного пептидного конъюгата по настоящему изобретению. Указанный способ включает: (a) приведение в контакт пептида, содержащего гликозильную группу, выбранную из:

и

с донором конструкции PEG-сиаловая кислота, включающим формулу, которая представляет собой член, выбранный из

где переменные имеют указанные выше значения, и ферментом, который переносит PEG-сиаловую кислоту с указанного донора на член, выбранный из GalNAc, Gal и Sia указанной гликозильной группы, в условиях, подходящих для указанного переноса. Примером донора модифицированной сиаловой кислоты является CMP-сиаловая кислота, модифицированная за счет линкерного фрагмента полимером, например разветвленным или неразветвленным фрагментом поли(этиленгликоля). Как обсуждалось выше, указанный пептид необязательно гликозилируют, используя GalNAc и/или Gal и/или Sia ("ремоделированный") перед присоединением модифицированного сахара. Стадии ремоделирования могут происходить последовательно в том же самом реакторе без очистки гликозилированного пептида между стадиями. Альтернативно, после одной или более из стадий ремоделирования гликозилированный пептид может быть очищен до передачи его на следующую стадию гликозилирования или гликоPEGилирования. В одном из примеров варианта осуществления указанный способ включает далее экспрессирование указанного пептида в хозяине. В одном из примеров варианта осуществления хозяином служат клетки млекопитающего или клетки насекомого. В другом примере варианта осуществления клетка млекопитающего представляет собой член, выбранный из BHK клетки и CHO клетки, и клеткой насекомого является клетка Spodoptera frugiperda.

Как проиллюстрировано в примерах и обсуждении далее, размещение акцепторного фрагмента для конструкции PEG-сахар осуществляют на любой из нужного числа стадий. Например, в одном варианте осуществления добавление GalNAc к указанному пептиду можно осуществить после второй стадии, в которой PEG-сахар конъюгируют с GalNAc в том же самом реакторе. Альтернативно, указанные две стадии можно осуществить в одном реакторе приблизительно одновременно.

В одном из примеров варианта осуществления донор PEG-сиаловая кислота имеет формулу:

где переменные имеют указанные выше значения.

В другом примере варианта осуществления донор PEG-сиаловая кислота имеет формулу:

где переменные имеют указанные выше значения.

В следующем примере варианта осуществления указанный пептид экспресируют в соответствующей экспрессионной системе перед тем, как его гликоPEGилируют или ремоделируют. Примеры экспрессионных систем включают Sf-9/бакуловирус и клетки яичников китайского хомяка (CHO).

В одном из примеров варианта осуществления настоящего изобретения предложен способ получения пептидного конъюгата, включающий гликозильный линкер, содержащий модифицированный сиалильный остаток формулы:

где D представляет собой член, выбранный из -OH и R¹-L-HN-; G представляет собой член, выбранный из R¹-L- и -C(О)(C₁-С₆)алкил-R¹; R¹ представляет собой фрагмент, включающий член, выбранный из неразветвленного остатка поли(этиленгликоля) и разветвленного остатка поли(этиленгликоля); M представляет собой член, выбранный из H, металла и одного отрицательного заряда; L представляет собой линкер, который является членом, выбранным из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила, таким образом, чтобы, если D представляет собой OH, то G представлял бы собой R¹-L-, и если G представляет собой -C(О)(C₁-C₆)алкил, то D представлял бы собой R¹-L-NH-;

причем указанный способ включает:

(a) приведение в контакт пептида, содержащего гликозильный фрагмент:

с донорным фрагментом PEG-сиаловая кислота формулы:

где переменные имеют указанные выше значения, и ферментом, который переносит указанную конструкцию PEG-сиаловая кислота на Gal указанного гликозильного фрагмента в условиях, соответствующих указанному переносу.

В одном из примеров варианта осуществления L-R¹ имеет формулу:

где a представляет собой целое число, выбранное из 0-20.

В другом примере варианта осуществления R¹ имеет структуру, которая представляет собой член, выбранный из:

и

где e, f, m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1-2500; и q представляет собой целое число, выбранное из 0-20.

Пептидный конъюгат в промышленных масштабах или в небольших количествах можно получить раскрытыми в настоящем описании способами. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,5 мг до около 100 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,1 кг до около 1 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,5 кг до около 10 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,5 кг до около 3 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,1 кг до около 5 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,08 кг до около 0,2 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,05 кг до около 0,4 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,1 кг до около 0,7 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 0,3 кг до около 1,75 кг. В одном из примеров варианта осуществления количество пептида представляет собой член, выбранный из от около 25 кг до около 65 кг.

Используемая концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 0,5 до около 10 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 0,5 до около 1 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 0,8 до около 3 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 2 до около 6 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 4 до около 9 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 1,2 до около 7,8 мг пептида/мл реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления концентрация пептида в раскрытой выше реакции представляет собой член, выбранный из от около 6 до около 9,5 мг пептида/мл реакционной смеси.

Концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара, которую можно использовать в раскрытой в настоящем описании реакции, представляет собой член, выбранный из от около 0,1 до около 1,0 мМ. Факторы, которые могут повысить или понизить указанную концентрацию, включают размер PEG, время инкубирования, температуру, буферные компоненты, также как тип и концентрацию используемой гликозилтрансферазы. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,1 до около 1,0 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,1 до около 0,5 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,1 до около 0,3 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,2 до около 0,7 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,3 до около 0,5 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,4 до около 1,0 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,5 до около 0,7 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,8 до около 0,95 мМ. В одном из примеров варианта осуществления концентрация PEGилированного нуклеотидного сахара представляет собой член, выбранный из от около 0,55 до около 1,0 мМ.

Молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара, которые можно использовать в раскрытой в настоящем описании реакции, рассчитаны на основании теоретического количества PEGилированного сахара, которое можно добавить к белку. Теоретическое количество PEGилированного сахара рассчитано на основании теоретического количества сайтов сахара на белке при сравнении с молекулярным весом, и таким образом, с молями PEGилированного нуклеотидного сахара. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 1-20. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 1-20. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 2-6. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 3-17. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 4-11. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 5-20. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 1-10. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 12-20. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 14-17. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 7-15. В одном из примеров варианта осуществления молярные эквиваленты PEGилированного нуклеотидного сахара представляют собой целое число, выбранное из 8-16.

III. B. Одновременное десиалилирование и гликоPEGилирование

В настоящем изобретении предложен способ гликоPEGилирования "в одном реакторе". Способ в одном реакторе отличается от других примерных процессов получения пептидного конъюгата, в которых используют последовательное де-сиалилирование сиалидазой, с последующей очисткой сиалопептида на колонке с анионообменной смолой, и затем гликоPEGилирование с использованием CMP-сиаловая кислота-PEG и гликозилтрансферазы (такой как ST3Gal3), экзогликозидазы или эндогликозидазы. Пептидный конъюгат затем очищают на анионообменной колонке с последующей хроматографической эксклюзионной по размерам обработкой до получения очищенного пептидного конъюгата.

Способ в одном реакторе представляет собой улучшенный способ получения пептидного конъюгата. В указанном способе реакции десиалилирования и гликоPEGилирования объединяют в реакции в одном реакторе, которая исключает первую стадию хроматографической обработки на анионообменной смоле, которую используют в описанном выше процессе для очистки асиалопептида. Указанное уменьшение стадий процесса обеспечивает несколько преимуществ. Во-первых, уменьшается количество стадий процесса, необходимых для получения пептидного конъюгата, что также снижает технологическую сложность процесса. Во-вторых, уменьшается длительность процесса получения пептидных конъюгатов, например, с 4 до 2 дней. Это приводит к уменьшению затрат на сырье и контроль качества, связанный с контролем внутри процесса. В-третьих, настоящее изобретение использует меньше сиалидазы, например, происходит вплоть до 20-кратного уменьшения сиалидазы, например, 500 мЕД/л необходимо для получения пептидного конъюгата относительно процесса. Такое уменьшение использования сиалидазы значительно снижает количество примесей, таких как сиалидаза, в реакционной смеси.

