Конъюгаты антагониста пептида аналога бомбезина

Изобретение относится к диагностическому и терапевтическому лекарственному средству, представляющему собой конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I), [A-(B)_n]_x-C, где А представляет собой хелатор металла, содержащий по меньшей мере один радионуклидный металл, В представляет собой спейсер, связанный с N-концом С, или ковалентную связь, и С представляет собой антагонист пептида аналога бомбезина, где дополнительно х представляет собой целое число от 1 до 3 и n представляет собой целое число от 1 до 6. 12 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 13 пр.

 

Введение

Изобретение относится к терапевтическим или диагностическим/визуализирующим радиофармацевтическим средствам, препарату и их применению, где терапевтические или диагностические радиофармацевтические средства определяются как связывающие фрагменты, имеющие сродство к и способные связываться с рецепторами бомбезина и более предпочтительно с рецептором гастрин-высвобождающему пептида (GRP). Связывающие фрагменты метят с помощью металл-комплексообразующей группы для альфа-, бета-, гамма- и позитрон-испускающих изотопов. Применение охватывает обработку субъекта, имеющего новообразование, что включает стадию введения субъекту эффективного количества терапевтического радиофармацевтического средства, имеющего металл, хелатированный с хелатообразующей группой, присоединенной к фрагменту, способному связываться с рецепторами бомбезина и, более предпочтительно, с рецептором гастрин-высвобождающего пептида (GRP), который сверхэкспрессируется на опухолевых клетках. Применение включает диагностирование или визуализацию субъекта, имеющего новообразование, используя диагностическое/визуализирующее радиофармацевтическое средство, имеющее металл, хелатированный с хелатообразующей группой, присоединенной к фрагменту, способному связываться с рецепторами бомбезина и, более предпочтительно, с рецептором гастрин-высвобождающего пептида (GRP), который сверхэкспрессируется на опухолевых клетках. Способ включает создание терапевтического или диагностического соединения из соединения-предшественника, включающего металл-хелатообразующую группу, ковалентно связанную с фрагментом, способным связываться с рецепторами бомбезина и, более предпочтительно, с рецептором гастрин-высвобождающего пептида (GRP).

Предпосылки создания изобретения

При создании эффективного радиофармацевтического индикатора для применения в качестве диагностического средства, является чрезвычайно важным, чтобы лекарственные средства имели подходящие нацеливающие и фармакокинетические свойства в условиях in vivo. Fritzberg и др. (1992, J. Nucl. Med., 33:394) дополнительно указывают на то, что радионуклидная химия и ассоциированные связывания нуждаются в оптимизации присоединения и мечения химических модификаций носителя биологической молекулы. Следовательно, тип радионуклида, тип биомолекулы и способ, используемый для их связывания друг с другом, могут оказывать очень важное влияние на свойства радиоактивного индикатора.

Пептиды являются биомолекулами, которые принимают чрезвычайно важное участие во многих физиологических процессах, включая действия в качестве нейромедиаторов, гормонов и антибиотиков. В исследованиях было показана их значимость в таких областях, как нейробиология, иммунология, фармакология и клеточная биология. Некоторые пептиды могут действовать в качестве химического мессенджера. Они связываются с рецептором на поверхности клетки-мишени и биологическое действие лиганда передается в целевую ткань. Следовательно, свойство связывания лиганда со специфическим рецептором может использоваться путем мечения лиганда с помощью радионуклида. Теоретически, высокая аффинность лиганда к рецептору облегчает удерживание радиоактивно меченного лиганда в тканях, экспрессирующих рецептор. Тем не менее, в настоящее время все еще проводятся исследования относительно того, какие пептиды могут быть эффективно мечены и в каких условиях следует вводить метку. Хорошо известно, что специфичность рецептора к пептиду лиганда может изменяться при осуществлении химической реакции. Поэтому необходимо определить оптимальную пептидную конструкцию.

Опухоли сверхэкспрессируют рецепторы различных типов, с которыми специфически связываются пептиды. В следующих публикациях Boerman и др., Seminar in Nuclear Medicine, 2000, 30 (3), 195); Reubi и др. J. Nucl. Med., 2005, 46, (доп.1) 67S; Reubi, J.C., Endocrine Reviews, 2003, 24 (4), 389 приведен неполный перечень пептидов, которые специфически связываются с рецепторами поверхности клеток в новообразованиях, то есть, соматостатин, вазоактивный пептид кишечника (VIP), бомбезин, связывающийся с рецептором гастрин-высвобождающего пептида (GRP), гастрин, холецистокинин (ССК) и кальцитонин.

Потенциальная полезность специфичных к рецепторам пептидов, меченных металлом, для сцинтиграфической визуализации и лучевой терапии поясняется на примерах аналогов соматостатина, например, ¹¹¹In-DTPA конъюгированный Октреотид, разрешенное FDA диагностические визуализирующее средство, Octreoscan®, которое выпускается Covidien в США (Lowbertz и др., Seminars in Oncology, 1994, 1) и Reubi и др., J. Nucl. Med., 2005, 46, 67S-75S и ссылки, приведенных в этих источниках, соответственно. Октреотид и его аналоги ковалентно связаны с визуализирующими изотопами некоторых металлов (^99mTc, ¹¹¹In, ⁶⁸Ga) и с терапевтическими изотопами металлов (¹⁰⁵Rh, ^186/188Re, ¹⁵³Sm, ⁹⁰Y, ¹⁶⁶Но, ¹⁷⁷Lu). Конъюгаты, меченные металлами, специфически связываются с рецептором, и при связывании с рецептором, конструкция интернализируется рецептором и меченные металлом специфические для рецептора пептиды или их метаболиты захватываются клетками-мишенями.

Вышеуказанный принцип в дальнейшем распространяется на пептиды, авидные к рецептору GRP (пептиды, которые обладают высокой аффинностью к рецептору), в которых для сцинтиграфической визуализации и лучевой терапии используются агонисты бомбезина, конъюгированные с металлами. (Smith и др., Anticancer Res,, 23 (2003), 63-70; Baidoo и др., Bioconjug. Chem., 9 (1998), 218-225; Gali и др., Bioconjug. Chem., 12 (2001), 354-363; Smith и др., Bioconjug. Chem., 14 (2003), 93-102, Cancer Res., 63 (2003), 4082-4088; Rogers и др., In M.Nicolini и U.Mazzi, Editors, Technetium, rhenium and other metals in chemistry and nuclear medicine, SGE Editoriali, Italy (1999), 519-525; Zhang и др., Cancer Res., 64 (2004), 6707-6715; Lantry и др., EANM, Helsinki (Finland) (2004); Under и др., J. Nucl. Med., 45, (2004) (5), 169P [реферат 482]. Chen и др., J. Nucl. Med., 45 (2004), 1390-1397; Johnson и др., Cancer Biother Radiopharm. 2006, 21(2), 155-66, Smith и др., Nucl. Med. Biol., 2005, 32 733-40).

В Chen и др. (Appl. Radial, hot., 2007, (In Press)), Waser и др. (Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2007 34, 95-100) и Lantry и др. (J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52) описали визуализацию и радиотерапию с помощью агониста бомбезина, ¹⁷⁷Lu-DOTA, связанного с -NH-CH₂-CO-[4-аминобензоил]-QWAVGHLM-NH₂))(¹⁷⁷Lu-AMBA).

Некоторые патенты и патентные заявки относятся к агонистам бомбезина, меченным металлами. Volkert и др. (US 2007/0065362 А) заявляют агонисты бомбезина, меченные металлами общей структуры

Фрагмент, меченный металлом-Спейсерная группа-агонист бомбезина для визуализации и терапевтического применения. Другие патенты и патентные заявки этих же изобретателей включают: US 6,921,526 В (2005), US 7,060,247 В, US 7,147,838 В (2006) и WO 2002/087631 A1.

Уровень техники

Принцип, лежащий в основе выбора агонистов в качестве радиофармацевтического средства во всех вышеуказанных публикациях, состоит в том, что они продуцируют или проявляют ответ с помощью GRP рецепторов при взаимодействии, где радиофармацевтическое средство после этого интернализируется внутрь клетки с помощью эндоцитоза. GRP антагонисты противодействуют эффекту агониста и не интернализируются в клетки и, следовательно, полагают, что антагонисты не являются пригодными для радиосцинтиграфической визуализации и радиотерапевтических целей. Вплоть до настоящего времени общепринятое мнение состояло в разработке соединений со свойствами хорошей интернализации радиоактивного лиганда, что приводило к высокому накоплению в условиях in vivo радиоактивных лигандов в опухолях, что, как полагали, было необходимым для оптимальной визуализации и радионуклидной терапии в условиях in vivo. Из молекулярно-фармакологических исследований хорошо известно, что эффективная интернализация обычно обеспечивается агонистами (Bodei и др., J. Nucl. Med., 2006;47, 375-377; Koenig и др.. Trends Pharmacol. Sci., 1997; 18, 276-287, Cescato и др., J. Nucl. Med., 2006, 47, 502-511. Ginj и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103, 16436-16441) и недавно, было показано, что для рецепторов соматостатина, высокоаффинные антагонисты рецепторов соматостатина, меченные металлами, плохо интернализируются в опухолевые клетки и обеспечивают эквивалентное или даже лучшее в условиях in vivo поглощение в опухоль на моделях опухолей у животных по сравнению с соответствующими агонистами, которые великолепно интернализуются. GRP рецепторы сверхэкспрессируются в некоторых новообразованиях (Cornelio и др., Ann. Onco., 2007, 18, 1457-1466 и ссылки, приведенные в этом источнике), таких как рак и метастазы предстательной железы, рак и метастазы молочной железы, желудочно-кишечные стромальные опухоли, мелкоклеточный рак легкого, почечноклеточный рак, нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы, плоскоклеточный рак головы и шеи, нейробластомы и плоскоклеточный рак пищевода. GRP рецепторы также свырхэкспрессируются в связанных с опухолями кровеносных сосудах рака яичников, эндометрия и поджелудочной железы человека. (Fleischmann и др., Cell One., 2007, 29, 421-33). Следовательно, чрезвычайно важным является создание потенциальных радиофармацевтических средств с антагонистическими свойствами для визуализации и радиотерапии.

Jensen и др. (Pharma. Reviews, 2008 (в печати)) недавно описали фармакологию рецепторов трех различных подтипов рецептора бомбезина, где GRP рецептор относится к подтипу 2.

В недавней публикации Cescato и др. (J. Nucl. Med., 2008, 49, 318-26) показали, что ^99mTc-N₄-меченный антагонист бомбезина может быть предпочтительным по сравнению с агонистами для нацеливания на опухоли.

Более ранние изобретения в области соединений, нацеленных на GRP-рецептор, описаны в WO 2007/109475 А2, WO 2007/095443 А2, US 2008/0008649 A1 и US 7,226,577 B2 с хелатообразующим металлом-линкером-бомбезином с общей схемой, представленной ниже.

Метал-Хелатор-Линкер-Аналог бомбезина

В соответствии с WO 2007/095443 А2, L70 образец с предпочтительной последовательностью ¹⁷⁷Lu-DOTA-Gly-аминобензоил-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ проявляет себя как агонист, где измеряют поглощение через 1 и 24 часа. Поглощение не является оптимальным для терапевтических целей и нуждается в улучшении.

Кроме этих патентов и заявок, были опубликованы доклинические и клинические исследования (Waser и др., Eur. J. Nucl. Medicine, 2007, 34, 95-100; J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52).

В соответствии с выбором антагониста, который нацелен на GPR рецептор в различном сайте с высоким сродством, в настоящем изобретении было показано, что комбинация стратегии спейсера приводит к неожиданно высокому и персистирующему поглощению опухолями, в сочетании с низким поглощением и быстрым клиренсом в органах, не являющихся мишенями. В сравнительном исследовании, наблюдали значительно более высокое поглощение (>2X) в опухоли при использовании сходного линкера. Исходя из исследований в условиях in vitro, подтверждающих достоверность антагонистических свойств аналогов бомбезина, было обнаружено, что даже после добавления N-концевого спейсера, хелатора и металла, эти антагонистические действия сохраняются и передаются с очень хорошими характеристиками в условиях in vivo, что касается соотношений опухоль-фон.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение новых конъюгатов антагониста пептида бомбезина, которые проявляют высокое поглощение и высокую стабильность в условиях in vivo (сыворотка и ткани человека).

