Способ выделения днк

Изобретение относится к области биохимии. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяют из биологических объектов на предметах-носителях - марле, бумаге, синтетических тканях. Измельчают биологический объект - костную ткань, роговые ткани. Помещают в пробирку с лизирующим буферным раствором состава 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K, рН 6-7. Получают клеточный лизат и к нему добавляют сорбент магнитных наночастиц оксида железа Fе3О4, модифицированных хитозаном. Смесь перемешивают и инкубируют в течение 25-35 мин. Пробирку помещают на магнитный штатив и разделяют смесь на фракции - сорбент, связанный с ДНК, и надосадочная жидкость. Надосадок удаляют. К осадку приливают элюирующий буферный раствор состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА и инкубируют. Пробирки помещают на магнитный штатив. Разделяют смесь на фракции - сорбент - осадок и надосадок - ДНК, растворенная в элюирующем буферном растворе. Осадок удаляют. В надосадке остается конечный продукт ДНК. Изобретение позволяет получить ДНК из различных биологических объектов и увеличить выход выделяемой ДНК не менее чем в 1,5 раза. 6 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области нано-биотехнологии и может быть использован для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее по тексту - ДНК) из различных биологических объектов.

Известен способ выделения ДНК с применением фенол-хлороформной смеси [1]. Недостатком способа [1] является высокая токсичность применяемых веществ, трудоемкость процедуры выделения, времязатратность (2-3 дня).

Известен способ выделения ДНК с использованием хелатирующего реагента - ионообменной смолы Челекс-100 (Chelex-100) [2]. Недостатком является низкое качество выделенного по способу [2] препарата ДНК из-за наличия посторонних примесей (продуктов лизиса клеток), невозможность выделения ДНК из костных и мышечных тканей, загрязнение препарата ДНК продуктами лизиса клеток (белки, липиды).

Наиболее близким по существу заявляемого способа, прототипом, является способ выделения ДНК с применением геномагнитных нанозахватчиков (GMNC), основанный на связывании молекул ДНК с ДНК-зондом сорбента [3].

Недостатком прототипа является ограниченность области применения способа [3] при необходимости выделения ДНК из широкого спектра различных биологических объектов (крови, слюны, волос), как это бывает, например, при проведении судебно-медицинской экспертизы. Низкое количество выделенной ДНК из костной и мышечной тканей, ногтевых пластин также ограничивает применение прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является расширение перечня используемых для выделения ДНК биологических объектов, повышение производительности работы по выделению ДНК, повышение качества и количества выделенного образца ДНК, упрощение, сокращение продолжительности процедуры выделения, удешевление процесса.

Цели достигают тем, что получают наночастицы оксида железа Fe3O4. Наночастицы модифицируют путем присоединения к ним молекул хитозана. Готовят суспензию из наночастиц, проводят измельчение исследуемого биологического объекта, заливают его лизирующим буфером, инкубируют. Получают клеточный лизат. К лизату добавляют наночастицы, инкубируют, разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, удаляют надосадок, к осадку добавляют элюирующий буферный раствор, перемешивают. Получают суспензию. Суспензию разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, отбирают надосадок. Надосадок содержит выделенный препарат ДНК.

Заявляемый способ осуществляют, например, следующим образом. Отбирают пробу исследуемого биологического объекта, например костную ткань. Пробу измельчают, например костную ткань, - до порошкообразного состояния. Измельченную пробу помещают в чистую пробирку для ДНК-анализа, например - пробирку типа Эппендорф. Известным методом [4] получают наночастицы оксида железа (Fe3O4) и с использованием этих наночастиц готовят сорбент для выделения ДНК. Для этого в чистой посуде готовят ацетатный буферный раствор 0,015 М, например состава (0,5Н СН3СООН, 0,5Н CH3COONa, рН 3,6-5,6). В подготовленном буферном растворе растворяют хитозан, например, с молекулярной массой (Mw=5.0×105) и степенью деацитилирования 94.50%, добиваясь конечной концентрации хитозана 0,5 мг/мл. Затем в полученный буферный раствор хитозана добавляют ранее полученные наночастицы (Fe3O4), добиваясь конечной концентрации наночастиц (Fe3O4) 0,5 мг/мл, и получают взвесь модифицированных хитозаном наночастиц в ацетатном буферном растворе. Взвесь наночастиц в пробирке подвергают воздействию ультразвуковых колебаний и разбивают агрегировавшие наночастицы. Взвесь наночастиц подвергают воздействию ультразвуковых колебаний трижды по 3 мин. В перерывах между периодами воздействия ультразвуком взвесь наночастиц отстаивают в течение 2 мин. Ультразвук используют, например, частотой 20-22 кГц, при интенсивности колебаний не менее 22 кВт/м2. Под воздействием ультразвука взвесь наночастиц становится гомогенной (однородной). В однородную взвесь наночастиц по каплям добавляют раствор щелочи, например 10% водный раствор NaOH, доводят водородный показатель (рН) взвеси до 8-9 единиц. При этом наночастицы начинают заметно оседать на дно сосуда. Процесс оседания контролируют визуально. Затем процесс осаждения наночастиц продолжают, например с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 мин. Под действием центробежной силы происходит разделение взвеси на две фазы: образуются осадок (модифицированные хитозаном наночастицы Fe3O4) и надосадок (супернатант - ацетатный буферный раствор). Супернатант удаляют и осадок промывают, например, дистиллированной водой. Для этого к осадку добавляют дистиллированную воду (dH2O) в количестве, покрывающем поверхность осадка. Взбалтывая сосуд, например - пробирку, промывают наночастицы. Затем наночастицы осаждают, например, с помощью центрифугирования 1000 об/мин в течение 3 мин, и удаляют дистиллированную воду. Описанным образом повторно проводят процедуру промывания осажденных наночастиц дистиллированной водой. Отмытые наночастицы осаждают, например с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 мин, удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,015 М ацетатный буфер (рН 5,0).