В одном из примеров варианта осуществления пептидный конъюгат получают следующим способом. На первой стадии пептид объединяют с сиалидазой, модифицированным сахаром настоящего изобретения, и ферментом, способным катализировать перенос гликозильной связывающей группы с модифицированного сахара на указанный пептид, тем самым, получая пептидный конъюгат. Любую сиалидазу можно использовать в указанном способе. Примеры сиалидаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно найти в базе данных CAZY (см. afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html и www.cazy.org/CAZY). Образцы сиалидаз можно купить в любом из ряда источников (QA-Bio, Calbiochem, Marukin, Prozyme и т.д.). В одном из примеров варианта осуществления сиалидаза представляет собой член, выбранный из цитоплазмических сиалидаз, лизосомальных сиалидаз, экзо-альфа-сиалидаз и эндосиалидаз. В другом примере варианта осуществления используемую сиалидазу получают из бактерии, такой как Clostridium perfringens или Streptococcus pneumoniae, или из вируса, такого как аденовирус. В одном из примеров варианта осуществления фермент, способный катализировать перенос гликозильной связывающей группы с модифицированнного сахара на указанный пептид, представляет собой член, выбранный из гликозилтрансферазы, такой как сиалилтрансфераза и фукозилтрансфераза, также как экзогликозидаза и эндогликозидаза. В одном из примеров варианта осуществления фермент представляет собой гликозилтрансферазу, которая представляет собой ST3Gal3. В другом примере варианта осуществления используемый фермент получают из бактерий, таких как Escherichia Coli или грибов, таких как Aspergillus niger. В другом примере варианта осуществления сиалидазу добавляют к указанному пептиду до гликозилтрансферазы в конкретное время, предоставляя реакции сиалидазы протекать, до инициирования реакции гликоPEGилирования за счет добавление реагента PEG-сиаловая кислота и гликозилтрансферазы. В настоящем описании обсуждаются многие другие примеры. Наконец, любой раскрытый в настоящем описании модифицированный сахар можно использовать в указанной реакции.

В другом примере варианта осуществления указанный способ включает далее стадию "кэппинга". На этой стадии дополнительную неPEGилированную сиаловую кислоту добавляют к реакционной смеси. В одном из примеров варианта осуществления указанную сиаловую кислоту добавляют к указанному пептиду или пептидному конъюгату, тем самым, исключая дальнейшее добавление рагента PEG-сиаловая кислота. В другом примере варианта осуществления указанная сиаловая кислота препятствует функции гликозилтрансферазы в реакционной смеси, эффективно останавливая добавление гликозильных связывающих групп к пептидам или пептидным конъюгатам. Наиболее важно то, что сиаловая кислота, которую добавляют к реакционной смеси, осуществляет кэппинг негликоPEGилированных гликанов, тем самым, обеспечивая получение пептидного конъюгата, который обладает улучшенной фармакокинетикой. Кроме того, указанную сиалидазу можно добавлять непосредственно в реакционную смесь гликоPEGилирования, когда степень PEGилирования достигает определенных значений, без предварительной очистки.

В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга менее чем около 50% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержит сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга менее чем около 40% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга менее чем около 30% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга менее чем около 20% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга менее чем около 10% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления от около 20% и до около 5% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления от около 25% и до около 10% сайтов сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате не содержат сиалильного фрагмента. В одном из примеров варианта осуществления после стадии кэппинга практически все сайты сиалилирования на пептиде или пептидном конъюгате содержат сиалильный фрагмент.

III. C. Десиалилирование и селективная модификация пептидов

В другом примере варианта осуществления в настоящем изобретении предложен способ десиалилирования пептида. Указанный способ предпочтительно обеспечивает получение пептида, который десиалилирован на, по меньшей мере, около 40%, предпочтительно 45%, предпочтительно около 50%, предпочтительно около 55%, предпочтительно около 60%, предпочтительно около 65%, предпочтительно около 70%, предпочтительно около 75%, предпочтительно около 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 92%, предпочтительно, по меньшей мере, 94%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 96%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 98% и еще более предпочтительно 100%.

Указанный способ включает приведение в контакт пептида с сиалидазой предпочтительно в течение некоторого промежутка времени. Заранее выбранный промежуток времени должен быть достаточен для десиалилирования указанного пептида до необходимой степени. В предпочтительном варианте осуществления десиалилированный пептид отделяют от сиалидазы после достижения необходимой степени десиалилирования. Далее приводится пример цикла десиалилирования и очистки.

Специалисты могут определить и соответствующим образом заранее выбрать соответствующий промежуток времени, в течение которого проводят реакцию десиалилирования. В одном из примеров варианта осуществления указанный период составляет менее чем 24 часа, предпочтительно менее чем 8 часов, более предпочтительно менее чем 6 часов, более предпочтительно менее чем 4 часа, еще более предпочтительно менее чем 2 часа и еще более предпочтительно менее чем 1 час.

В другом примере варианта осуществления при получении пептидного конъюгата в конце реакции десиалилирования, по меньшей мере, 10% из членов популяции пептидов содержат только одну сиаловую кислоту, к ним присоединенную, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 40% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 50% и более предпочтительно, по меньшей мере, 60% и еще более предпочтительно, если они полностью десиалилированы.

В еще одном примере варианта осуществления при получении пептидного конъюгата в конце реакции десиалилирования, по меньшей мере, 10% членов популяции пептидов полностью десиалилированы, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 40%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 50% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 60%.

В еще одном примере варианта осуществления при получении пептидного конъюгата в конце реакции десиалилирования, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% количества членов популяции пептидов содержат только одну сиаловую кислоту и, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% пептидов полностью десиалилированы.

В предпочтительном варианте осуществления при получении пептидного конъюгата в конце реакции десиалилирования, по меньшей мере, 50% популяции пептидов полностью десиалилировано и, по меньшей мере, 40% членов пептидной популяции содержат только один фрагмент сиаловой кислоты.

После десиалилирования полученный пептид необязательно конъюгируют с модифицированным сахаром. Примерный модифицированный сахар включает сахарильный фрагмент, связанный с разветвленным или неразветвленным фрагментом поли(этиленгликоля). Конъюгирование катализируют ферментом, который переносит модифицированный сахар с донора модифицированного сахара на аминокислотный или гликозильный остаток пептида. Примером донора модифицированного сахара служит реагент CMP-сиаловая кислота, который содержит разветвленный или линейный фрагмент поли(этиленгликоля). Примерный фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярный вес, по меньшей мере, около 2 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 5 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 10 кДа, предпочтительно, по меньшей мере, около 20 кДа, более предпочтительно, по меньшей мере, около 30 кДа и более предпочтительно, по меньшей мере, около 40 кДа.

В одном из примеров варианта осуществления фермент, который используют для переноса модифицированного сахарного фрагмента с донора модифицированного сахара, представляет собой гликозилтрансферазу, например сиалилтрансферазу. Примером сиалилтрансферазы, которую можно использовать в способах настоящего изобретения, является ST3Gal3.