Сущность

Описание изобретения

В первом аспекте, изобретение относится к конъюгатам антагониста пептида аналога бомбезина, которые селективно связываются с рецепторами бомбезина и более предпочтительно с рецептором GRP без запуска интернализации в клетку и без передачи сигналов путем мобилизации кальция, при этом противодействуя эффектам, индуцированным агонистом в этих двух системах, где конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина имеет общую формулу (I):

где

x представляет собой целое число от 1 до 3,

n представляет собой целое число от 1 до 6,

А представляет собой хелатор металла, содержащий по меньшей мере один радионуклидный металл, предпочтительно пригодный для диагностического или терапевтического применения, более предпочтительно для визуализации или лучевой терапии,

В представляет собой спейсер, связанный с N-концом С или ковалентную связь,

С представляет собой антагонист пептида аналога бомбезина с последовательностью С-1-С-4, где

С-1: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Xaa₃ ¹³-Xaa₄ ¹⁴-ZH,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

К представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Хаа₃ представляет собой статин, аналоги и изомеры статина, 4-Am, 5-МеНрА, 4-Am, 5-МеНхА или α-замещенные аминокислоты,

Хаа₄ представляет собой Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, или изо-Bu-Cly, и

Z представляет собой NH или О;

С-2: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃,

где

Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃ представляет собой

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

и

К представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala;

С-3: Xaal⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His¹²-Xaas¹³-Хаа₆ ¹⁴-ZH,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Хаа₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Хаа₅ представляет собой Leuψ-CH₂NH-,

Хаа₆ представляет собой Cys, Phe, Trp, Tpi или Тас,

где Tpi и Тас имеют следующие значения:

и Z представляет собой NH, или О;

С-4: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ^1l-His¹²-Xaa₇,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Xaa₇ представляет собой Leu-O-Алкил, или Leu-NH-алкил.

Изобретение также относится к их фармацевтически приемлемым солям этих конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина неорганических или органических кислот, а также к гидратам, комплексам, сложным эфирам, амидам, сольватам и пролекарствам этих соединений, имеющих общую химическую формулу (I).

Описание А (хелатор металла):

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, хелатор металла (А) представляет собой хелатор металла для трехвалентных металлов или для пятивалентных металлов и их близкие аналоги.

Предпочтительно, хелатор металла (А) для трехвалентных металлов выбирают из группы, включающей:

Хелаторы на основе DOTA, NODASA, NODAGA, NOTA, DTPA, EDTA, ТЕТА и TRITA и их близкие аналоги,

где

DOTA представляет собой 1,4,7,10-тетразациклододекан-N, N',N",N'" тетрауксусную кислоту,

DTPA представляет собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту,

EDTA представляет собой этилендиамин-N,N'-тетрауксусную кислоту,

ТЕТА представляет собой 1,4,8,11-тетраазациклодо декан-1,4,8,11-тетрауксусную кислоту,

и

NOTA представляет собой 1,4,7-триазациклононанацетилацетоуксусную кислоту.

Более предпочтительно, хелатор металла (А) для трехвалентных металлов выбирают из группы, включающей:

хелаторы на основе DOTA, NOTA, DTPA и ТЕТАи их близкие аналоги.

Структуры этих хелатообразующих лигандов в их полностью депротонированной форме представлены ниже.

Еще более предпочтительно, хелатор металла (А) для трехвалентных металлов выбирают из группы, включающей DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) и полиаза-поликарбоксилат макроциклы, такие как DOTA (1,4,7,10-тетразациклододекан-N N',N",N" тетрауксусная кислота) и их близкие аналоги.

Предпочтительно, хелатор металла (А) для пятивалентных металлов выбирают из группы, включающей

2-гидразино никотинамид (HYNIC), N₄-xenaTOpbi, N₄-X (N₄ может быть линейным или макроциклическим и Х может представлять собой азид амин, ОН, галоген, о-, м-, n-амино бензил метапаракарбоксибензил, и карбокси (Nock, В. и др. (2003 [^99mTc]Demobesin 1, a novel bombesin analogue for GRP receptor-targeted tumour imaging. Eur. I. Nucl. Mol. Imaging, 30, 247-258)), Десферриоксамин (DFO), и N_rS_(4-r) хелаторы.

и

где

R₁-R₁₅ независимо друг от друга представляют собой атомы водорода или (C₁-C₄) алкильные группы,

где, в фрагменте вышеприведенной формулы, t представляет собой 1 или 2 или 3 и по меньшей мере один из атомов углерода в указанном фрагменте замещен с помощью Y или незамещен с помощью Y,

R₁₆ представляет собой атом водорода или CO₂ (C₁-С₄)алкильную группу;

R₁₇ и R₁₈ независимо друг от друга представляют собой (C₁-C₄) алкильные группы или фенильные группы;

R₁₉ представляет собой СН₂-СООН или его функциональное производное;

Е представляет собой (C₁-С₄)алкилен, или фенилен;

необязательно (C₁-С₄)алкилен, замещенный с помощью СО₂-алкила, СН₂-СОалкила, CONH₂, или CONHCH₂-CO₂-алкила;

необязательно фенилен, замещенный с помощью СО₂-алкила, где алкильные группы имеют от 1 до 4 атомов углерода;

G представляет собой NH или S;

Y представляет собой функциональную группу, способную связываться со свободной аминогруппой пептида (М-конца) или со спейсером; и Z' представляет собой S или О.

N₄-хелаторы предпочтительно представляют собой,

где m представляет собой целое число от 1 до 4.

N_rS_(4-r) хелаторы определяются, где r представляет собой целое число от 1 до 4.

Указанная функциональная группа Y предпочтительно включает изоцианато, азотиоцианато, формил, галонитрофенил, диазоний, эпокси, трихлор-s-триазинил, этиленимино, хлорсульфонил, алкоксикарб-имидоил, (замещенный или незамещенный) алкилкарбонилоксикарбонил, алкилкарбонилимидазолил, сукцинимидо-оксикарбонил; где указанная группа присоединена к (C₁-C₁₀) углеводородному бирадикалу. Подходящими примерами углеводородных бирадикалов являются бирадикалы, производные бензола, (C₁-С₆) алканов, (С₂-С₆) алкенов и (С₁-С₄)-алкилбензолов, и их близкие аналоги.

Предпочтительно N_t(4-t) хелаторы выбирают из группы, включающей хелаторы на основе бисамино бистиола (ВАТ) для радионуклидного металла технеция, меркапто-ацетил-глицил-глицил-глицин (MAG3) для радионуклидного металла технеция и их близкие аналоги.

Более предпочтительно, хелатор металла (А) для пятивалентных металлов выбирают из группы, включающей

и их близкие аналоги,

где R₁-R₁₉, Z', Y, G и t имеют значения, указанные выше.

Предпочтительно, r представляет собой целое число от 2 до 4 и более предпочтительно r представляет собой 2 или 3.

Предпочтительно, m представляет собой целое число от 1 до 2, более предпочтительно m представляет собой 1.

Хорошо известные хелаторы металлов, такие как линейные, макроциклические, тетрапиридиновые и N₃S, N₂S₂ или N₄ хелаторы описаны в US 5,367,080 A, US 5,364,613 А, US 5,021,556 A, US 5,075,099 A, US 5,886,142 А, раскрытие которых полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Хорошо известные хелаторы металлов, такие как хелаторы на основе HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, ТЕТА, бисамино бистиола (ВАТ), описаны в US 5,720,934 А, раскрытие которого полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Хорошо известные хелаторы металлов, такие как Десферриоксамин (DFO), описаны Doulias и др. (2003) Endosomal and lysosomal effects of desferrioxoxamine: protection of HeLa cells from hydrogen peroxide-induced DNA damage and induction of cell-cycle arrest. Free Radic. Biol. Med., том 35, выпуск 7:719-28.

Доступны различные хелатообразующие средства и они описаны Banerjee и др., (Nucl. Med. and Biology, 2005, 32, 1-20 и ссылки, приведенные в это источнике), которые включены в настоящую заявку путем ссылки.

2-гидразино никотинамид (HYNIC) представляет собой другой класс хелатообразующей группы (А), в присутствии солиганда, который широко используется для инкорпорации ^99mTc и ^{186, 188}Re (Schwartz м др. Bioconj. Chem., 1991. 2, 333-6; Babich u др., J Nucl. Med., 1993, 34, 1964-70; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, 25-30; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, сс.32, сс.1-10)

DTPA используется в Octreoscan® (выпускаемый на рынок Covidian) для комплексообразования ¹¹¹In и некоторые модификации описаны в литературе (Brechbiel и др., Biocon. Chem., 1991, 2, 187-194; Li и др., Nucl. Med. Biol., 2001, 28, 145-154).

Хелаты DOTA типа для применения при лучевой терапии описаны Tweedle и др., Патент US 48885363. Другие полиаза макроциклы для хелатообразования с изотопами трехвалентных металлов описаны Maecke и др. в Bioconj. Chem., 2002, 13, 530 и включены в настоящую заявку путем ссылки.

N₄-хелаторы, ^99mTc-N₄-хелатор используется для мечения пептидов в случае минигастрина для нацеливания на ССК-2 рецепторы (Nock и др., J. Nucl. Med., 2005, 46, 1727-36).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, радионуклидный металл пригоден для комплексообразования с хелатором металла и приводит к получению радиоактивного хелатора металла для визуализации. Предпочтительно, радионуклидный металл выбирают из группы, включающей ^133mIn, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁵²Fe, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ²⁰³Pb, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁵¹Cr, ^52mMn, ¹⁵⁷Gd, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹³¹I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁶⁴Cu и ⁸²Br. Более предпочтительно, радионуклидный металл выбирают из группы, включающей ^99mTc, ⁶⁷Ga,⁶⁸Ga, ¹¹¹In, и ¹²³I. Еще более предпочтительно радионуклидный металл представляет собой ⁶⁸Ga. Еще более предпочтительно радионуклидный металл представляет собой ^99mTc.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, радионуклидный металл пригоден для комплексообразования с хелатором металла и приводит к получению радиоактивного хелатора металла для лучевой терапии. Предпочтительно, радионуклидный металл выбирают из группы, включающей ¹⁸⁶Re, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ⁶⁸Ga, ⁶⁹Er, ¹²¹Sn, ¹²⁷Те, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁶¹Tb, ¹⁰⁹Pd, ¹⁸⁸Rd, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁷⁷As, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵¹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁷²Tm, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag,, ¹²⁵I, ¹²³I, ²¹³Bi, ²²⁵Ac, ¹²⁹I, ⁶⁴Cu и ^177mSn. Более предпочтительно, радионуклидный металл выбирают из группы, включающей ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm,⁶⁸Ga, и ¹⁷⁷Lu.

В дальнейшей альтернативе первого аспекта радионуклидный металл представляет собой радиоактивный галоген (изотопы йода и брома), радиоактивный галоген связывается непосредственно с пептидом, например, путем химической реакции с Tyr или Trp фрагментом в пептиде, или необязательно А может представлять собой Tyr или Trp.

Предпочтительные радиодиагностические средства (⁶⁷Ga, ¹¹¹In) и радиотерапевтические средства (⁹⁰Y, ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu) необязательно содержат хелатированный +3 ион металла из класса элементов, известных как лантаноиды. Типичные радиоактивные металлы в этом классе включают изотопы ⁹⁰Иттрий, ¹¹¹Индий, ¹⁴⁹Прометий, ¹⁵³Самарий, ¹⁶⁶Диспрозий, ¹⁶⁶Гольмий, ¹⁷⁵Иттербий и ¹⁷⁷Лютеций. Все эти металлы (и другие в классе лантаноидов) имеют очень сходные химические свойства, в том смысле, что они остаются в +3 окисленном состоянии и предпочтительно хелатируют лиганды, которые несут тяжелые (кислород/азот) донорные атомы.

Описание В (спейсер):

В представляет собой спейсер, связанный с N-концом С, или ковалентную связь.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения В представляет собой соединение, имеющее формулу (II)

где

B₁ представляет собой ковалентную связь, встречающуюся в природе аминокислоту, невстречающуюся в природе аминокислоту, линейный диамин или циклический диамин,

B₂ представляет собой ковалентную связь, встречающуюся в природе аминокислоту, невстречающуюся в природе аминокислоту, линейную карбоновую кислоту или циклическую карбоновую кислоту,

при условии, что оба B₁ и B₂ не могут одновременно представлять собой ковалентные связи и что, когда b) представляет собой диамин, то B₂ представляет собой карбоновую кислоту (то есть. В₂ не может представлять собой связь или встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту в этом случае).

Предпочтительно невстречающаяся в природе аминокислота представляет собой соединение, имеющее любую из формул (III), (IV), (V) или (VI)

где

где

а представляет собой целое число от 0 до 3,

b представляет собой целое число от 0 до 3,

и относительные схемы замещения или необязательно 1,2-, 1,3- или 1,4-

Предпочтительно,

а представляет собой 0 или 1,

b представляет собой 0 или 1,

где

с представляет собой целое число от 1 до 24,

d представляет собой целое число от 1 до 6.