Навеску ранее приготовленного анализируемого биологического объекта, например измельченную пробу костной ткани в 5 г, помещают в пробирку и заливают лизирующим буферным раствором, например, состава: 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K (ph 6-7, 20-25°С). Лизирующий раствор перемешивают (суспендируют) с измельченной пробой и получают суспензию, содержащую лизирующий буферный раствор и пробу костной ткани. Суспензию инкубируют, например, в течение 25-35 мин. После инкубации пробирку с суспензией подвергают воздействию постоянного магнитного поля, например, помещая пробирку на стандартный лабораторный магнитный штатив. Под действием постоянного магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - клеточный лизат и надосадок - ацетатный буферный раствор. Образовавшийся надосадок удаляют и получают осадок - клеточный лизат, содержащий фракцию препарата ДНК из пробы.

К клеточному лизату добавляют ранее приготовленный сорбент Fe3O4 в 0,015 М ацетатном буферном растворе, например, в количестве 20 мкл взвеси модифицированных наночастиц на 1 мл клеточного лизата. Взвесь перемешивают (суспендируют), например, автоматической пипеткой. Затем перемешанную взвесь инкубируют в течение 30 мин, при температуре в диапазоне плюс 15-30°С. Пробирку с взвесью подвергают воздействию постоянного магнитного поля, например, путем помещения пробирки на стандартный лабораторный магнитный штатив. Под воздействием магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - сорбент Fe3O4 со связавшимися с ним молекулами ДНК и надосадок - лизирующий буферный раствор. Надосадок (супернатант) удаляют, а к осадку приливают отмывочный (элюирующий) буферный раствор, например, состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА. Смесь перемешивают, например, автоматической пипеткой, затем пробирку помещают на стандартный лабораторный магнитный штатив, где под действием постоянного магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - сорбент наночастиц Fe3O4 и надосадок - элюирующий буферный раствор с молекулами ДНК. Надосадок отбирают в чистые емкости, например пробирки типа Эппендорф. Отобранный надосадок является конечным продуктом - раствором, содержащим выделенный препарат ДНК. Выделенный препарат ДНК в растворе применяют по назначению, например для постановки реакции амплификации.

Вышеописанным путем ДНК выделяют также из мышечных тканей, роговых тканей животных, ногтевых пластин, биологических объектов на предметах-носителях - марле, бумаге, синтетических тканях, крови различного состояния, спермы, волос, ногтевых пластин. Выделение ДНК из роговых тканей животных, ногтевых пластин проводится так же, как из костной ткани: перед процедурой выделения необходимо измельчить биологический объект. Однако для экстракции ДНК с предметов-носителей необходимо предварительно сделать смыв биологического материала. Для этого предмет-носитель (марля, бумага, синтетические ткани) размером 1×1 см помещают в 1 мл дистиллированной воды (dH2O) и инкубируют при температуре плюс 56-70°С, получают смыв биологического материала. Затем отделяют предмет-носитель и работают со смывом по описанному выше методу.

Заявляемый способ позволяет значительно быстрее, по сравнению с аналогами [1, 2], выделить ДНК - процедура выделения ДНК занимает не более 1,5 часов для самых сложных объектов. Выход продукта по заявляемому способу составляет до 200 нг (нанограмм) ДНК из 5 г костного порошка. У прототипа - не более. 150 нг из 5 г костного порошка. То есть заявляемый способ позволяет увеличить выход выделяемого препарата ДНК не менее чем в 1,5 раза. Заявляемый способ позволяет выделить ДНК из биологических материалов, например мышечной ткани, рогов, шерсти животных, ногтевых пластин, неприменимых для извлечения ДНК по способу-прототипу [3].

Спектрофотометрически опреденная степень очистки ДНК, например от примесей - белков и липидов по величине отношения длин волн А260280, составляет 1,8-2,0. Это соответствует общепринятому стандарту чистоты ДНК, то есть выделенный заявляемым способом препарат чист.