Примерный способ настоящего изобретения приводит к получению модифицированного пептида, содержащего, по меньшей мере, одну, предпочтительно, по меньшей мере, две, предпочтительно, по меньшей мере, три модифицирующие группы. В одном из вариантов осуществления получают указанный пептид, содержащий одну модифицирующую группу в легкой цепи указанного пептида. В другом варианте осуществления предложен способ, в котором получают модифицированный пептид, который содержит одну модифицирующую группу в тяжелой цепи. В другом варианте осуществления предложен способ, в котором получают модифицированный пептид, содержащий одну модифицирующую группу в легкой цепи и одну модифицирующую группу в тяжелой цепи.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения модифицированного пептида. Указанный способ включает приведение в контакт указанного пептида с донором модифицированного сахара, который содержит модифицирующую группу и фермент, способный переносить фрагмент модифицированного сахара с донора модифицированного сахара на аминокислотный или гликозильный остаток указанного пептида.

В одном из примеров варианта осуществления предложен способ получения популяции модифицированных пептидов, в которой, по меньшей мере, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% членов популяция моно-конъюгированы на легкой цепи указанного пептида.

В одном из примеров варианта осуществления предложен способ получения популяции модифицированных пептидов, в которой, по меньшей мере ,40%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% членов популяции ди-конъюгированы на легкой цепи указанного пептида.

В одном из примеров варианта осуществления указанного аспекта предложен способ получения популяции модифицированных пептидов, в которой не более чем 50%, предпочтительно не более чем 30%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10% членов популяции моно-конъюгированы на тяжелой цепи указанного пептида.

В одном из примеров варианта осуществления указанного аспекта предложен способ получения популяции модифицированных пептидов, в которой не более чем 50%, предпочтительно не более чем 30%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10% членов популяции ди-конъюгированы на тяжелой цепи указанного пептида.

Указанный пептид может быть подвергнут действию сиалидазы до стадии осуществления контактирования, или указанный пептид можно использовать без предварительного десиалилирования. Если указанный пептид подвергают контактированию с сиалидазой, он может оказаться практически полностью десиалилирован или только частично десиалилирован. В предпочтительном варианте осуществления указанный пептид, по меньшей мере, частично десиалилируют до осуществления стадии контактирования. Указанный пептид может оказаться практически полностью десиалилирован (практически асиало) или только частично десиалилирован. В предпочтительном варианте осуществления десиалилированный пептид представляет собой один из раскрытых в настоящем описании десиалилированных вариантов.

III. D. Дополнительные аликвоты реагентов, добавляемых в процессе синтеза пептидных конъюгатов

В одном из примеров варианта осуществления синтеза, раскрытых в настоящем описании, пептидных конъюгатов одну или более из дополнительных аликвот компонентов/реагентов реакции добавляют к реакционной смеси после заранее выбранного промежутка времени. В одном из примеров варианта осуществления пептидный конъюгат представляет собой пептидный конъюгат. В другом примере варианта осуществления добавляемый реакционный компонент/реагент представляет собой модифицированный сахарный нуклеотид. Введение модифицированного сахарного нуклеотида в реакцию по-видимому ведет к завершению реакции гликоPEGилирования. В одном из примеров варианта осуществления нуклеотидный сахар представляет собой раскрытый в настоящем описании CMP-SA-PEG. В одном из примеров варианта осуществления добавляемый компонент/реагент реакции представляет собой сиалидазу. В одном из примеров варианта осуществления добавляемый компонент/реагент реакции представляет собой гликозилтрансферазу. В одном из примеров варианта осуществления добавляемый компонент/реагент реакции представляет собой магний. В одном из примеров варианта осуществления добавляемые дополнительные аликвоты составляют около 10%, или 20%, или 30%, или 40%, или 50%, или 60%, или 70%, или 80% или 90% исходного количества, которое добавляют в начале реакции. В одном из примеров варианта осуществления компонент/реагент реакции добавляют в реакцию через около 3 часов, или 6 часов, или 8 часов, или 10 часов, или 12 часов, или 18 часов, или 24 часов, или 30 часов, или 36 часов после ее начала.

III. E. Очистка пептидных конъюгатов

Продукты, получаемые вышеуказанными способами, можно использовать без очистки. Однако обычно предпочтительно выделять продукт и одно или более из промежуточных соединений, например нуклеотидные сахара, разветвленные и линейные образцы PEG, модифицированные сахара и модифицированные нуклеотидные сахара. Можно использовать стандартные, хорошо известные специалистам способы выделения гликозилированных пептидов, такие как тонкослойная или толстослойная хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография или мембранная фильтрация. Предпочтительно для выделения использовать мембранную фильтрацию, более предпочтительно использовать мембрану с обратным осмосом, или одну или более из методик колоночной хроматографии, как обсуждается далее и в цитированной литературе. Например, мембранную фильтрацию на мембранах с отсечением по молекулярному весу в интервале значений от около 3000 до около 10000 можно использовать для удаления белков, таких как гликозилтрансфераза. В некоторых случаях можно использовать отсечение по молекулярному весу, которое отличается для примесей и продукта, для того, чтобы обеспечить очистку продукта. Например, чтобы выделить продукт, пептид-SA-PEG-40 кДа, от непрореагировавшего CMP-SA-PEG-40 кДа, фильтр следует выбирать таким образом, чтобы, например, пептид-SA-PEG-40 кДа оставался в исходном растворе, тогда как CMP-SA-PEG-40 кДа мог попасть через фильтр в фильтрат. Нанофильтрацию или обратный осмос можно затем использовать, чтобы удалить соли и/или очистить полученные сахариды (см., например, WO 98/15581). Нанофильтрационные мембраны представляют собой класс мембран с обратным осмосом, которые пропускают одновалентные соли, но задерживают поливалентные соли и не заряженные растворенные продукты, размеры которых превышают от около 100 до около 2000 Дальтон, в зависимости от используемой мембраны. Так, в типичном применении, сахариды, полученные указанными способами настоящего изобретения, останутся на мембране, тогда как примесные соли пройдут через мембрану.

Если указанный пептид получают внутриклеточно, на первой стадии удаляют осколки дебрис или клеток хозяина или лизированные фрагменты. После гликоPEGилирования PEGилированный пептид очищают известными специалистам способами, например центрифугированием или ультрафильтрацией; причем необязательно, указанный белок можно сконцентрировать, используя коммерчески доступный фильтр для концентрирования белков, с последующим отделением полипептидных вариантов от других примесей с помощью одной или более из стадий, выбранных из иммуноаффинной хроматографии, ионообменного колоночного фракционирования (например, на диэтиламиноэтиле (DEAE) или матрицах, содержащих карбоксиметильные или сульфопропильные группы), хроматографии на Blue-сефарозе, CM Blue-сефарозе, МОНО-Q, МОНО-S, лентиллектин-сефарозе, WGA-сефарозе, Con A-сефарозе, Ether Toyopearl, Butyl Toyopearl, Phenyl Toyopearl, или белковой A сефарозе, SDS-PAGE хроматографии, хроматографии на силикагеле, хроматофокусирования, ВЭЖХ с обращенной фазой (например, на силикагеле с прикрепленными алифатическими группами), гельфильтрации, используя, например, Sephadex молекулярные сита, или хроматографии с исключением по размерам, хроматографии на колонках, которые селективно связывают полипептид, и осаждения этанолом или сульфатом аммония. Очистку можно использовать для отделения одной цепи пептидного конъюгата фактор VII/фактор VIIa от другой, как раскрыто далее в рассматриваемом разделе.

Модифицированные гликопептиды, полученные в культуре, обычно выделяют вначале экстракцией от клеток, ферментов и т.д., с последующей одной или более из стадий концентрирования, высаливания, водного ионообмена или хроматографии с исключением по размерам. Дополнительно модифицированный гликопротеин можно очистить с помощью аффинной хроматографии. И наконец, ВЭЖХ можно использовать на стадиях окончательной очистки.