Предпочтительно,

с представляет собой целое число от 1 до 15, более предпочтительно с равен от 1 до 8,

d представляет собой целое число от 1 до 3, более предпочтительно d равен 1.

где

Е' представляет собой NH, или СН₂,

f представляет собой целое число от 0 до 6,

g представляет собой целое число от 0 до 6;

когда Е' представляет собой CH₂, то 6-членное кольцо необязательно замещено в любом положении углерода 6-членного кольца на том же самом углероде кольца или на различных углеродах,

когда Е' представляет собой NH, то 6-членное кольцо необязательно замещено в любом положении углерода 6-членного кольца на том же самом атоме углерода кольца или на различных атомах углерода и/или на атоме азота при условии, что f или g представляет собой целое число, равное или больше 1.

Предпочтительно,

Е' представляет собой NH,

f представляет собой целое число от 0 до 3,

g представляет собой целое число от 0 до 3;

где

i представляет собой целое число от 1 до 6,

j представляет собой целое число от 1 до 6,

P представляет собой О или H₂.

Предпочтительно,

i представляет собой целое число от 1 до 3,

j представляет собой целое число от 1 до 3,

P представляет собой О.

Более предпочтительно спейсер выбирают из группы, включающей 4-амино-1-карбоксиметилпиперидин, (R,S)-диаминоуксусную кислоту, PEG_1-24, Sar_5-10, 8-аминооктановую кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 4-(2аминоэтил)-1-карбоксиметил пиперазин, диаминомасляную кислоту, гиппуровую кислоту, 4-амино-1-Вос-пиперидин-4-карбоновую кислоту, Gly-аминобензойную кислоту, 5-амино-3-окса-пентил-полуамид янтарной кислоты, Peg_1-24-4-амино-1-карбоксиметил пиперидин, Dab(шикимовую кислоту), (D-Gln)x, (D-Asn)x.

Описание С (последовательность антагониста пептида аналога бомбезина)

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, последовательность антагониста пептида аналога бомбезина выбирают из группы, включающей С-1-С-3, предпочтительно С-1-С-2.

Предпочтительно, последовательность антагониста пептида аналога бомбезина выбирают из группы, включающей:

Посл. соединения 1: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Посл. соединения 9: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃;

Посл. соединения 12: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂;

Посл. соединения 13: Dphe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂.

Предпочтительно, конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина, имеющий формулу (I), содержащий по меньшей мере один радионуклидный металл, выбирают из группы, включающей:

Соединение 1: DOTA-Gly-аминобензоил-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 2: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 3: DOTA-4-амино-1-пиперидин-4-карбоновая кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 4: DOTA-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 5: DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота)-(4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 6: DOTA-диаминомасляная кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 7: ООТА-4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметил-пиперазин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

Соединение 8: DOTA-(5-амино-3-окса-пентил)-полуамид янтарной кислоты-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

Соединение 9: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃;

Соединение 10: DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Cly-His-Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН2)₂-СН₃;

Соединение 11: DOTA-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃;

Соединение 12: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-O-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂;

Соединение 13: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-O-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂;

Соединение 14: N₄-триазолы-dPEG₁-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂.

Другие предпочтительные варианты осуществления

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для соединения, имеющего формулу (I), х представляет собой целое число от 1 до 2, предпочтительно х представляет собой 1.

Если х равен или больше 2, то (В)_n представляет собой линейный спейсер или разветвленный, связанный с N-концом антагониста пептида аналога бомбезина (С).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для соединения, имеющего формулу (I), n представляет собой целое число от 1 до 4, предпочтительно n представляет собой 1 или 3, более предпочтительно 1.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для соединения, имеющего формулу (I), А дополнительно представляет собой хелатор металла, содержащий по меньшей мере один атом холодного металла, соответствующий или эквивалентный перечисленному выше радионуклидному металлу. Такие соединения пригодны для исследований связывания в условиях in-vitro in-vivo и в качестве сравнительных соединений. Перечисленные выше предпочтительные варианты осуществления изобретения применяются в настоящей заявке.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для соединения, имеющего формулу (I), К дополнительно представляет собой Н или предпочтительно Н. Во втором аспекте, изобретение относится к предшественникам конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, которые селективно связываются с рецепторами бомбезина и которые более предпочтительно связываются с GRP рецептором без запуска интернализации в клетку и без передачи сигналов путем мобилизации кальция, при этом противодействуя эффектам, индуцированным агонистом в этих двух системах, где конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина имеет общую формулу (I')

где

х представляет собой целое число от 1 до 3,

n представляет собой целое число от 1 до 6

А' представляет собой хелатор металла,

В представляет собой спейсер, связанный с N-концом С, или ковалентную связь,

С представляет собой антагонист пептида аналога бомбезина с последовательностью С-1-С-4.

Хелатор металла А' представляет собой хелатор металла без радионуклидного металла,

как определено в первом аспекте для А.

Спейсер В и антагонист пептида аналога бомбезина С имеют значения, указанные выше в первом аспекте.

Изобретение также относится к их фармацевтически приемлемым солям конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина неорганических или органических кислот, и к гидратам, комплексам, сложным эфирам, амидам, сольватам и пролекарствам этих соединений, имеющих общую химическую формулу (I').

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, х представляет собой целое число от 1 до 2, предпочтительно х представляет собой 1. Если х равен или больше 2, то (В)_n представляет собой линейный спейсер или разветвленный спейсер, связанный с N-концом антагониста пептида аналога бомбезина (С).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в формуле (I'), n представляет собой целое число от 1 до 4, предпочтительно n представляет собой 1 или 3, более предпочтительно 1.

В третьем аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты антагониста пептида аналога бомбезина, которые имеют формулу (I) или (I'), и фармацевтически приемлемый носитель.

В четвертом аспекте, изобретение относится к применению конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина, которые имеют формулу (I) или (U'), для связывания с рецепторами бомбезина и более предпочтительно рецептора гастрин-высвобождающего пептида (GRP) и/или для ингибирования рецепторов бомбезина и более предпочтительно рецептора гастрин-высвобождающего пептида (GRP).

В пятом аспекте, изобретение относится к способу приготовления конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I)

где n, х, А, В и С имеют значения, указанные выше,

который включает стадию

- Радиоактивное хелатирование конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I'), как определено выше, с подходящим радионуклидным металлом или атомом металла, соответствующим радионуклидному металлу, перечисленному выше.

Предпочтительно, способ приготовления конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I), включает стадию радиоактивного хелатирования с подходящим радионуклидным металлом.

В дальнейшем варианте осуществления, способ приготовления конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I)

где n, х, А, А', В и С имеют значения, указанные выше,

включает дополнительно стадии:

а) Сочетание спейсера В с антагонистом пептида аналога бомбезина С для получения спейсера-антагониста пептида аналога бомбезина с последовательностью С-1-С-4, необязательно повтор стадии а); и

б) сочетание спейсера-антагониста пептида аналога бомбезина с хелатором металла А' для получения конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I'), необязательно повтор стадии б),

вышеописанные стадии осуществляют перед радиохелатированием конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I') с подходящим радионуклидным металлом или атомом металла, соответствующим или эквивалентным радионуклидному металлу, перечисленному выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, n, х, хелатор металла А, хелатор металла А' спейсер В и антагонист пептида аналога бомбезина С имеют значения, указанные выше.

В шестом аспекте, изобретение относится к способу визуализации рецепторов бомбезина и более предпочтительно опухолевых клеток, которые экспрессируют GRP рецептор, и/или опухолевых и периопухолевых сосудов у пациента, который включает стадии:

- введение пациенту радиофармацевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет формулу (I); и

- визуализацию радионуклидного металла у пациента.

Предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта охватывает применение радиофармацевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет формулу (I), для приготовления визуализирующего средства для визуализации рецепторов бомбезина и более предпочтительно опухолевых клеток, которые экспрессируют GRP рецептор, и/или опухолевых и периопухолевых сосудов.

В предпочтительном варианте осуществления опухолевые клетки относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:

- рак предстательной железы, включая метастазы,

- рак молочной железы, включая метастазы,

- желудочно-кишечные стромальные опухоли,

- мелкоклеточный рак легкого,

- почечноклеточный рак,

- нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы,

- плоскоклеточный рак головы и шеи,

- нейробластомы, и

- плоскоклеточный рак пищевода.

Еще более предпочтительно, опухолевые клетки относятся к злокачественным

новообразованиям, которые выбирают из

- рака предстательной железы, включая метастазы, и

- рака молочной железы, включая метастазы.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления опухолевые и периопухолевые сосуды относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из

- рака яичников,

- рака эндометрия, и

- рака поджелудочной железы.

Предпочтительно, опухолевые и периопухолевые сосуды относятся к раку яичников.

В седьмом аспекте, изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболеваний, связанных с опухолевыми клетками и/или опухолевыми и периоопухолевыми сосудами, который включает стадию:

- введение терапевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет формулу (I).

Предпочтительный вариант осуществления седьмого аспекта охватывает применение терапевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет формулу (I), для приготовления лекарственного средства для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с опухолевыми клетками и/или опухолевыми и периоопухолевыми сосудами.

В предпочтительном варианте осуществления заболевания, связанные с опухолевыми клетками, относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:

- рак предстательной железы, включая метастазы,

- рак молочной железы, включая метастазы,

- желудочно-кишечные стромальные опухоли,

- мелкоклеточный рак легкого,

- почечноклеточный рак,

- нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы,

- плоскоклеточный рак головы и шеи,

- нейробластомы, и

- плоскоклеточный рак пищевода.

Еще более предпочтительно, заболевания, связанные с опухолевыми клетками, относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:

- рак предстательной железы, включая метастазы, и

- рак молочной железы, включая метастазы.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления заболевания, связанные с опухолевыми и периопухолевыми сосудами, относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:

- рак яичников,

- рак эндометрия, и

- рак поджелудочной железы.

Предпочтительно, заболевания, связанные с опухолевыми и периопухолевыми сосудами, относятся к раку яичников.

В восьмом аспекте, изобретение относится к набору для препарата радиофармацевтического средства или радиофармацевтического визуализирущего средства, которое имеет формулу (I), где набор включает флакон, содержащий заранее определенное количество конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина формулы (I') и приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или адъювантдля мечения хелатора металла радиоактивным изотопом.

В девятом аспекте, изобретение относится к антагонисту пептида аналога бомбезина с последовательностью С-1-С-4, где

С-1: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Xaa₃ ^l3-Xaa₄ ¹⁴-ZH,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Хаа₃ представляет собой статин, аналоги и изомеры статина, 4-Am,5-МеНрА, 4-Am,5-МеНхА или α-замещенные аминокислоты,

Хаа₄ представляет собой Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, или изо-Bu-Cly, и

Z представляет собой NH или О;

C-2: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃,

где

Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃ представляет собой

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

и

К представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или p-Ala;

С-3: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Xaa₅ ¹³-Хаа₆ ¹⁴-ZH,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Xaa₅ представляет собой Leuψ-CH₂NH-,

Xaa₆ представляет собой Cys, Phe, Trp, Tpi или Тас,

где Tpi и Тас имеют следующие значения:

и Z представляет собой NH, или О;

C-4: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ^1l-His^l2-Xaa₇,

где

Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже:

K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,

Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,

Xaa₇ представляет собой Leu-O-Алкил, или Leu-NH-алкил.