Заявляемый способ - безопасный, применяемые при выделении ДНК компоненты абсолютно безвредны для человека. Способ позволяет выполнять выделение ДНК из широкого спектра биологических объектов, недоступных для прототипа и аналогов, то есть обладает расширенной областью применения. Перечисленные результаты применения заявляемого способа подтверждают его новизну. Заявляемый способ выделения ДНК - осуществимый с применением стандартных технических устройств и оборудования в промышленном производстве продуктов питания, в деятельности организаций здравоохранения, полиции, животноводства. Это соответствует предъявляемому к изобретениям критерию «промышленная применимость»,

Предлагаемый способ выделения ДНК необходим специалистам различных областей, опирающимся в своей работе на данные молекулярно-генетического анализа, например диагностической медицине при определении заболеваний по образцу ДНК (гепатит, ВИЧ, наследственные заболевания), судебно-медицинской экспертизе, ветеринарии, сельском хозяйстве.

Приведенный пример применения предлагаемого изобретения показывает его полезность, например, для диагностики заболеваний людей в медицине и сельскохозяйственных животных - в ветеринарии. Применение предлагаемого способа выделения ДНК существенно расширяет перечень объектов, используемых для извлечения нуклеиновых кислот, например при производстве судебно-медицинской экспертизы.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый способ выделения ДНК имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве аналитического и диагностического оборудования, в деятельности организаций пищевой промышленности, здравоохранения, животноводства, правоохранительных органов посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Mathew C.G. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA [Текст] / C.G.Mathew// Nucleic Acids (Methods in Molecular Biology, volume 2). - 1984. - pp.31-34.

2. Walsh P.S. Chelex®100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing From Forensic Material [Текст] / P.S. Walsh, D.A. Metzger // BioTechniques. - 1991. - pp.506-513. Patent Nos. US 5,494,647/A/.

3. Xiaojun Z. Collection of Trace Amounts of DNA/mRNA Molecules Using Genomagnetic Nanocapturers [Текст] / Z. Xiaojun, T-D.Rovelyn, W.Kemin, T.Weihong // Analytical Chemistry. - Vol.75, №14, 15.07.2003, pp.3476-3483 (ПРОТОТИП).

4. Губин С.П. Магнитные наночастицы: методы получения, строения и свойства [Текст] С.П.Губин, Ю.А.Кошкаров // Успехи химии 74(6), 2005. - С.539-568.

1. Способ выделения ДНК из биологических объектов, заключающийся в том, что биологический объект измельчают и помещают в пробирку с лизирующим буферным раствором состава: 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K, рН 6-7, получают клеточный лизат, к лизату добавляют сорбент магнитных наночастиц, модифицированных хитозаном, перемешивают и инкубируют в течение 25-35 мин, пробирку помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент, связанный с ДНК, и надосадочная жидкость, надосадок удаляют, а к осадку приливают элюирующий буферный раствор состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА, инкубируют, пробирки помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент - осадок и надосадок - ДНК, растворенная в элюирующем буферном растворе, осадок удаляют, в надосадке остается ДНК-конечный продукт.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют костную ткань.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют роговые ткани.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предметах-носителях.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе - марле.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе - бумаге.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе - синтетической ткани.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу формирования систем маркеров метилирования ДНК. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в медицине и в фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и касается способа диагностики рака мочевого пузыря (РМП) и набора для его осуществления.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для направленной модификации последовательности дуплексной ДНК (днДНК). .
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики. .

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной генетике микроорганизмов и касается способов выявления экспрессирующихся генетических детерминант патогенных микроорганизмов рода Burkholderia с использованием реакций обратной транскрипции и сопряженной амплификации (ОТ-ПЦР) для их последующего структурно-функционального анализа, что, в свою очередь, позволит оценить влияние адаптационных изменений клеток при изменении условий внешней среды на выраженность важнейших биологических характеристик микроорганизмов, в частности вирулентности и устойчивости к антимикробным препаратам.
Изобретение относится к нефтеперерабатывающей и нефтехимической отраслям промышленности. .

Изобретение относится к нефтеперерабатывающей и нефтехимической отраслям промышленности и может быть использовано для увеличения глубины переработки углеводородсодержащего сырья.

Изобретение относится к методам лабораторной диагностики, в частности к способу диагностики амилоидоза при болезни Альцгеймера. .

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано при измерении давления жидких и газообразных средств. .

Изобретение относится к измерительной технике. .
Изобретение относится к способу получения покрытия, содержащего углеродные нанотрубки, фуллерены и/или графены. .

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для применения в трансплантологии, травматологии, хирургии и онкологии и может быть использовано для замещения костных дефектов.

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии и кардиологии, а именно к получению лекарственного средства в виде биологически активного нанопрепарата, обладающего антигипоксической и антиоксидантной активностью.

Изобретение относится к целлюлозным формованым изделиям с тонкодисперсными стабилизированными включениями органических соединений, способу их получения и применению

Изобретение относится к области биохимии

Наверх