Ингибитор протеазы может быть включен на любой из предшествующих стадий для ингибирования протеолиза, и антибиотики или консерванты можно включить, чтобы предотвратить рост дополнительных примесей. Используемые на предшествующих стадиях ингибиторы протеаз могут быть ингибиторами с низким молекулярным весом, включая антипаин, альфа-1-антитрипсин, анти-тромбин, леупептин, амастатин, химостатин, банзамидин, также как другие ингибиторы серинпротеазы (т.е. серпины). Обычно ингибиторы серинпротеазы должны использоваться в концентрации в интервале от 0,5-100 мкМ, хотя химостатин в клеточной культуре можно использовать в концентрации вплоть до 200 мкМ. Другие ингибиторы серинпротеазы включают ингибиторы, специфичные для химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных альфа/бета гидролаз, или сигнальных пептидазных кланов серинпротеаз. Помимо серинпротеаз можно также использовать другие типы ингибиторов протеаз, включая ингибиторы цистеинпротеазы (1-10 мкМ) и ингибиторы аспарагинпротеазы (1-5 мкМ), также как ингибиторы неспецифичных протеаз, таких как пепстатин (1-5 мкМ). Ингибиторы протеаз, используемые в настоящем изобретении, могут также включать природные ингибиторы протеаз, такие как ингибитор хирустазин, выделенный из пиявок. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы протеазы могут включать синтетические пептиды или антитела, которые способны связываться со специфичностью к каталитическому сайту протеазы, для стабилизации конструкции фактор VII/фактор VIIa, не мешая при этом реакции гликоPEGилирования.

В другом варианте осуществления супернатант из системы, в которой получают модифицированный гликопептид настоящего изобретения, вначале концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрирования белка, используя, например, Amicon или Millipore Pellicon ультрафильтрационный элемент. После стадии концентрирования полученный концентрат можно перенести на подходящую матрицу очистки. Например, подходящая аффинная матрица может включать лиганд для указанного пептида, молекулу лектина или антитела, связанную с подходящим носителем. Альтернативно анионообменной смоле можно использовать, например, матрицу или субстрат, содержащие подвешенные DEAE группы. Подходящие матрицы включают акриламид, агарозу, декстран, целлюлозу или другие образцы, которые обычно используют при очистке белков. Альтернативно можно использовать стадию катионного обмена. Подходящие катионообменные агенты включают различные нерастворимые матрицы, включающие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Сульфопропильные группы особенно предпочтительны.

Другие способы, которые можно использовать для очистки, включают хроматографию с исключением по размерам (SEC), гидроксиапатитную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и хроматографию на Blue Sepharose. Указанные и другие способы, которые можно использовать, проиллюстрированы в (co-assigned) временном патенте США No. (Attorney Docket No. 40853-01-5168-P1, поданном 6 мая, 2005).

Одну или более из RP-ВЭЖХ стадий с использованием гидрофобной RP-ВЭЖХ среды, например силикагеля, содержащего прикрепленные метильные или другие алифатические группы, можно использовать для дальнейшей очистки композиции полипептидного конъюгата. Некоторые или все из предшествующих стадий очистки в различных комбинациях также можно использовать для получения гомогенного или практически гомогенного модифицированного гликопротеина.

Модифицированный гликопептид по настоящему изобретению, полученный в результате промышленной ферментации, можно очистить способами, аналогичными способам, раскрытым y Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984). В указанной ссылке раскрыты две последовательные стадии RP-ВЭЖХ для очистки рекомбинантных IL-2 человека на препаративной колонке ВЭЖХ. Альтернативно, такие способы, как аффинная хроматография, можно использовать для очистки модифицированного гликопротеина.

В одном из примеров варианта осуществления очистку осуществляют способами, в указанном далее (commonly owned, co-assigned) предварительном патенте США No. 60/665588, поданном 24 марта, 2005.

В соответствии с настоящим изобретением PEGилированные пептиды или пептидный конъюгат, полученные в результате или последовательного десиалилирования, или одновременного сиалилирование, можно очистить или разделить, используя градиент магнийхлорида.

IV. Фармацевтические композиции

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция. Указанная фармацевтическая композиция включает фармацевтически приемлемый разбавитель и ковалентный конъюгат между неприродным PEG фрагментом, терапевтическим фрагментом или биомолекулой и гликозилированным или негликозилированным пептидом. Полимер, терапевтический фрагмент или биомолекулу конъюгируют с указанным пептидом через интактные гликозильные связывающие группы, размещенные между ними и ковалентно связанные одновременно как с указанным пептидом, так и полимером, терапевтическим фрагментом или биомолекулой.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для использования в различных системах доставки лекарств. Подходящие композиции для использования в настоящем изобретении можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985). Для краткости обзор способов для доставки лекарств см. Langer, Science 249:1527-1533(1990).

В одном из примеров варианта осуществления фармацевтическая композиция включает пептидный конъюгат и фармацевтически приемлемый разбавитель, который представляет собой член, выбранный из хлорида натрия, дигидрата хлорида кальция, глицилглицина, полисорбата 80 и маннита. В другом примере варианта осуществления фармацевтически приемлемым разбавителем служит хлорид натрия и глицилглицин. В другом примере варианта осуществления фармацевтически приемлемым разбавителем является дигидрат хлорида кальция и полисорбат 80. В другом примере варианта осуществления фармацевтически приемлемым разбавителем является маннит.

Фармацевтическую композицию можно приготовить для любого подходящего способа введения, включая, например, наружное, пероральное, назальное, внутривенное, интракраниальное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парэнтерального введения, такого как подкожное введение, такой носитель предпочтительно включает воду, солевой раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из вышеперечисленных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Можно также использовать биоразлагаемые микросферы (например, полилактат полигликолят) в качестве носителей для фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Подходящие биоразлагаемые микросферы раскрыты, например, в патентах США No. 4897268 и 5075109.

Обычно фармацевтические композиции вводят парэнтерально, например внутривенно. Так, в настоящем изобретении предложены композиции для парэнтерального введения, которые включают соединение по настоящему изобретению, растворенное или суспендированное в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе, например в воде, в буферированной воде, солевом растворе, PBS и т.п. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые требуются для установления физиологических условий, такие как регуляторы величины pH и буферирующие агенты, регулирующие тоничность агенты, смачивающие агенты, детергенты и т.п.

Указанные композиции можно стерилизовать, используя обычные способы стерилизации, или можно фильтровать в стерильных условиях. Полученные водные растворы можно упаковать для использования как они есть, или лиофилизировать, причем лиофилизированные препараты объединяют со стерильным водным носителем перед введением. Величина pH препаратов обычно находится в интервале от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 и наиболее предпочтительно от 7 до 8.

В некоторых вариантах осуществления гликопептиды по настоящему изобретению можно вводить в липосомы, образованные из стандартных образующих пузырьки липидов. Известно множество способов получения липосом, которые раскрыты, например, в Szoka et al, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), в патентах США No. 4235871, 4501728 и 4837028. Нацеливание липосом с помощью различных направляющих агентов (например, сиалилгалактозидов по настоящему изобретению) хорошо известно специалистам (см., например, патенты США No. 4957773 и 4603044).

Можно использовать стандартные способы присоединения направляющих агентов к липосомам. Указанные способы обычно включают включение в липосомы липидных компонентов, таких как фосфатидилэтаноламин, которые можно активировать для присоединения направляющих агентов, или производных липофильных соединений, таких как преобразованные липидами гликопептиды по настоящему изобретению.