Определения

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы термин "алкил", сам или как часть другой группы, относится к прямоцепочечной или разветвленной алкильной группе с 1-20 атомами углерода, такой как, например, мет» этил, пропил, изо-пропил, бутил, изо-бутил, трет-бутип, пентил, изо-пентил, нео-пет гептил, гексил, децил. Алкильные группы также могут быть замещены, например, атомами галогена, гидроксильными группами, С₁-С₄-алкокси группами или С₆-С₁₂-арильными группами. Более предпочтительно алкил представляет собой C₁-С₁₀-алкил, C₁-С₆-алкил или С₁-С₄-алкил.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "низший неразветвленный или разветвленный алкил(ен)" будут иметь следующие значения: замещенный или незамещенный, неразветвленный или разветвленный одновалентный, двухвалентный или трехвалентный радикал, состоящий из углеродов и водородов, не содержащий ненасыщенности и имеющий от одного до восьми атомов углерода, например, включая, но не ограничиваясь только ими, метил, этил, н-пропил, н-пентил, 1,1-диметилэтил (трет-бутил), н-гептил и другие. Этот фрагмент может быть незамещен или замещен, например, атомами галогена, гидроксильными атомами, C₁-C₄-алкокси группами или С₆-С₁₂-арильными группами.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "фениленовая" группа основывается на двух- или необязательно трех-замещенному бензольному кольцу. Например, поли(n-фенилен) представляет собой полимер, построенный из пара-фениленовых повторяемых единиц. Фенилен может быть замещенным или незамещенным. Он может быть замещен галогеном, ОН, алкокси, предпочтительно С₁-С₄-алкокси, карбокси, сложным эфиром, предпочтительно C₁-C₄-сложным эфиром, амидом, нитро.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "алкен" будет иметь следующие значения: ненасыщенное алифатическое или алициклическое химическое соединение, содержащее по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Простейшие алициклические алкены, только с одной двойной связью и без других функциональных групп, образуют C_nH_2n, например, этилен (С₂Н₄), пропилен (С₃Н₆). Алкены могут быть замещены или незамещены. Если алкен замещен, то они могут быть замещены атомами галогена, гидроксильными группами, С₁-С₄-алкокси группами, С₆-С₁₂-арильными группами или др.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "арил" будет обозначать ненасыщенную кольцевую систему, предпочтительно ароматическую кольцевую систему, более предпочтительно содержащую 6-12 атомов углерода в кольцевом скелете. Их примерами являются фенил и нафталенил. Арильные фрагменты могут быть незамещены или замещены, например, атомами галогена, гидроксильными группами, С₁-С₄-алкокси группами или С₆-С₁₂-арильными группами.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "бензол" будет иметь следующие значения: органическое химическое соединение с формулой С₆Н₆. Бензол представляет собой ароматический углеводород и второй [н]-аннулен ([6]-аннулен), циклический углеводород с непрерывной pi связью. Бензол может быть незамещен или замещен, например, атомами галогена, гидроксильными группами, С₁-С₄-алкокси группами или С₆-С₁₂-арильными группами.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термины "алкенил" и "алкинил" аналогичным образом определяются как алкил, но содержат по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную или тройную связь, соответственно. Алкенил более предпочтительно может представлять собой С₂-С₆-алкенил и алкинил более предпочтительно может представлять собой С₂-С₆-алкинил.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "галоген" будет обозначать F, Cl, Br или I.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термины "соли неорганических или органических кислот", "неорганическая кислота" и "органическая кислота" относится к минеральным кислотам, включая, но не ограничиваясь только ими, такие кислоты, как: угольная, азотная, фосфорная, соляная, перхлорная или серная кислота или их кислые соли, такие как соли калия, натрия, кальция, магния, например, гидросульфат калия, или к подходящим органическим кислотам, которые включают, но не ограничиваясь только ими: кислоты, такие как алифатические, циклоалифатические, ароматические, аралифатические, гетероциклические, карбоновые и сульфоновые кислоты, примерами которых являются муравьиная, уксусная, трифторуксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, фумаровая, пировиноградная, бензойная, антраниловая, мезиловая, фумаровая, салициловая, фенилуксусная, миндальная, эмбоновая, метансульфо новая, этансульфоновая, бензоласульфоновая, пантотеновая, толуолсульфоновая, трифторметансульфоновая и сульфаниловая кислота, соответственно. Аналогично этому, органические кислоты также могут быть представлены в виде из солей, таких как соли калия, натрия, кальция, магния.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям неорганических и органических кислот, таких как минеральные кислоты, включая, но не ограничиваясь только ими, такие кислоты как угольная, азотная или серная кислота, или органические кислоты, включая, но не ограничиваясь только ими, такие кислоты, как алифатические, циклоалифатические, ароматические, аралифатические, гетероциклические, карбоновые и сульфоновые кислоты, примерами которых являются муравьиная, уксусная, трифтороуксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, фумаровая, пировиноградная, бензойная, антраниловая, мезиловая, салициловая, фенилуксусная, миндальная, эмбоновая, метансульфоновая, этансульфоновая, бензоласульфоновая, пантотеновая, толуолсульфоновая и сульфаниловая кислота.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "пролекарство" обозначают любое ковалентно связанное соединение, которое высвобождает активное исходное фармацевтическое средство в соответствии с формулой (I).

Термин "пролекарство", как используется в настоящей заявке, также охватывает фармацевтически приемлемые производные, такие как сложные эфиры, амиды и фосфаты, таким образом, что в результате биопревращения в условиях in vivo продукт производного представляет собой активное лекарственное средство, как определено в формуле (I). В источнике Goodman и Oilman (The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8-ая ред., McGraw-HiM, межд. изд. 1992, "Biotransformation of Drugs", 13-15) описаны пролекарства, раскрытие этого источника включено в настоящую заявку в качестве ссылки. Пролекарства соединения согласно настоящему изобретению получают путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединении, таким образом, что модификации отщепляются, либо при общепринятой обработке или in vivo, в исходное соединение. Пролекарства соединений согласно настоящему изобретению включают те соединения, в которых, например, гидрокси группа, такая как гидрокси группа на асимметричном атоме углерода, или аминогруппа связана с любой группой так, что при введении Пролекарства пациенту, она отщепляется с образованием свободного гидроксила или свободного амино, соответственно.

Типичные примеры пролекарств описаны, например, в WO 99/33795 A, WO 99/33815 А, WO 99/33793 А и WO 99/33792 А, раскрытие которых полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Пролекарства характеризуются очень хорошей растворимостью в воде, повышенной биодоступностью и легко метаболизируются в активные ингибиторы в условиях in vivo.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термины "аминокислотная последовательность" и "пептид" определяются в настоящей заявке как полиамид, получаемый путем (поли)конденсации по меньшей мере двух аминокислот.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "аминокислота" обозначает любую молекулу, содержащую по меньшей мере одну аминогруппу и по меньшей мере одну карбоксильную группу, но не содержащую пептидную связь в молекуле. Другими словами, аминокислота представляет собой молекулу, которая имеет функциональную группу карбоновой кислоты и аминный азот, имеющий по меньшей мере один свободный водород, предпочтительно в альфа-положении к нему, но не содержащая амидной связи в молекулярной структуре. Таким образом, дипептид, имеющий свободную аминогруппу на N-конце и свободную карбоксильную группу на С-конце, не может рассматриваться как единичная "аминокислота" согласно вышеприведенному определению. Амидная связь между двумя смежными аминокислотными остатками, которую получают при такой конденсации, определяется как "пептидная связь".

Амидная связь, как используется в данной заявке, обозначает любую ковалентную связь, имеющую структуру

-C(=O)-NH-CH- или -HC-HN-(O=)C- ,

где карбонильная группа обеспечивается одной молекулой, а NH-группа обеспечивается другой молекулой, которые соединяются вместе. Амидная связь между двумя смежными аминокислотными остатками, которую получают при такой поликонденсации, определяется как "пептидная связь". Необязательно, атомы азота полиамидного скелета (обозначается как NH выше) независимо могут быть алкилированы, например, с помощью -C₁-С₆-алкила, предпочтительно с помощью -СН₃.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, аминокислотный остаток имеет происхождение из соответствующей аминокислоты путем образования пептидной связи с другой аминокислотой.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, аминокислота представляет собой встречающуюся в природе или невстречающуюся в природе аминокислоту, где невстречающаяся в природе аминокислота представляет собой синтетический/искусственный аминокислотный остаток, протеиногенный и/или не-протеиногенный аминокислотный остаток. Не-протеиногенные аминокислотные остатки в дальнейшем могут классифицироваться как (а) гомо аналоги протеиногенных аминокислот, (b) β-гомо аналоги протеиногенных аминокислотных остатков и (с) дальнейшие не-протеиногенные аминокислотные остатки.

Таким образом, аминокислотные остатки имеют происхождение из соответствующих аминокислот, например, из

протеиногенные аминокислоты, а именно Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val; или

не-протеиногенные аминокислоты, такие как гомо аналоги протеиногенных аминокислот, где боковая цепь удлинена с помощью метиленовой группы, например, гомоаланин (Hal), гомоаргинин (Har), гомоцистеин (Hcy), гомоглутамин (Hgl), гомогистидин (Hhi), гомоизолейцин (Hil), гомолейцин (Hle), гомолизин (Hly), гомометионин (Hme), гомофенилаланин (Hph), гомопролин (Hpr), гомосерин (Hse), гомотреонин (Hth), гомотриптофан (Htr), гомотирозин (Hty) и гомовалин (Hva);

β-гомоаналоги протеиногенных аминокислот, где метиленовая группа вставлена между α-углеродом и карбоксильной группой, приводя к образованию β-аминокислот, например, β-гомоаланин (pHal), β-гомоаргинин (βHar), β-гомоаспарагин (βHas), β-гомоцистеин (pHcy), β-гомоглутамин (βHgl), β-гомогистидин (βHhi), β-гомоизолейцин (βHil), β-гомолейцин (βHle), β-гомолизин (βHly), β-гомометионин (βHme), β-гомофенилаланин (βHph), β-гомопролин (βHpr), β-гомосерин (βHse), β-гомотреонин (βHth), β-гомотриптофан (βHtr), β-гомотирозин (βHty) и β-гомовалин (βHva);

дальнейшие не-протеиногенные аминокислоты, например, α-аминоадипиновая кислота (Aad), β-аминоадипиновая кислота (βAad), α-аминомасляная кислота (Abu), α-аминоизомасляная кислота (Aib), β аланин (βAla), 4-аминомасляная кислота (4-Abu), 5-аминовалериановая кислота (5-Ava), 6-аминокапроновая кислота(6-Ahx), 8-аминооктановая кислота (8-Аос), 9-аминононановая кислота (9-Anc), 10-аминокаприновая кислота (10-Adc), 12-аминолауриновая кислота (12-Ado), α-аминосубериновая кислота (Asu), азетидин-2-карбоновая кислота (Aze), β-циклогексилаланин (Cha), цитруллин (Cit), дегидроаланин (Dha), γ-карбоксиглутаминовая кислота (Gla), α-циклогексилглицин (Chg), пропаргилглицин (Pra), пироглутаминовая кислота (Gip), α-трет-бутилглицин (Tle), 4-бензоилфенилаланин (Вра), δ-гидроксилизин (Hyl), 4-гидроксипролин (Hyp), алло-изолейцин (alle), лантионин (Lan), (1-нафтил)аланин (1-Nal), (2-нафтил)аланин (2-Nal), норлейцин (Nle), норвалин (Nva), орнитин (Orn), фенилглицин (Phg), пипеколиновая кислота (Pip), саркозин (Sar), селеноцистеин (Sec), статин (Sta), β-тиенилаланин (Thi), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота (Tic), алло-треонин (aThr), тиазолидин-4-карбоновая кислота (Thz), γ-аминомасляная кислота (GABA), изо-цистеин (изо-Cys), диаминопропионовая кислота (Dpr), 2,4-диаминомасляная кислота (Dab), 3,4-диаминомасляная кислота (ypDab), бифенилаланин (Bip), фенилаланин, замещенный в пора-положении с помощью -C₁-С₆-алкила,

-галогенида, -NH₂, -CO₂H или Phe(4-R) (где R=-C₁-С₆-алкил, -галогенид, -NH₂, или -CO₂H); пептидные нуклеиновые кислоты (PNA, ср., Р.Е.Nielsen, Асе. Chem. Res., 32, 624-30); или их N-алкилированные аналоги, такие как их N-метилированные аналоги.

Циклические аминокислоты могут быть протеиногенными или не-протеиногенными, такие как Pro, Aze, Glp, Hyp, Pip, Tic и Thz.

Для дальнейших примеров и подробностей можно привести ссылку, например, J.H.Jones, J. Peptide Sci., 2003, 9, 1-8, раскрытие которого полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термины "не-протеиногенная аминокислота" и "не-протеиногенный аминокислотный остаток" также охватывает производные протеиногенных аминокислот. Например, боковая цепь протеиногенного аминокислотного остатка может быть дериватизирована, таким образом превращая протеиногенный аминокислотный остаток в "не-протеиногенный". Аналогичное применяется и для производных С-конца и/или N-конца протеиногенного аминокислотного остатка, которые находятся на концах аминокислотной последовательности.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, протеиногенный аминокислотный остаток имеет происхождение из протеиногенной аминокислоты, выбранной из группы, включающей Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val либо в L- либо D-конфигурации; второй хиральный центр в Thr и Не может иметь либо R- либо S-конфигурации. Таким образом, например, любая посттрансляционная модификация аминокислотной последовательности, такая как N-алкилирование, которая может происходить в природе, придает соответствующему модифицированному аминокислотному остатку "непротеиногенность", хотя в природе указанный аминокислотный остаток включен в белок. Предпочтительно модифицированные аминокислоты выбирают из N-алкилированных аминокислот, β-аминокислот, γ-аминокислот, лантионинов, дегидро аминокислот, и аминокислот с алкилированными гуанидиновыми фрагментами.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "карбоновая кислота" или "дикарбоновая кислота" обозначает органические соединения, имеющие один СООН фрагмент или два СООН фрагмента, соответственно, такие как, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, циклогексан карбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, молочная кислота (карбоновые кислоты) или щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, фталевая кислота (дикарбоновые кислоты), соответственно.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "диамин" обозначает органические соединения, имеющие два NR'R" фрагмента, где R' и R" независимо друг от друга могут представлять собой алкил, алкенил, алкинил, арил. Диамины могут представлять собой, например, этилендиамин, 1,4-циклогексан диамин, пиперазин.