Механизм нацеливания обычно требует, чтобы направляющие агенты были расположены на поверхности липосом таким образом, чтобы указанные направляющие агенты могли бы взаимодействовать с мишенью, например рецептором клеточной поверхности. Углеводы по настоящему изобретению можно присоединить к липидной молекуле до образования липосомы, используя способы, известные специалистам (например, алкилирование или ацилирование гидроксильной группы, присутствующей на углеводе с длинноцепочечным алкилгалогенидом или с жирной кислотой, соответственно). Альтернативно, липосому можно сконструировать таким образом, чтобы вначале встроить соединительную часть в мембрану во время образования указанной мембраны. Соединительная часть должна иметь липофильный участок, который прочно встроен и надежно закреплен в мембране. Она также должна иметь реакционноспособный участок, который химически доступен на водной поверхности липосомы. Реакционноспособный участок выбирают таким образом, чтобы он был химически подходящим для образования стабильной химической связи с направляющим агентом или углеводом, который добавляют позднее. В некоторых случаях возможно присоединить направляющий агент непосредственно к соединительной молекуле, но в большинстве случаев более удобно использовать третью молекулу, которая действовала бы как химический мостик, связывая, тем самым, соединительную молекулу, которая расположена в мембране, с направляющим агентом или углеводом, который простирается объемно в направлении от поверхности пузырька.

Соединения, полученные указанными способами настоящего изобретения, могут также найти применение в качестве диагностических реагентов. Например, меченые соединения можно использовать для локализации участков воспаления или метастазов опухоли у пациентов, у которых предполагают наличие воспаления. Для такого использования в указанные соединения можно ввести метку - ¹²⁵I, ¹⁴C, или тритий.

Способы получения соединений, которые можно использовать при получении композиции по настоящему изобретению, обычно представлены в различных патентных публикациях, например US 20040137557; WO 04/083258 и WO 04/033651. Далее приводятся следующие примеры для иллюстрации конъюгатов и способов настоящего изобретения, но они никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Десиалилирование фактора VIIa.

Фактор VIIa, который экспрессируют в не содержащей сыворотки среде, фактор VIIa, который получают в содержащей сыворотку среде, плюс три мутанта фактора VIIa -N145Q, N322Q, и аналог DVQ (V158D/E296V/M298Q).

При подготовке для ферментативного десиалилирования фактор VIIa диализуют в MES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂, 50 мМ MES, pH 6 в течение ночи при 4°C в трубке для диализа Snakeskin с MWCO (10 кДа). Десиалилирование фактора VIIa (1 мг/мл) осуществляют, используя 10 Ед/л растворимой сиалидазы из Arthrobacter ureafaciens (Calbiochem) при 32°C в течение 18 часов в обменном буфере.

ПРИМЕР 2

Сиалил-PEGилирование фактора VIIa.

Сиалил-PEGилирование ("ГликоPEGилирование") осуществляют на асиало-фактор VIIa (1 мг/мл), используя 100 ЕД/л ST3Gal-III и 200 мкМ CMP-сиаловая кислота-PEG (40 кДа, 20 кДа, 10 кДа, 5 кДа, и 2 кДа) при 32°C в буфере для десиалилирования в течение 2-6 часов. После того как истечет соответствующее время реакции, PEGилированный образец немедленно очищают для минимизации дальнейшего гликоPEGилирования.

Чтобы осуществить кэппирование гликоPEGилированный фактор VII/фактор VIIa образцами, которые кэппированы сиаловой кислотой, вначале удаляют сиалидазу из асиало-фактор VIIa, используя анионообменную хроматографию, как раскрыто далее. Добавляют избыток CMP-сиаловая кислота (5 мМ) и инкубируют при 32°C в течение 2 часов, кэппируя гликоPEGилированный фактор VIIa сиаловой кислотой. Сиалил-PEGилированные формы фактора VIIa анализируют, используя невосстанавливающий SDS-PAGE (Трис-глициновые гели и/или NuPAGE гели) и набор для окрашивания коллоидным синим, как указано Invitrogen.

ПРИМЕР 3

Очистка PEGилированного фактора VIIa.

ГликоPEGилированные образцы фактора VIIa очищают, используя способ с модифицированной анионообменной смолой. Образцы обрабатывают при 5°C. Непосредственно перед введением в колонку добавляют 1 г Chelex 100 (BioRad) на 10 мл раствора фактора VIIa, чтобы ремоделировать образец. После перемешивания в течение 10 минут полученную суспензию фильтруют через целлюлозоацетатную мембрану (0,2 мкм), используя вакуумную систему. Оставшуюся на фильтре хелаторную смолу промывают один раз 1-2 мл воды на 10 мл объема. Проводимость фильтрата доводят до 10 мС/см при 5°C, величину pH при необходимости доводят до 8,6.

Анионообмен осуществляют при 8-10°C. Колонку, содержащую Q Sepharose FF, подготавливают перед введением в нее вещества, промывая 1 M NaOH (10 объемов колонки), водой (5 объемов колонки), 2 M NaCl, 50 мМ HOAc, pH 3 (10 объемов колонки), и уравновешивают, используя 175 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, pH 8,6 (10 объемов колонки). Для каждой реакции PEGилирования 15-20 мг фактора VIIa вводят в колонку XK16 (Amersham Biosciences), содержащую 10 мл Q Sepharose FF (не более чем 2 мг белка на мл смолы) при скорости потока 100 см/час. Для 2 кДа неразветвленного PEG, 20 мг фактора VIIa вводят в колонку XK26 (Amersham Biosciences), содержащую 40 мл Q Sepharose FF (0,5 мг белка на мг смолы) при скорости потока 100 см/час.

После загрузки колонку промывают 175 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, pH 8,6 (10 объемов колонки) и 50 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, pH 8,6 (2 объема колонки). Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент в 15 мМ CaCl₂ и используя 50 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, 15 мМ CaCl₂, pH 8,6 (5 объемов колонки). Затем колонку промывают, используя 1 M NaCl, 10 мМ глицилглицина, pH 8,6 (5 объемов колонки). Вытекающий поток контролируют по поглощению на длине волны 280 нм. Фракции (5 мл) собирают во время элюирования и двух промывок; фракции объемом 2,5 мл собирают во время элюирования CaCl₂ и 1 M соли. Фракции, содержащие фактор VIIa, анализируют, используя невосстанавливающий SDS-PAGE (Tris-глициновые гели и/или NUPAGE гели) и набор Colloidal Blue Staining Kit. Соответствующие фракции, содержащие фактор VIIa, объединяют, и величину pH доводят до 7,2, используя 4 M HCl.

Фактор VIIa-SA-PEG-10 кДа очищают раскрытым выше способом за исключением следующих изменений. EDTA (10 мМ) добавляют к раствору PEGилированного фактора VIIa, величину pH доводят до pH 6 и проводимость доводят до 5 мС/см при 5°C. Около 20 мг фактора VIIa-SA-PEG-10 кДа вводят в колонку XK16 (Amersham Biosciences), содержащую 10 мл Poros (50 микрон) HQ смолы (не более чем 2 мг белка на мл смолы) при скорости потока 100 см/час. После загрузки колонку промывают 175 мМ NaCl, 10 мМ гистидина, pH 6 (10 объемов колонки) и 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидина, pH 6 (2 объема колонки). Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент 20 мМ CaCl₂ в 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидина, pH 6 (5 объемов колонки). Затем колонку промывают 1 M NaCl, 10 мМ гистидина, pH 6 (5 объемов колонки).

Полученный в результате анионообмена элюат, содержащий фактор VIIa-SA-PEG-10 кДа (25 мл), концентрируют до 5-7 мл, используя центрифужный фильтр Amicon Ultra-15 10K в соответствии с рекомендациями изготовителя (Millipore). После концентрирования осуществляют эксклюзионную хроматографию с исключением по размерам. Образец (5-7 мл) вводят в колонку, содержащую Superdex 200 (HiLoad 16/60, препаративной степени чистоты; Amersham Biosciences), уравновешенную 50 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, 15 мМ CaCl₂, pH 7,2 для большинства PEGилированных вариантов. Фактор VIIa-SA-PEG-10 кДа выделяют из немодифицированного асиало-фактор VIIa при скорости потока 1 мл/мин и поглощение контролируют на длине волны 280 нм. Фракции (1 мл), содержащие фактор VIIa, собирают и анализируют, используя невосстанавливающий SDS-PAGE (Tris-глициновые гели и/или NuPAGE гели) и набор Colloidal Blue Staining Kit. Фракции, содержащие целевую PEGилированную изоформу и не содержашие немодифицированного асиало-фактор VIIa, объединяют и концентрируют до 1 мг/мл, используя центрифужный фильтр Amicon Ultra-15 10K. Концентрацию белка определяют по поглощению на длине волны 280 нм, используя коэффициент экстинкции 1,37 (мг/мл)^-1 см^-1.

ПРИМЕР 4

Определение PEGилированных изофрм с помощью ВЭЖХ анализа на колонке с обращенной фазой.

PEGилированный фактор VIIa анализируют с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (Zorbax 300SB-C3, размер частиц 5 мкм, 2,1 × 150 мм). Используют элюенты: A) 0,1 TFA в воде и B) 0,09% TFA в ацетонитриле. Детектирование на длине волны 214 нм. Градиент, скорость потока и температура колонки зависят от длины PEG (40 кДа, 20 кДа и 10 кДа PEG: 35-65%B в течение 30 мин, 0,5 мл/мин, 45°C; 10 кДа PEG: 35-60%B в течение 30 мин, 0,5 мл/мин, 45°C; 5 кДа: 40-50%B в течение 40 мин, 0,5 мл/мин, 45°C; 2 кДа: 38-43%B в течение 67 мин, 0,6 мл/мин, 55°C). Идентичность каждого из пиков определяют на основании двух или более из четырех показателей: известного времени удерживания для природного фактора VIIa, миграции выделенного пика в SDS-PAGE, масс-спектра MALDI-TOF выделенного пика и упорядоченного возрастания времени удерживания каждого из пиков по мере увеличения количества присоединенных PEG.

ПРИМЕР 5

Определение сайта присоединения PEG с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой

Фактор VIIa и варианты PEGилированного фактора VIIa преобразовывают, смешивая образец (10 мкл при концентрации 1 мг/мл) с восстанавливающим буфером (40 мкл, 50 мМ NaCl, 10 мМ глицилглицина, 15 мМ EDTA, 8 M мочевины, 20 мМ DTT, pH 8,6) в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавляют воду (50 мкл) и образец охлаждают до 4°C до момента введения в колонку ВЭЖХ (< 12 часов). Колонка ВЭЖХ, элюанты и способ детектирования те же, что раскрыты для не восстановленных образцов. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин и градиент составляет 30-55%B в течение 90 мин, с последующим коротким циклом промывки вплоть до 90%B. Идентичность каждого из пиков определяют по способу примера 4.

ПРИМЕР 6

Анализ коагулирования фактора VIIa

PEGилированные образцы и стандарты тестируют в двух экземплярах и разбавляют 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂, 0,1% BSA (вес/объем), 50 мМ Tris, pH 7,4. Стандарт и образцы анализируют в интервале концентраций от 0,1 до 10 нг/мл. Равные объемы разбавленных стандартов и образцов смешивают с плазмой с дефицитом фактора VIIa (Diagnostica Stago) и хранят на льду не более чем в течение 4 часов до использования их в анализе.

Времена коагулирования измеряют, используя коагулиметр STart4 (Diagnostica Stago). Коагулиметр измеряет время, которое проходит до образования сгустка in vitro, на что указывает прекращение легкого возвратно-поступательного движения магнитного шарика в кювете с образцом.

В каждой кювете находится один магнитный шарик плюс 100 мкл образца факторVIIa/дефицитная плазма и 100 мкл разбавленного цефалинового раствора крысиного мозга (хранят на льду не более 4 часов). Каждый реагент добавляют с интервалом 5 секунд между каждой лункой, окончательную смесь инкубируют в течение 300 секунд при 37°C. Разбавленный цефалиновый (RBC) раствор мозга крыс приготавливают из 2 мл исходного раствора RBC (1 ампула исходного RBC, от Haemachem, плюс 10 мл 150 мМ NaCl) и 4 мл 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂, 0,1% BSA (вес/объем), 50 мМ Tris, pH 7,4.

Через 300 секунд начинают анализ, добавляя 100 мкл предварительно нагретого (37°C) раствора растворимого тканевого фактора (2 мкг/мл; аминокислоты 1-209) в 100 мМ NaCl, 12,5 мМ CaCl₂, 0,1% BSA (вес/объем), 50 мМ Tris, pH 7,4. И снова, этот следующий раствор добавляют с 5-секундными интервалами к образцам.

Времена коагулирования, полученные для разбавленных стандартов, используют для построения стандартной кривой (log времени коагулирования от log концентрации фактора VIIa). Полученную линейную регрессию из кривой используют для определения относительных активностей коагулирования PEGилированных вариантов. Варианты PEGилированного фактора VIIa сравнивают с аликвоттированным исходным фактором VIIa.

ПРИМЕР 7

ГликоPEGилирование рекомбинантного Фактора VIIa, продуцированного в BHK клетках

Этот пример представляет собой PEGилирование рекомбинантного фактора VIIa, полученного в BHK клетках.

Получение асиало-фактора VIIa.

Рекомбинантный фактор VIIa продуцируется в BHK клетках (клетки почек детеныша хомяка). Фактор VIIa (14,2 мг) растворяют в концентрации 1 мг/мл в буферном растворе (pH 7,4, 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl₂, 0,05% NaN₃) и инкубируют c 300 мЕд/мл конъюгата сиалидаза (Vibrio cholera)-агароза в течение 3 дней при 32°C. Для контроля за реакцией небольшие аликвоты реакционой смеси разбавляют соответствующим буфером и осуществляют IEF на геле в соответствии с процедурами Invitrogen (Фиг. 157). Полученную смесь центрифугируют при 3500 об/мин и собирают надосадочную жидкость. Оставшуюся смолу трижды промывают (3×2 мл) вышеуказанным буферным раствором (pH 7,4, 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN₃) и объединенные промывки концентрируют в Centricon-Plus-20. У оставшегося раствора меняют буфер 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 0,05% NaN₃ до конечного объема 14,4 мл.

Получение фактор VIIa-SA-PEG-1 кДа и фактор VIIa-SA-PEG-10 кДа.

Раствор десиалилированного фактора VIIa разделяют на два равных образца по 7,2 мл. В каждый образец добавляют или CMP-SA-PEG-1 кДа (7,4 мг), или CMP-SA-PEG-10 кДа (7,4 мг). ST3Gal3 (1,58 Ед) добавляют в обе ампулы и реакционную смесь инкубируют при 32°C в течение 96 часов. За ходом реакции следят с помощью SDS-PAGE, используя реагенты и условия, указанные Invitrogen. После завершения реакции реакционную смесь очищают, используя препаративную колонку Toso Haas TSK-Gel-3000 и используя PBS буфер (pH 7,1) и собирая фракции на основании данных УФ-поглощения. Объединенные фракции, содержащие продукт, концентрируют при 4°C в центрифужных фильтрах Centricon-Plus-20 (Millipore, Bedford, MA) и концентрированный раствор снова преобразуют, получая 1,97 мг (определение белка с использованием бицинхониновой кислоты, BCA анализ, Sigma-Aldrich, St. Louis MO) фактор VIIa-SA-PEG. Продукт реакции анализируют, используя SDS-PAGE и IEF анализы в соответствии с процедурами и реагентами, поставляемыми Invitrogen. Образцы подвергают диализу против воды и анализируют, используя MALDI-TOF.