Что касается определенных в настоящем изобретении выше аминокислот, карбоновых кислот, дикарбоновых кислот или диаминов, на которые приводятся ссылки, они также специфически включают соответствующие радикалы, полученные из таких аминокислот, карбоновых кислот, дикарбоновых кислот или диаминов, соответственно, и это охватывается соединениями согласно изобретению, то есть,

-HN-…-CO- (аминокислота),

-ОС-… (карбоновая кислота),

-ОС-…-СО- (дикарбоновая кислота), -HN-…-NH- (диамин), например.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "хелатор металла" определяется как молекула, которая образует комплекс с радионуклидным металлом с получением комплекса металла, который стабильный в физиологических условиях и который также может быть конъюгирован с целевой группой с помощью спейсера. Хелатор металла образует комплекс или не образует комплекс с радионуклидным металлом.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы; формулировка "радионуклидный металл" определяется как радионуклид, который представляет собой атом с нестабильным ядром, где ядро характеризуется избыточной энергией, которая доступна для передачи либо к вновь созданной радиоактивной частице в пределах ядра, либо еще к атомному электрону (см. внутреннее превращение). Радионуклидные металлы, используемые в настоящей заявке, в особенности пригодны для диагностического или терапевтического применения, более предпочтительно для визуализации или лучевой терапии. Радионуклид, в этом процессе, подвергается радиоактивному распаду, и эмитируют (а) гамма-лучи и/или элементарные частицы. Эти частицы составляют ионизирующее излучение. Радионуклиды могут встречаться в природе, а также могут быть получены искусственно.

Эти радионуклидные металлы включают, но не ограничиваясь только ими, галлий (например, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga) медь (например, ⁶⁷Cu и ⁶⁴Cu); технеций (например, ^u99mTc и ^99mTe); рений (например, ¹⁸⁶Re и ¹⁸⁸Re); свинец (например, ²¹²Pb); висмут (например, ²¹²Bi); и палладий (например, ¹⁰⁹Pd). Способы получения этих изотопов известны. Коммерчески доступны генераторы молибден/технеций для получения ^99mTc. Процедуры для получения ¹⁸⁶Re включают процедуры, описанные Deutsch и др., (Nucl. Med. Biol., Vol.13: 4:465-477, 1986) и Vanderheyden и др. (Inorganic Chemistry, том 24:1666-1673, 1985), и способы получения ¹⁸⁸Re описаны Blachot и др. (Intl. J. of Applied Radiation and Isotopes, том 20: 467-470, 1969) и Klofutar и др. (J. of Radioanalytical Chem, том 5: 3-10, 1970). Получение ²¹²Pd описано в Fawwaz и др., J. Nucl. Med, (1984), 25:796. Получение ²¹²Pb и ²¹Bi описано в Gansow и др., Amer. Chem. Soc. Symp, Ser. (1984), 241:215-217, и Kozah и др., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (January 1986), 83:474-478. ^99mTe является предпочтительным для диагностического применения, и другие радионуклиды, перечисленные выше, имеют терапевтическое применение.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "спейсер" определяется как связывающая группа между хелатором металла и антагонистами пептида бомбезина.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы; формулировка "агонист" обозначает вещество (лиганд), который связывается со специфическим сайтом на рецепторной молекуле клетки и таким образом активирует передачу сигналов в клетке. Это приводит к измеряемому эффекту.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы; формулировка "антагонист" обозначает вещество (лиганд), который связывается с сайтом на рецепторной молекуле, который специфический для вещества-агониста, блокируя таким образом этот сайт для агониста, без осуществления эффекта. Таким образом, антагонист ингибирует действие агониста.

Как используется в дальнейшем в описании настоящего изобретения и в пунктах формулы, термин "аналог статина" определяется как ди-пептидный миметик со следующей общей структурой

Статин R2=ОН, R1 может значительно изменяться, но обычно они имеют такие же значения, что и боковые цепи аминокислот

Аналоги статина R2=Н, R1 может значительно изменяться, но обычно они имеют такие же значения, что и боковые цепи аминокислот

Сокращения:

NODASA=1,4,7-триазациклононан-1-янтарная кислота-4,7- ацетоуксусная кислота

NODAGA=1,4,7-триазациклононан-N-глутаровая кислота-N',N"-ацетоуксусная кислота

TRITA=1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 N,N',N",N'''-тетрауксусная кислота

Сра=(S)-4-карбоксамидофенилаланин

4-Am-5-MeHpA=4-амино-5-метилгептановая кислота

4-Am-5-MeHxA=4-амино-5-метилкапроновая кислота

DFO=N'-[5-(ацетил-гидрокси-амино)пентил]-N-[5-[3-(5-аминопентил-гидрокси-карбамоил)пропаноиламино]пентил]-N-гидрокси-бутандиамид

Без дополнительных исследований, предполагают, что специалист в данной области техники может, применяя предыдущее описание, использовать настоящее изобретение в его наиболее полном объеме. Таким образом, последующие предпочтительные специфические варианты осуществления интерпретируются исключительно как иллюстративные, и никоим образом не ограничивают оставшееся раскрытие.

Фигуры

Фигура 1: Кривые зависимости «доза-эффект» аналогов бомбезина, определенные с помощью анализа высвобождения кальция.

Анализ высвобождения кальция осуществляли, как описано в материалах и методах. РСЗ клетки обрабатывали либо бомбезином при концентрациях в диапазоне от 0,01 нмоль/л до 10 мкмоль/л (•) отдельно, или в присутствии 10 мкмоль/л аналогов бомбезина Соединение 1 (▲), или In-Соединение 1 (♦), или аналогов бомбезина Соединение 1а (■). Соединение 1, тестировали отдельно при концентрации 1 мкмоль/л и 10 мкмоль/л Соединение 1 (Δ), In-Соединение 1 (×) и соединение la (□) не обладает действием на высвобождения кальция в РСЗ клетках. Соединение 1 а относится к связывающей последовательности 1, без линкера и хелата (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂). Соединение 1 относится к хелату (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂). In-Соединение 1 относится к In-хелатированному (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂).

Фигура 2: Иммунофлуоресцентная микроскопия HEK-GRPR клеток

Иммунофлуоресцентная микроскопия при введении Соединения 1, In-Соединения 1, Соединения 1lb и GRPR-АНТАГ, используя мышиное моноклональное антитело с НА-эпитопом и HEK-GRPR клетками, (а) без пептида, (b) 10 нмоль/л бомбезина, (с) Соединение 1b, (d) Соединение 1b+10 нмоль/л бомбезина, (d, f, h, j) клетки, обработанные 10 нмоль/л бомбезина в присутствии 1 мкмоль/л аналогов Соединение 1b, GRPR-АНТАГ, Соединение 1, и In-Соединение 1, (с, е, g, i) клетки, обработанные Соединением 1b, GRPR-АНТАГ, и Соединением 1.

Фигура 3а, 3b, 4а, 4b: РЕТ-визуализация у мышей, несущих опухоль РС-3 (3) и LNCaP (4) для Ga-68-DOTA Соединения 2. а) 1 час после инъекции 10 МБк радиоактивного индикатора, b) блокировано с помощью 100 мкг бомбезина Blocked with 100 µg sin.

Фигура 6: SPECT/CT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография/ компьютерная томография) изображение ^99mTc-ARN4-06 (15 МБк/200 пмоль) у мышей, несущих РС-3-опухоль.

Фигура 8: SPECT/CT изображение ^99mTc-ARN4-05 (15 МБк/200 пмоль) у мышей, несущих РС-3-опухоль.

Фигура 9: ВЭЖХ анализ Ga-68-DOTA Соединения 2 на колонке с обращенной фазой.

Фигура 10а, b, с, а, е: Исследование стабильности Ga-68-DOTA Соединения 2 в плазме и моче мышей, при анализе с помощью ВЭЖХ.

Фигура 11: Стабильность в сыворотке человека Lu-177-DOTA Соединения 2.

Фигура 12: Сравнение опухоль/ткань Ga-68 RM2 с F18 FDG и F18 холином

Полное(ые) раскрытие(я) все заявок, патентов и публикаций, процитированных в данной заявке, полностью включены в настоящее изобретения в качестве ссылки.

Последующие примеры могут быть повторены с подобным успехом при замене реагентов и/или условий осуществления, описанных в общем или специфически в настоящей заявке, на те, которые используются в вышепредставленных примерах.

Из вышеприведенного описания, специалист в данной области техники может установить существенные характеристики настоящего изобретения и, без отклонения от сущности и объема изобретения, может осуществить различные изменения и модификации для адаптации к различным использованиям и условиям.

Примеры

где А имеет значение А, а также А', в соответствующих случаях, для всех примеров, описанных далее.

Пример 1 (А-В-С)

где А имеет значение А, а также А', в соответствующих случаях, для всех примеров, описанных далее.

а) Синтез конъюгатов антагониста пептида бомбезина с общей последовательностью (А=DOTA, В=Спейсер B₁-В₂, С=Пептид с N-концевым амидом Z [Z=NH])

DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^lo-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Sta^l3-Leu^l4-NH₂

Пептиды синтезировали вручную на твердой фазе, используя Fmoc-стратегию. Для получения N-концевых амидов, использовали Rink амид МВНА полимер LL (100-200 меш) (4-(2',4'-Диметоксифенил-Fmoc-аминометил)-феноксиацетамид-норлейцил-4-Метилбензгидриламин полимер. В целом, Rink амид МВНА полимер с теоретической загрузкой 0,34 ммоль/г полимера вводили в реактор. В реактор добавляли N,N-диметилформамид (ДМФА) и встряхивали в течение 30 минут для возможности набухания полимера. После удаления растворителя, добавляли раствор 20% пиперидина в ДМФА и полимер встряхивали в течение 15 минут для удаления 9-Флуоренилметоксикарбонильной (Fmoc) защитной группы. Эту стадию повторяли дважды. После осуществления этой процедуры, полимер промывали три раза в течение 5 минут с ДМФА. Пиперидиновый раствор и ДМФА раствор из последних трех промывок собирали и наполняли этанолом до 100 мл. Из этого раствора отбирали аликвоты для определения количества удаленных Fmoc-защитных групп спектрофотометрически.

Перед сочетанием Fmoc-аминокислотный дериватизированный полимер промывали два раза в течение 2 минут с ДМФА. 2 эквивалента Fmoc-аминокислот, предварительно активированных с 2 эквивалентами N,N-Диизопропилкарбодиимида (DIC)/N-Гидроксибензотриазола (HOBt), добавляли к полимеру и значение рН доводили до 8-9 путем добавления около 4 эквивалентов N-Этилдиизопропиламина (DIPEA). Реакцию инкубировали в течение 2 часов при осторожном встряхивании. После реакции, раствор удаляли и твердую фазу два раза промывали в течение 5 минут с ДМФА. За осуществлением реакции наблюдали с помощью теста Kaiser. Определенное количество шариков полимера промывали 3 раза этанолом, 50 мкл раствора 1 (20 г фенола в 10 мл этанола смешивали с 1 мл раствора 0,01 М KCN в 49 мл пиридина) и 50 мкл раствора 2 (500 г нингидрина в 10 мл этанола) добавляли и шарики нагревали в течение 10 минут при 95°С. Синие шарики указывали на несвязанные функциональные аминогруппы.

Все аминокислоты использовали в виде N-концевых Fmoc-защищенных производных и их сочетали аналогичным образом. Триптофан использовали с трет-бутилоксикарбонильной (Вое) защитной группой на боковой цепи, тогда как гистидин и глутамин были Trt защищены. Если Kaiser тест осуществляли после связывания каждой из аминокислот, и он указывал на неполное связывание функциональных аминогрупп, связывание повторяли.