ПРИМЕР 8

Фактор VIIa-SA-PEG-10 кДа: Способ в одном реакторе

Фактор VIIa (5 мг разбавленного в буфере для конечной композиции до конечной концентрации 1 мг/мл), CMP-SA-PEG-10 кДа (10 мМ, 60 мкл) и A. niger фермент ST3Gal3 (33 ЕД/л) и 10 мМ гистидина, 50 мМ NaCl, 20 мМ CaCl₂ объединяют в реакторе вместе с или 10 ЕД/л, 1 ЕД/л, 0,5 ЕД/л или 0,1 ЕД/л сиалидазы (CalBiochem). Ингредиенты смешивают и инкубируют при 32°C. За ходом реакции следят, используя аналитические аликвоты, отбираемые с 30-минутными интервалами в течение первых четырех часов. Затем аликвоту отбирают через 20 часов и анализируют, используя SDS-PAGE. Степень PEGилирования определяют, отбирая по 1 мл в моменты времени 1,5, 2,5 и 3,5 часа и очищая образцы на колонке Poros 50HQ.

При проведении реакции в условиях с содержанием 10 ЕД/л сиалидазы не образуется заметного количества продукта фактор VIIa-SA-PEG. При проведении реакции в условиях с содержанием 1 ЕД/л сиалидазы, около 17,6% фактора VIIa в реакционной смеси оказывается моно- или диPEGилированными после 1,5 часа. Это количество возрастает до 29% через 2,5 часа и до 40,3% через 3,5 час. При проведении реакции в условиях с содержанием 0,5 ЕД/л сиалидазы около 44,5% фактора VIIa в реакционной смеси оказываются или моно, или диPEGилированными через 3 часа и 0,8% оказываются триPEGилированными или более. Через 20 часов 69,4% оказываются или моно- или диPEGилированными и 18,3% оказываются триPEGилированными или более.

При проведении реакции в условиях с содержанием 0,1 ЕД/л сиалидазы около 29,6% фактора VIIa в реакционной смеси оказываются или моно-, или диPEGилированными через 3 часа. Через 20 часов, 71,3% оказываются или моно-, или диPEGилированными и 15,1% оказываются триPEGилированными или более.

ПРИМЕР 9

Получение цистеин-PEG₂ ( 2 )

a. Синтез соединения 1

Гидроксид калия (84,2 мг, 1,5 ммоль в виде порошка) добавляют к раствору L-цистеина (93,7 мг, 0,75 ммоль) в безводном метаноле (20 л) в атмосфере аргона. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут и затем несколькими порциями за промежуток времени 2 часа добавляют mPEG-O-тозилат с молекулярной массой 20 килодальтон (Ts; 1,0 г, 0,05 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 дней и концентрируют, используя роторный испаритель. Полученный остаток разбавляют водой (30 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы разрушить весь избыток mPEG-O-тозилата с молекулярной массой 20 килодальтон. Полученный раствор затем нейтрализуют уксусной кислотой и величину pH доводят до pH 5,0 и вводят в хроматографическую колонку (C-18 двуокись кремния) с обращенной фазой. Осуществляют градиентное элюирование колонки, используя смесь метанол/вода (продукт элюируется в условиях около 70% метанола), причем за элюированием продукта следят с помощью испарительного светорассеяния и соответствующие фракции собирают и разбавляют водой (500 мл). Полученный раствор обрабатывают хроматографически (ионообмен, XK 50 Q, BIG Beads, 300 мл, гидроксидная форма; градиент вода - вода/уксусная кислота-0,75 н) и величину pH соответствующей фракции понижают до 6,0, используя уксусную кислоту. Полученный раствор затем вводят в колонку (C-18 двуокись кремния) с обращенной фазой и элюируют, используя градиент смеси метанол/вода, как указано выше. Содержащие продукт фракции объединяют, концентрируют, снова растворяют в воде и сушат вымораживанием, получая 453 мг (44%) твердого вещества белого цвета (1).

Структурные данные для соединения: ¹Н-ЯМР (500 МГц, D₂O) δ 2,83 (т, 2Н, О-С-СН ₂-S), 3,05 (кв, 1Н, S-СНН-СНN), 3,18 (кв, 1Н, (кв, 1Н, S-CHH-CHN), 3,38 (c, 3H, CH ₃O), 3,7 (т, OCH ₂СН ₂О), 3,95 (кв, 1Н, СНN). Степень чистоты продукта подтверждена SDS-PAGE.

b. Синтез цистеин-PEG₂ (2)

Триэтиламин (~ 0,5 мл) добавляют по каплям к раствору соединения 1 (440 мг, 22 мкмоль), растворенного в безводном CH₂Cl₂ (30 мл) до тех пор, пока раствор не становится щелочным. Раствор 20 килодальтон mPEG-O-п-нитрофенилкарбонат (660 мг, 33 мкмоль) и N-гидроксисукцинимида (3,6 мг, 30,8 мкмоль) в CH₂Cl₂ (20 мл) добавляют несколькими порциями в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем растворитель удаляют, используя роторный испаритель, полученный остаток растворяют в воде (100 мл), и величину pH доводят до 9,5, используя 1,0 н NaOH. Щелочной раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов и затем нейтрализуют уксусной кислотой до pH 7,0. Полученный раствор затем вводят в хроматографическую колонку (C-18 двуокись кремния) с обращенной фазой. Осуществляют градиентное элюирование смесью метанол/вода (продукт элюируется при около 70% метанола), причем за элюированием продукта следят с помощью испарительного рассеяния света, и соответствующие фракции собирают и разбавляют водой (500 мл). Полученный раствор обрабатывают хроматографически (ионообмен, XK 50 Q, BIG Beads, 300 мл, гидроксидная форма; градиент вода - вода/уксусная кислота - 0,75 н) и величину pH соответствующей фракции понижают до 6,0, используя уксусную кислоту. Полученный раствор вводят затем в колонку (C-18 двуокись кремния) с обращенной фазой и осуществляют градиентное элюирование смесью метанол/вода, как описано выше. Содержащие продукт фракции объединяют, концентрируют, снова растворяют в воде и сушат вымораживанием, получая 575 мг (70%) твердого вещества белого цвета (2).

Структурные данные для соединения: ¹Н-ЯМР (500 МГц, D₂O) δ 2,83 (т, 2Н, О-С-СН ₂-S), 2,95 (т, 2Н, О-С-СН ₂-S), 3,12 (кв, 1Н, S-CHH-CHN), 3,39 (с, 3Н, СН ₃О), 3,71 (т, ОСН ₂СН ₂О). Степень чистоты продукта подтверждена SDS-PAGE.

ПРИМЕР 10

Фактор VIIa-SA-PEG-40 кДа

ГликоPEGилирование фактора VIIa (В одном реакторе с кэппингом).