После создания полной желательной пептидной последовательности, полимер промывали 5 раза с ДХМ, после этого 5 раз промывали простым диэтиловым эфиром, каждый раз в течение 2 минут и высушивали в вакууме.

b) Связыванием со СПЕЙСЕРом и прохелатором DOTA('Bu)₃

Прохелатор DOTA(^tBu)₃ получали от Macrocyclics Inc., Dallas, USA. Перед связыванием со 25 СПЕЙСЕРом, N-концевую Fmoc-защиту удаляли с пептидов, связанных с полимером. Полимер набухал в течение 15 минут в ДМФА, его два раза обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (15 минут) и промывали три раза с помощью ДМФА. Раствор из пиперидиновых обработок и последующие ДМФА промывки собирали для определения количества отщепленных Fmoc групп.

2 эквивалента СПЕЙСЕРа, предварительно активированного с гексафторфосфатом 2-(1 час-9-Азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметил-аминия (HATU) в течение 20 минут в ДМФА, добавляли к полимеру. Значение рН доводили до 8-9 путем добавления DIPEA. Реакционную смесь встряхивали в течение 2 часа и за связыванием наблюдали с помощью теста Kaiser. Прохелатор DOTA('Bu)₃ связывали аналогичным образом после удаления Fmoc, как было описано ранее. DOTA('Bu)₃ связывание встряхивали в течение ночи. После удаления раствора, полимер промывали 3 раза ДМФА, 5 раз ДХМ, после этого 5 раз промывали простым диэтиловым эфиром, каждый раз в течение 2 минут и высушивали в вакууме.

с) Снятие защиты, отщепление и очистка

Пептид-полимер отбирали в шприц, оборудованный фриттой. Добавляли раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ)/тиоанизола (ТА)/триизопропилсилана (TIS)/H₂O (94/2/2/1) и шприц взбалтывали в течение 2 часов. Раствор добавляли к смеси 50% диизопропилового эфира и 50% диэтилового эфира на льду, предоставляя возможность осадиться пептиду. Пептид собирали путем центрифугирования при 3000 об./мин, в течение 5 минут и супернатант отбрасывали. Осадок несколько раз промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Неочищенный продукт растворяли в воде и очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой на системе Metrohm ВЭЖХ LC-CaDI 22-14 (Herisau, Switzerland) с колонкой Macherey-Nagel VP 250/21 Nucleosil 100-5 C₁₈ (элюенты: элюент 1=0,1% ТФУ в воде и элюент 2=ацетонитрил; градиент: 0-20 мин, 90%-50% элюент 1; поток: 15 мл/мин).

Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

А-В-С-1

DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^lo-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Хаа₃ ¹³- Xaa₄ ¹⁴-ZH (Z=NH)

Соединение 1: А=DOTA, B₁=Gly, B₂=4-аминобензоил; Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu,

DOTA-Gly-аминобензоил-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₈₀H₁₁₄N₂₀O₂₀, рассчитано (m/z): 1675,8, обнаружено [М+К]⁺ 1715,1.

Соединение 2: А=DOTA, B₁=4-амино-1-карбоксиметил-пиперидинил; B₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-4-амино-l-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₇₉H₁₁₈N₂₀O₁₉; рассчитано (m/z): 1639,9, обнаружено [M+K]⁺: 1678,1

Соединение 3: А=DOTA, B₁=4-амино-1-пиперидин-4-карбокси; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-4-амино-1-пиперидин-4-карбоновая кислота -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

C₇₇H₁₁₆N₂₀O₁₉, рассчитано (m/z): 1624,9, обнаружено [M+K]⁺: 1663,7

Соединение 4: А=DOTA, B₁=15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоил; B₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота-D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₈₂H₁₂₇N₁₉O₂₃, рассчитано (m/z): 1747,8, обнаружено [М+К]⁺: 1785,1

Соединение 5: А=DOTA, B₁=15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоил; B₂=4-амино-1-пиперидин-4-карбокси, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота)-(4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₈₉H₁₃₉N₂₁O₂₄, рассчитано (m/z): 1886,0, обнаружено [М+К]⁺: 1924,9

Соединение 6: А=DOTA, B₁=диаминомасляная кислота; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-диаминомасляная кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂;

C₇₅H₁₁₄N₂₀O₁₉, рассчитано (m/z): 1598,9, обнаружено [M+K]⁺: 1638,4

Соединение 7: А=DOTA, B₁=4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметил-пиперазинил; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Хаа₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

DOTA-4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметил-пиперазин-D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₇₉H₁₂₁N₂₁O₁₉, рассчитано (m/z): 1667,9, обнаружено [М+Na]⁺: 1691,2

Соединение 8: А=DOTA, B₁=(5-амино-3-окса-пентил)-полуамид янтарной кислоты; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Хаа₄=Leu

DOTA-(5-амино-3-окса-пентил)-полуамид янтарной кислоты-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

C₇₉H₁₂₀N₂₀O₂₁, рассчитано (m/z): 1685,9, обнаружено [М+К]⁺: 1723,7

Пример 2 (А-В-С)

а) Синтез конъюгатов антагониста пептида бомбезина с общей последовательностью (А=N₄-азидо, В=Спейсер B₁-В₂, С=пептид с N-концевым амидом Z [Z=NH₂])

N₄-триазолы-dPEG₁-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Sta^l3-Leu^l4-NH₂

a) Синтез пептидов: Fmoc-Хаа₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His¹²-Sta¹³-Leu¹⁴-NH₂

Пептиды синтезировали вручную на твердой фазе, используя Fmoc-стратегию. Для получения N-концевых амидов, использовали Rink амид МВНА полимер LL (100-200 меш). Синтез осуществляли, как описано в примере 1.

b) Сочетание с алкильной группой пропаргил-dPEG₁-NHS-сложного эфира

Перед сочетанием с алкильной группой, N-концевую Fmoc-защиту удаляли с пептидов, связанных с полимером. Полимер набухал в течение 15 минут в ДМФА, его два раза обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (15 минут) и промывали три раза с помощью ДМФА. Раствор из пиперидиновой обработки и последующие ДМФА промывки собирали для Fmoc определения.

2 эквивалента пропаргил-dPECG₁-NHS-сложного эфира добавляли к полимеру. Значение рН доводили до 8-9 путем добавления DIPEA. Реакционную смесь встряхивали в течение 24 часа и за связыванием наблюдали с помощью теста Kaiser.

c) Снятие защиты, отщепление и очистка

Пептид-полимер отбирали в шприц, оборудованный фриттой. Добавляли раствор ТФУ/TIS/H₂O (94/2,5/2,5) и шприц взбалтывали в течение 2 часов. Раствор добавляли к смеси 50% диизопропилового эфира и 50% диэтилового эфира на льду, предоставляя возможность осадиться пептиду. Пептид собирали путем центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 5 минут и супернатант отбрасывали. Осадок несколько раз промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Неочищенный продукт растворяли в воде и очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше.

Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

d) Синтез N₄-азидо хелатора. В синтезе задействовано 3 стадии.

i) Синтез N,N',N",N"'-тетракис(трет-бутилоксикарбонил)-6-(азидо)-1,4,8,11-тетраазаундекана (N₄(Boc)₄-N₃) [3]:

а) N,N',N'',N”'-тетракис(трет-бутилоксикарбонил)-6-(гидрокси)-1,4,8,11-тетраазаундекан (N₄(Bob)₄-OH) [1]: Раствор 6-(гидрокси)-1,4,8,11-тетраазаундекана (1 г, 3,1 ммоль) в ДМФА (10 мл) охлаждали до 0°С. К нему добавляли раствор ди-трет-бутилдикарбоната (3,32 мл, 15,5 ммоль) в ДМФА (5 мл), затем добавляли DIPEA (2,7 мл, 15,5 ммоль). После этого реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. После завершения этого времени реакции, реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водный слой экстрагировали трижды с помощью этилацетата и объединенную этилацетатную фазу промывали раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия. При осуществлении фильтрации и упаривании растворителя при пониженном давлении получали указанное в заглавии соединение с выходом 86%.

ii) N,N',N'',N”'-тетракис(трет-бутилоксикарбонил)-6-(O-метил сульфонил))-1,4,8,11-тетраазаундекан (N₄(Bob)₄-O-SO₂CH₃) [2];

К раствору 1 (300 мг, 0,54 ммоль) в пиридине (3 мл) добавляли метилсульфонил хлорид (84 мкл, 1,08 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до ее завершения, о чем наблюдали с помощью ТСХ. Растворитель упаривали при пониженном давлении, остаток ресуспендировали в этилацетате. Этилацетат промывали три раза с помощью 10% NaHCO₃ и воды и высушивали над безводным сульфатом натрия. При осуществлении фильтрации и упаривании растворителя при пониженном давлении получали неочищенный продукт, который дополнительно очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле, получая указанное в заглавии соединение с выходом 84%.

iii) N,N',N'',N”'-тетракис(трет-бутилкарбонил)-6-(азидо)-1,4,8,11-тетраазаундекан (N₄(Boc)₄-N₃) [3]:

Суспензию 2 (250 мг, 0,38 ммоль) и азида натрия (100 мг, 1,52 ммоль) в ДМФА (3 мл) перемешивали при 75°С в течение 5 часов. Эту реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водный слой экстрагировали трижды с помощью этилацетата и объединенный этилацетат промывали раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом натрия. При осуществлении фильтрации и упаривании растворителя при пониженном давлении, получая неочищенный продукт, который затем очищали путем колоночной хроматографии. (выход 88%).

d) Сочетание в растворе

Пептид (6,2 мг, 5 мкм) с концевой алкильной группой и 3 (3 мг, 5 мкм) растворяли в смеси 1:1 вода и трет-бутиловый спирт (1 мл). Добавляли медный порошок (10 мг), затем добавляли 0,1 М водный пентагидрат сульфата меди (60 мкл, 6 мкм, 1,2 эквив.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Медный порошок отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный пептид очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой.

Конъюгат хелатор-пептид обрабатывали с помощью ТФУ:TIS:H₂O (95:2:3) в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт растирали в порошок с диэтиловым эфиром и очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше.

Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

Соединение 14: А=N₄-азидо, B₁=пропаргил-dPEG₁-NHS-сложный эфир; B₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Sta; Xaa₄=Leu

N₄-триазолы-dPEG₁-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂; C₆₈H₁₀₅N₂₁O₁₃, рассчитано (m/z): 1424,7, обнаружено [М+Н]⁺: 1425,5

Пример 3 (А-В-С2)

DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^lo-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CHOH)-(CH₂)₂-CH₃

Все псевдопептиды синтезировали в жидкой фазе путем конденсации гептапептида Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa₂-His-OH с модифицированной аминокислотой H-Leuψ(CHOH)-(СН₂)₃-СН₃.

а) Синтез гептапептида Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa₂-His-OH

Пептиды синтезировали вручную на 2-хлортритил хлорид полимере, используя Fmoc стратегию. В целом, 2-хлортритил хлорид полимер с теоретической загрузкой 1,4 ммоль/г полимера вводили в реактор. Полимер набухал в ДХМ в течение 30 минут и первую аминокислоту связывали путем добавления 1 эквивалента аминокислоты, смешанной с 4-кратным молярным избытком DIPEA в ДХМ. Смесь для реакции сочетания перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и затем полимер два раза промывали смесью ДХМ/MeOH/DIPEA (17/2/1), два раза ДХМ и в завершение он набухал в ДМФА. Fmoc снимали защиту, используя 20% пиперидин в ДМФА, и количество удаленной Fmoc-защитной группы определяли спектрофотометрически при 300 нм. Следующую аминокислоту связывали путем добавления 2-кратного молярного избытка аминокислоты, смешанной с эквимолярными количествами DIC/HOBt, и 4-кратным молярным избытком DIPEA в ДМФА. Полимер взбалтывали при комнатной температуре в течение 2 часов и за осуществлением наблюдали с помощью нингидринового теста Kaiser. Каждую аминокислоту связывали, используя аналогичную стратегию.

b) Связывание со СПЕЙСЕРом и прохелатором DOTA (^tBu)₃

Связывания осуществляли, как описано выше.

c) Отщепление и очистка

Полностью защищенные пептиды отщепляли от твердой подложки путем суспендирования полимера в смеси ТФУ/TIS/ДХМ (1/5/94). Несколько раз отсасывали вплоть до объема 5 мл отщепленного раствора с помощью шприца, инкубировали в течение 10 минут и отщепленные фракции собирали в колбу объемом 50 мл. После сбора всех фракций, в колбу добавляли 3Х10 мл толуола, растворители упаривали и впоследствии продукт высушивали в течение 1 часа при вакууме с масляным насосом.

d) Синтез Вос-Leuψ(СНОН)-(СН₂)₃-СН₃. Синтез осуществляли в три стадии.