ГликоPEGилирование фактора VIIa осуществляют в реакции в одном реакторе, где десиалирование и PEGилирование происходят одновременно, с последующим кэппингом сиаловой кислотой. Указанную реакцию осуществляют в стеклянном реакторе с рубашкой, температура в котором поддерживается при 32°C за счет водяной бани. Вначале концентрированный отфильтрованный до 0,2 мкм фактор VIIa вводят в реактор и нагревают до 32°C, перемешивая мешалкой в течение 20 минут. Раствор сиалидазы приготавливают из сухого порошка в 10 мМ гистидин/50 мМ NaCl/20мМ CaCl₂, pH 6,0 при концентрации 4000 ЕД/л. После того как температура фактора VIIa достигает 32°C, к фактору VIIa добавляют сиалидазу и реакционную смесь перемешивают примерно в течение 5 минут, чтобы обеспечить получение однородного раствора после того, как перемешивание прекращают. Реакции десиалирования дают протекать в течение 1,0 часа при 32°C. Во время реакции десиалирования CMP-SA-PEG-40 кДа растворяют в 10 мМ буфера гистидин/50 мМ NaCl/20 мМ CaCl₂, pH 6,0, и концентрацию определяют по УФ-поглощению на длине волны 271 нм. После того как CMP-SA-PEG-40 кДа растворяется, к реакционной смеси добавляют CMP-SA-PEG-40 кДа, также как ST3Gal3, и реакционную смесь перемешивают в течение приблизительно 15 минут мешалкой для обеспечения однородного раствора. Добавляют дополнительный объем 85 мл буфера, чтобы довести объем реакционной смеси до 1,0 л. Реакции дают протекать без перемешивания в течение 24 часов перед добавлением CMP-SA до концентрации 4,3 мМ для того, чтобы погасить реакцию и осуществить кэппинг оставшихся концевых остатков галактозы сиаловой кислотой. Гашение реакции происходит при перемешивании в течение 30 минут при 32°C. Полный объем реакционной смеси составляет 1,0 л до гашения. Образцы (1 мл) отбирают в моменты времени 0, 4,5, 7,5 и 24 часа, гасят, используя CMP-SA, и анализируют с помощью RP-ВЭЖХ и SDS-PAGE.

Очистка фактор VIIa-SA-PEG-40 кДа.

После кэппинга полученный раствор разбавляют 2,0 л 10 мМ гистидина, pH 6,0 который хранили в течение ночи при 4°C, и образец фильтруют через фильтр 0,2 мкм Millipak 60. Полученный загрузочный объем составляет 3,1 л. Осуществляют хроматографическую обработку AEX2 при 20-25°C (комнатная температура), используя систему Akta Pilot. После загрузки осуществляют промывку 10 объемами колонки уравновешивающего буфера и продукт элюируют из колонки, используя градиент MgCl₂ (10 объемов колонки), что приводит к переводу в раствор образцов PEGилированного фактора VIIa из неPEGилированного фактора VIIa. Загрузку в указанную колонку намеренно сохраняют низкой, поддерживая < 2 мг фактор VIIa/мл смолы. Полученные с помощью SDS-PAGE гели подвергают, кроме того, RP-ВЭЖХ анализу выбранных фракций и объединенных фракций, чтобы получить объединенный массовый продукт. Величину pH объединенных фракций доводят до 6,0, используя 1 M NaOH, и хранят в холодном помещении при 2-8°C в течение ночи.

Окончательное концентрирование/диафильтрация, асептическая фильтрация и аликвотирование.

Объединенные фракции фильтруют через фильтр Millipak 20 0,2 мкм и хранят в течение ночи при 2-8°C. Для осуществления концентрирования/диафильтрации используют регенерированную целлюлозную мембрану Millipore 0,1 м² 30 кДа в системе, снабженной перистальтическим насосом и силиконовой трубкой. Систему собирают и промывают водой, затем обеззараживают, используя 0,1 M NaOH в течение, по меньшей мере, 1 часа, и затем хранят в 0,1 M NaOH до уравновешивания диафильтрационным буфером (10 мМ гистидин/5 мМ CaCl₂/100 мМ NaCl pH 6,0) непосредственно перед использованием. Продукт концентрируют до объема приблизительно 400 мл и затем осуществляют диафильтрацию при постоянном объеме, используя приблизительно 5 диаобъемов буфера. Затем продукт концентрируют до приблизительно 300 мл и выделяют после рециркуляции при низком давлении в течение 5 минут, и мембраны промывают 200 мл диафильтрационного буфера путем рециркулирования в течение 5 минут. Промывку выделяют вместе с продуктом и осуществляют рециркулирование следующих 50 мл буфера в течение следующих 5 минут для окончательной промывки. Полученный объем составляет приблизительно 510 мл и его фильтруют через 1 л вакуумный фильтр, снабженный мембраной 0,2 мкм PES (Millipore). Затем из асептически профильтрованного объема отбирают аликвоты по 25 мл в 50 мл стерильные фальконовые ампулы и замораживают при -80°C.

Анализ реакции PEGилирования с помощью ВЭЖХ (Пример 10)

	Время реакции конъюгирования	Очистка
	0 часов	4,5 часа	7,5 часов	24 часа	После хроматографирования
% неPEGилированных	94,7	76,1	66,6	51,0	0,6
%моноPEGилированных	0,9	17,9	26,1	39,1	85,6
% диPEGилированных	0,1	0,9	1,9	5,1	5,1
% триPEGилированных	0,0	0,0	0,0	0,2	0,2

Через 24 часа распределение массового продукта по состоянию PEGилирования таково: 0,7% неPEGилированных, 85,3% моно-PEGилированных, 11,5% ди-PEGилированных и 0,3% три-PEGилированных. Колоночная хроматография представляет собой основную стадию в процессе создания распределения продуктов, главным образом, за счет удаления неPEGилированного материала из моно- и ди-PEGилированных образцов.

Следует понимать, что раскрытые в настоящем описании примеры и варианты приведены только с иллюстративной целью и что различные модификациии или изменения в их свете могут быть предложены специалистами в данной области и должны быть включены в сущность рассматриваемой заявки и в объем прилагаемой формулы настоящего изобретения. Все цитированные в настоящем описании публикации, патенты и патентные заявки включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей.

1. Пептидный конъюгат, содержащий:
гликозилированный пептид, который ковалентно связан с молекулой следующей формулы:
,
где R² равно СООН;
R³ равно Н;
R⁴ равно ОН; и
R⁵ имеет формулу:

где индексы m и n представляют собой целые числа, независимо выбранные из 100-4000.

2. Пептидный конъюгат по п.1, где указанная молекула имеет формулу:

3. Пептидный конъюгат по п.1, где указанный гликозилированный пептид в пептидном конъюгате выбран из морфогенетического белка 2 кости (ВМР-2), морфогенетического белка 7 кости (ВМР-7), морфогенетического белка 15 кости (BMP-15), нейротрофина-3 (NT-3), протеазы фактора фон Виллебранда (vWF), фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора X, фактора XI, фактора VIII с удаленным В-доменом, слитого белка vWF-фактор VIII, содержащего полноразмерный фактор VIII, слитого белка vWF-фактор VIII с удаленным В-доменом фактора VIII, эритропоэтина (ЕРО), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона альфа, интерферона бета, интерферона гамма, α₁-антитрипсина (АТТ, или ингибитора α-1 протеазы), глюкоцереброзидазы, активатора плазминогена тканевого типа (ТРА), интерлейкина-2 (IL-2), урокиназы, ДНКазы человека, инсулина, поверхностного белка гепатита В (HbsAg), гормона роста человека, слитого белка рецептора TNF - Fc-участка IgG (Enbrel™), моноклонального антитела против HER2 (Herceptin™), моноклонального антитела к белку F респираторного синцитиального вируса (Synagis™), моноклонального антитела против TNF-α (Remicade™), моноклонального антитела к гликопротеину IIb/IIIa (Reopro™), моноклонального антитела к CD20 (Rituxan™), анти-тромбина III (AT III), хорионического гонадотропина человека (hCG), альфа-галактозидазы (Fabrazyme™), альфа-идуронидазы (Aldurazyme™), фолликулостимулирующего гормона, бета-глюкозидазы, моноклонального антитела против TNF-альфа, глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоно-подобного пептида-2 (GLP-2), бета-глюкозидазы, альфа-галактозидазы А и фактора роста фибробластов.