i) Синтез Вос-Leu-N(ОСН₃)СН₃

Boc-Leu-OH (1 г, 4,3 ммоль) растворяли в ДХМ (30 мл) и добавляли тетрафторборат 2-(1 час-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (TBTU) (1,380 г, 4,3 ммоль), HOBt (0,581 г, 4,3 ммоль) и DIPEA (743 мкл, 4,3 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение 5 минут, добавляли гидрохлорид O,N-диметилгидроксиламина (0,461 г, 4,73 ммоль) и DIPEA (817 мкл, 4,73 ммоль). Все твердые вещества растворялись в течение 10 минут и смесь перемешивали в течение ночи при КТ. Растворитель упаривали, реакционную смесь повторно растворяли в AcOEt и несколько раз промывали с помощью H₂O, 5% лимонной кислоты, H₂O, 5% водного раствора NaHCO₃, насыщенного раствора NaCl. Раствор высушивали над MgSO₄ и растворитель удаляли в вакууме. Желательное соединение очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле. ESI-MS: рассч. 269; обнаружено 292 [М+Na]⁺.

ii) Синтез Вос-Leu-(СН₂)₃-СН₃

Магний (0,330 г, 13,6 ммоль) активировали путем суспендирования в толуоле в течение 30 минут в атмосфере N₂. Толуол удаляли и Mg высушивали в атмосфере N₂. К суспензии Mg в ТГФ (20 мл) добавляли бромбутан (1,46 мл, 13,6 ммоль) по каплям и смесь нагревали в колбе с обратным холодильником. После растворения всего магния, по каплям добавляли Вос-Leu-N(ОСН₃)СН₃ в ТГФ и реакцию перемешивали в течение 2 часов при 0°С. Добавляли 1М HCl (150 мл), затем добавляли этилацетат (100 мл). Органический слой промывали 1М гидросульфатом калия, водой, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме. Ожидаемый продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле. Продукт характеризовали путем ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР. ESI-MS: рассч. 271; обнаружено 293,3 [М+Na]⁺.

iii) Синтез Вос-Leuψ(СНОН)-(СН₂)₃-СН₃

К раствору Вос-Leu-(СН₂)₃-СН₃ (0,190 г, 0,7 ммоль) в метаноле (5 мл) добавляли NaBH₄ (0,104 г, 2,8 ммоль). Реакционную смесь дополнительно перемешивали в течение 1 часа, затем нейтрализовали уксусной кислотой и растворитель удаляли при пониженном давлении. Ожидаемый продукт осаждали с насыщенным бикарбонатным раствором. Пептид собирали путем фильтрации, промывали водой, гексаном и высушивали. Продукт характеризовали путем ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР. ESI-MS: рассч. 272; обнаружено 273 [М+H]⁺; 547,7 [2М+Н]⁺.

iv) Связывание в растворе

Вос-Leuψ(СНОН)-(СН₂)₃-СН₃ снимали защиту, используя раствор 80% ТФУ в ДХМ. Через 1 час раствор концентрировали, несколько раз промывали ДХМ и высушивали. Хелатор-спейсер-пептид растворяли в ДМФА, добавляли HATU (1,2 эквивалента) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Н-Leuψ(СНОН)-(СН₂)₃-СН₃ растворяли в ДМФА и добавляли к пептиду. Значение рН доводили до 8, используя DIPEA, и реакцию перемешивали в течение 4 часов при RT.

Растворитель концентрировали и пептид, полностью защищенный, получали путем осаждения с H₂O на льду. Неочищенный пептид осаждали, охлаждали, центрифугировали и отделяли от растворителя путем декантирования. Для получения полностью незащищенного пептида, его солюбилизировали в смеси ДХМ/ТФУ/TIS/H₂O 10/85/2,5/2,5. Через 4 часа раствор концентрировали и пептид осаждали, используя смесь 50% диэтилового эфира и 50% диизопропилового эфира на льду. После этого пептид собирали путем центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 5 минут и супернатант отбрасывали. Осадок несколько раз промывали диэтиловым эфиром и после этого неочищенный продукт выдерживали в вакууме в течение ночи для удаления оставшихся растворителей. Неочищенный продукт растворяли в воде и очищали путем препаративной, как описано ранее.

Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

Соединение 9: А=DOTA, B₁=4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин; B₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly;

DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃, C₇₄H₁₁₂N₁₈O₁₇, рассчитано (m/z): 1524,8, обнаружено [М+К]⁺: 1564,3

Соединение 10: А=DOTA, B₁=15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоил; B₂=4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly;

DOTA-PEG₄-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃; C₈₆H₁₃₅N₁₉O₂₂, рассчитано (m/z): 1786,9, обнаружено [М+К]⁺: 1811,1

Соединение 11: А=DOTA, B₁=15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоил; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly;

DOTA-PEG₄-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃ C₇₈H₁₂₁N₁₇O₂₁, рассчитано (m/z): 1632,8, обнаружено [M+K]⁺: 1672,2

Пример 4 (А-В-С-3)

DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Xaa₃ ¹³-Xaa₄ ¹⁴-NH₂

Синтез конъюгатов бомбезина с общей последовательностью: DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂

а) Синтез пептида: Fmoc-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂

Пептиды синтезировали вручную на MB НА полимере LL (100-200 меш) HCl, используя Воc стратегию. В целом, МВНА полимер с теоретической загрузкой 0,59 ммоль/г вводили в реактор и он набухал в ДХМ в течение 30 минут. Полимер обрабатывали 3 раза (10 мин) с раствором 10% DIPEA в ДХМ. Первое связывание Boc-Leuψ(CH₂NH)-Phe-OH осуществляли, используя 2 эквивалента Вос-аминокислоты, активированной с 2 эквивалентами HOBt и 2 эквивалентами DIC. Смесь для реакции связывания перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и за осуществлением реакции наблюдали с помощью Kaiser нингидриногового теста. Вос-защиту снимали, используя 30% ТФУ в ДХМ, и эту стадию повторяли два раза. После этого полимер обрабатывали раствором 10% DIPEA в ДХМ и сочетания осуществляли, как описано выше.

(H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂: C₅₆H₇₆N₁₄O₉, рассчитано (m/z): 1089,3, обнаружено [М+Н]⁺: 1089,8

b) Связывание со СПЕЙСЕРом и прохелатором DOTA (^tBu)₃

Связывание осуществляли, как описано выше.

c) Снятие защиты, отщепление и очистка

Пептид обрабатывали с ТФУ (1 мл) и TIS (30 мкл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем смесь охлаждали на ледяной бане и по каплям добавляли трифторометансульфоновую кислоту (TFMSA) (100 мкл) при перемешивании. Колбе запечатывали пробкой и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часа. Объем уменьшали в вакууме и пептид осаждался при добавлении холодного диэтилового эфира. Осадок несколько раз промывали диэтиловым эфиром и неочищенный продукт высушивали в вакууме. Неочищенный продукт растворяли в воде и очищали путем препаративной ВЭЖХ, как описано выше.

Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

Соединение 12: А=DOTA, B₁=4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Leuψ(CH₂NH); Xaa₄=Phe

DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂

C₇₉H₁₁₄N₂₀O₁₇, рассчитано (m/z): 1615,9, обнаружено [М+К]⁺: 1654,9

Синтез конъюгатов бомбезина с общей последовательностью: DOTA-Спейсер-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂

a) Синтез пептида: Fmoc-Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val^l0-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂

Пептиды синтезировали вручную с помощью твердой фазы на МВНА полимере (0,59 ммоль/г), используя Вос-стратегию. Boc-Cys(4-MeOBzl)-OH (2,5 экв.) связывали с полимером, используя DIC (2,5 экв.) и HOBt (2,5 экв.) в качестве активирующего реагента. Значение рН доводили до 8 с помощью DIPEA (5 экв.). Введение восстановленной связи ¹³ψ¹⁴(CH₂-NH) осуществляли с помощью Boc-Leu-альдегида (2,5 экв.), растворенного в подкисленном диметилформамиде. Медленно добавляли NaBH₃CN (2,5 экв.) в ДМФА, в течение 20 минут, и реакцию перемешивали в течение 1 часа при КТ. После образования восстановленной пептидной связи, все реакции связывания осуществляли с использованием N-Вос-защищенных аминокислот.

b) Связывание со СПЕЙСЕРом и прохелатором DOTA (^tBu)₃

Связывания осуществляли, как описано выше.

с) Снятие защиты, отщепление и очистка

Снятие защиты, отщепление и очистку осуществляли, как описано ранее. Конъюгаты анализировали путем аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали путем масс-спектроскопии (ESI-MS).

Соединение 13: А=DOTA, B₁=4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин; В₂=нет, Xaa₁=DPhe; Xaa₂=Gly; Хаа₃=Leuψ(CH₂NH)-; Хаа₄=Cys

DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂; C₇₃H₁₁₀N₂₀O₁₇S, рассчитано (m/z): 1571,8, обнаружено [М+Na]+: 1593,6

Пример 4

Введение радиоактивной метки в синтезированные конъюгаты (соединения 1-13)

Общая процедура

К 10 мкг аликвоты конъюгата антагониста пептида хелатор-бомбезин в воде добавляли 1-2 мКи водного раствора (¹¹¹InCl₃, ¹⁴⁴LuCl₃ или 6^7/68GaCl₃) и 250-500 мкл 0,4М натрий-ацетатного буфера (рН=5). Этот раствор нагревали в течение 30 минут при 95°С и охлаждали до комнатной температуры в течение 10 минут. Аликвоту 5 мкл реакционной смеси добавляли к 25 мкл Са-DТРРаствора (0,1 М, рН 5,2) и анализировали с помощью ВЭЖХ для определения количества немеченого радионуклида.

Пример 5

Введение радиоактивной метки в синтезированные конъюгаты с помощью ^l15In.

Комплексообразование аналогов бомбезина с ^natIn осуществляли согласно аналогичному протоколу. ^natIn использовали в форме ^natInCl₃ раствора и при молярном соотношении 1:1.

Пример 6 (In vitro исследования)

Материалы и методы для in vitro характеристики антагонистов GRP рецепторов

Реагенты и пептиды

Все реагенты были наилучшими из возможных классов и их получали из коммерческих источников. Мышиное моноклональное антитело с гемагглютининовым (НА) эпитопом получали от Covance (Berkeley, CA). Вторичные антитела Alexa Fluor 488 козьи антимышиные IgG (H+L) получали от Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Бомбезин и антагонист [D-Phe⁶, Leu-NHEt¹³, des-Met¹⁴]-бомбезин(6-14) (GRPR-АНТАГ) получали от Bachem (Bubendorf, Switzerland). RM26, RM1b, In-RM1b, и ¹⁷⁵Lu-AMBA были предоставлены H.R.Mäcke (Basel, Switzerland). Набор для исследования кальция «Fluo-4NW Calcium Assay» получали от Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).

Клеточные линии

Клетки почки человеческих эмбрионов 293 (НЕК293), стабильно экспрессирующие НА-эпитоп, нацеленные на рецептор GRP человека (HEK-GRPR), создавали, как было описано ранее (Cescato и др., 2008) и культивировали при 37°С и 5% CO₂ в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, с GlutaMAX™-I (DMEM), содержащей 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 750 мкг/мл G418. Клетки рака предстательной железы человека (РСЗ клетки) получали от DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH; DSMZ №:ACC465) и культивировали при 37°С и 5% CO₂ в среде Хэма F12K, содержащей 2 мМ L-глутамина и дополненной 10% (об./об) FBS, 100 ед./мл. пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Все культуральные реагенты получали от Gibco BRL (Grand Island, NY).

Измерения связывающей способности

Связывающую способность к GRP рецептору для различных соединений определяли путем авторадиографии рецепторов in vitro на криостатных срезах либо хорошо изученного рака предстательной железы, или на срезах клеточной массы HEK-GRPR или РС3, как было описано ранее (Markwalder и др.. Can. Res., 1999; 59, 1152-1159; Reubi и др., Eur. J. Nucl. Med„ 2000;27: 273-282; Reubi и др., din. Cancer Res. 2002;8 1139-1146). Используемыми радиоактивными лигандами были ¹²⁵I-[Tyr⁴]-бомбезин, который, как известно, предпочтительно метит GRP рецепторы (Vigna и др., Gastroenterology. 1987; 93:1287-1295) и ¹²⁵I-[D-Tyr⁶, β-Ala¹¹, Phe¹³, Nle¹⁴]-бомбезин(6-14) в качестве универсального лиганда рецептора бомбезина (Gastroenterology. 1987; 93:1287-1295). Результаты представлены в таблице 1.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Иммунофлуоресцентную микроскопию, основанную на интернализации, с HEK-GRPR клетками осуществляли, как было описано ранее (Cescato и др., 2006; Cescato и др., 2008). Вкратце, HEK-GRPR клетки выращивали на покрытых поли-D-лизином (20 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) 35 мм планшетах на 4 лунки (Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany). Для эксперимента, клетки обрабатывали либо 10 нМ бомбезина, или 1 мкМ различных аналогов бомбезина, или, для оценки потенциального антагонизма, 10 нМ бомбезина в присутствии 100-кратного избытка этих различных аналогов в течение 30 минут при 37°С и 5% CO₂ в ростовой среде, и затем обрабатывали для иммунофлуоресцентной микроскопии, используя мышиное моноклональное антитело с НА-эпитопом при разведении 1:1,000 в качестве первичного антитела и Alexa Fluor488 козье антимышиное IgG (H+L) при разведении 1:600 в качестве вторичного антитела. Клетки визуализировали, используя флуоресцентный микроскоп Leica DM RB и камеру Olympus DP 10.

Интернализации GRP рецептора, индуцированной бомбезином, эффективно противодействовали аналоги бомбезина Соединение 1, In-Соединение 1, Соединение lb и GRPR-АНТАГ. HEK-GRJPR клетки обрабатывали в течение 30 минут либо наполнителем (без пептида, а), или 10 нмоль/л бомбезина (b), концентрацией, индуцирующей субмаксимальное интернализирующее действие. На панелях (d, f, h,j) представлены клетки, обработанные 10 нмоль/л бомбезина в присутствии 1 мкмоль/л аналогов Соединения 1b, GRPR-АНТАГ, Соединения 1, и In-Соединения 1. Действие Соединения 1b, GRPR-АНТАГ, Соединения 1, и In-Соединения 1 отдельно при концентрации 1 мкмоль/л представлено на панелях (с, е, g, i, k). После инкубирования с пептидами, клетки обрабатывали для иммуноцитохимии, как описано выше. Четкое точечное перинуклеарное окрашивание определяли для клеток, обработанных бомбезином. Это точечное окрашивание эффективно снимается избытком аналогов Соединение 1, In-Соединение 1, Соединение 1b и GRPR-АНТАГ. Соединение-1, In-Соединение 1, Соединение 1b и GRPR-АНТАГ при самостоятельном введении не оказывают влияния на интернализацию GRP рецептора.

См. результаты в таблице 1 и фигуре 2.

Исследование высвобождения кальция.

Внутриклеточное высвобождение кальция измеряли в РС3 клетках, используя набор для анализа кальция «Fluo-4NW Calcium Assay», как описано ранее (Magrys и др.,3. din. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel и др.,; Cescato и др., J. Nucl. Med. 2008; 49:318-326). Вкратце, РС3 клетки высевали (10 тыс.клеток лунку) в планшеты на 96 лунок и культивировали в течение 2 дней при 37°С и 5% CO₂ в культуральной среде. В день эксперимента, клетки промывали буфером для анализа (1×HBSS, 20 мМ HEPES) содержащим 2,5 мМ пробенецида, и затем добавляли 100 мкл/лунку Fluo-4NW красителя в буфере для анализа, содержащем 2,5 мМ пробенецида в течение 30 минут при 37°С и 5% СО₂ и затем дополнительно в течение 30 минут при комнатной температуре. Для измерения внутриклеточной мобилизации кальция после стимуляции тестируемыми аналогами бомбезина, клетки, к которым был добавлен краситель, переносили в SpectraMax M2^e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Внутриклеточную мобилизацию кальция записывали в кинетике в течение 60 секунд при комнатной температуре, наблюдая за испусканием флуоресценции при 520 нм (с λ_ех=485 нм) в присутствии аналогов в указанных концентрациях. Максимальную флуоресценцию (F-max) измеряли после добавления 25 мкМ иономицина. Измерения исходного уровня (F-baseline) проводили на необработанных клетках с добавленным красителем. Данные представлены в виде максимального кальциевого ответа (F-max-F-baseline=100% максимального кальциевого ответа), как было описано ранее (Magrys и др., J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel и др., Cescato и др., J. Nucl. Med. 2008; 49:318-326).). Все опыты повторяли по меньшей мере три раза в трех повторах.

На фигуре 1 показано, что In-соединение 1 и соединение 1а ведут себя как антагонисты, сдвигая кривую зависимости «доза-эффект» вправо в присутствии бомбезина (ВВ). Результаты представлены в таблице 1 и фигуре 1.

Соединение 1: DOTA-Gly-аминобензоил-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 2: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-VAl-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 3: DOTA-4-амино-1-пиперидин-4-карбоновая кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 4: DOTA-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 5: DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота)-(4-амино-1-карбокси-метил-пиперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 6: DOTA-диаминомасляная кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 7: DOTA-4-(2-аминоэтил)-1 -карбоксиметил-пиперазин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 8: DOTA-(5-амино-3-окса-пентил)-полуамид янтарной кислоты-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Соединение 9: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃

Соединение 10: DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃

Соединение 11: DOTA-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃

Соединение 12: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Phe-NH₂

Соединение 13: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH₂NH)-Cys-NH₂

Соединение 14: N₄-триазолы-dPEG₁-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Таблица 1
Свойства аналогов BN относительно связывания, передачи сигналов и интернализации GRP рецептора при исследовании in vitro
Соединение	Связывание IC50 (нМ) среднее значение ±СПГ	Передача сигналов Са++ мобилизация	Интернализация рецептора
1	30±4,5	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
115In-1	16±5,3	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
2	9,7±3,8	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
115In-2	9,3±1,9	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
3	43±14	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
4	21±6,5	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
5	7,3±0,6	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
6	7,4±2,2	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
7	11±0	NA	NA

Соединение	Связывание IC50 (нМ) среднее значение ±СПГ	Передача сигналов Са++ мобилизация	Интернализация рецептора
8	19±3,0	NA	NA
9	3,2±1,3	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
115In-9	2,5±0,2	АНТАГ/нет агонистического действия	антаг/нет агонистического действия
10	6,9±0,5	АНТАГ/нет агонистического действия	NA

Связывающие способности соединений 1, 2 и 9 измеряли после комплексообразования с ¹¹⁵In нерадиоактивным изотопом. Полученные данные свидетельствуют о том, что комплексообразование с изотопом не оказывает влияния на способность связываться с рецептором, а также на антагонистические свойства.

Стандартные методы в релевантных публикациях:

Cescato R, Schuiz S, Waser В, и др. Internalization ofsst2, sst3 and sst5 receptors: Effects of somatostatin agonists and antagonists. J. Nucl. Med., 2006; 47:502-511.

Cescato R, Maina T, Nock B, Nikolopoulou A, Charalambidis D, Piccand V, Reubi JC. Bombesin Receptor Antagonists May Be Preferable to Agonists for Tumor Targeting. J. Nucl. Med.. 2008; 49:318-326.

Magrys, A.; Anekonda, Т.; Ren, G.; Adamus, G. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. din. Immunol. 2007, 27, 181-192.

Markwalder R, Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in the human prostate: relation to 20 neoplastic transformation. Cancer Res. 1999; 59:1152-1159.

Michel, N.; Ganter, K.; Venzke, S.; Bitzegeio, J.; Fackler, О. Т.; Kepplet, О.Т. The Nef protein of human immunodeficiency virus is a broad-spectrum modulator ofchemokine receptor cell surface levels that acts independently of classical motifs for receptor endocytosis and Galphai signaling. Mol. Biol. Cell. 2006, 77, 3578-3590

Reubi JC, Schaer JC, Waser B, et al. Affinity profiles for human somatostatin receptor sstl-sst5 of somatostatin radiotracers selected for scintigraphic and radiotherapeutic use. Eur. J. Nucl. Med., 2000; 27:273-282.

Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, et al. Bombesin Receptor Subtypes in Human Cancers: Detection with the Universal Radioligand (125)I-[D-TYR(6), beta-ALA(11), PHE(13), NLE(14)] Bombesin(6-14). Clin. Cancer Res., 2002; 8:1139-1146.

Vigna SR, Mantyh CR, Giraud AS, et al. Localization of specific binding sites for bombesin in the canine gastrointestinal tract. Gastroenterology. 1987; 93:1287-1295.

Пример 7

Исследования биораспределения у «голых» мышей, несущих РС-3 опухоль

Самкам «голых» мышей подкожно имплантировали 10 миллионов PC-3 опухолевых клеток, которые только что разводили в стерилизованном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS, рН 7,4). Через одиннадцать дней после инокуляции, мышам инъецировали в хвостовую вену 10 пмоль радиоактивно меченных пептидов (около 0,18 МБк), разведенных в NaCl (0,1% бычий сывороточный альбумин, рН 7,4, суммарный инъецированный объем = 100 мкл). Для определения неспецифического поглощения опухолью или рецептор-положительными органами, группе из 4 животных предварительно инъецировали 0,02 мкмоль немеченного пептида в 0,9% растворе NaCl и через 5 минут инъецировали радиоактивно меченный пептид. В интервалы 1, 4, 24, 48, и 72 часов, мышей (в группах 3-4) умертвляли и представляющие интерес органы собирали, промывали от избытков крови, взвешивали и импульсы подсчитывали на γ-счетчике.

¹¹¹In-СОЕДИНЕНИЕ 1

¹¹¹In-DOTA-Gly-аминобензоил-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Инъецированное количество:	5 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	2000-кратное
Животное:	«голые» мыши, несущие РС3 опухоль; 3 мыши/группу
Момент времени:	1 ч, 4 ч, 4 ч блокирования, 24 ч, 48 ч, 72 ч
Орган	1 час	4 часа	4 часа блокирование	24 часа	48 часов	72 часа
кровь	0,86±0,17	0,04±0,00	0,02±0,01	0,01±0,00	0,00±0,00	0,00±0,00
сердце	0,28±0,05	0,04±0,01	0,04±0,01	0,03±0,01	0,00±0,00	0,01±0,00
Печень	1,93±0,29	0,38±0,05	0,39±0,08	0,19±0,01	0,10±0,01	0,09±0,02
селезенка	0,57±0,21	0,12±0,01	0,09±0,01	0,05±0,01	0,04±0,01	0,02±0,00
легкие	0,82±0,13	0,12±0,04	0,10±0,03	0,05±0,01	0,02±0,01	0,01±0,00
почки	3,99±0,33	1,93±0,18	2,67±0,10	1,01±0,06	0,50±0,09	0,28±0,02
желудок	3,31±0,63	0,76±0,14	0,07±0,03	0,05±0,02	0,01±0,00	0,02±0,01
кишечник	1,73±0,48	0,20±0,10	0,07±0,01	0,04±0,00	0,01±0,00	0,01±0,00
Надпочеч- ник	4,14±1,46	1,20±0,12	0,10±0,06	1,24±0,16	0,38±0,09	0,36±0,04
Поджелу- дочная железа	21,92+1,34	1,32±0,31	0,07±0,02	0,15+0,02	0,06±0,01	0,06±0,01
гипофиз	7,80±1,90	0,85±0,45	0,11±0,09	0,21±0,19	0,03±0,03	0,05±0,07
мышцы	0,19±0,06	0,03±0,01	0,02±0,00	0,03±0,00	0,00±0,00	0,00±0,00
костная ткань	0,40±0,10	0,18±0,07	0,04±0,01	0,14±0,03	0,03±0,00	0,03±0,01
опухоль	14,24±1,75	13,46±0,80	0,46±0,00	6,58±1,14	2,08±0,12	1,31±0,23
Опухоль к ткани	1 час	4 часа	24 часа	48 часов	72 часа
опухоль:почки	3,6	7,0	6,5	4,2	4,7
опухоль:печень	7,4	35,4	34,6	20,8	14,5
опухоль:кровь	16,5	336,5	658,0	1600,0	1871,4
опухоль:мышцы	75,0	448,7	219,3	693,3	1091,7

⁶⁸Ga-СОЕДИНЕНИЕ 1

⁶⁸Ga-DOTA-Gly-аминобензоил-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Животное:

«голые» мыши, несущие РС3 опухоль; 3 мыши/группу

Инъецируемое количество:	1,27 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	3000-кратное Соединение 1
Момент времени:	1 час, 1 час блокирование, 2 часа,
Орган	1 час	1 час блокирование	2 часа
кровь	0,86±0,09	0,55±0,30	0,39±0,15
сердце	0,33±0,21	0,30±0,18	0,14±0,02
печень	1,14±0,37	1,05±0,60	0,98±0,32
селезенка	1,29±0,53	0,08±0,05	0,08±0,01
легкие	0,80±0,33	0,71±0,23	0,21±0,09
почки	2,79±0,39	3,18±1,79	1,21±0,12
желудок	3,09±0,51	0,41±0,31	1,68±0,02
кишечник	2,09±0,17	1,06±0,55	5,39±0,52
надпочечник	3,31±0,78	0,07±0,06	0,89±0,62
поджелудочная железа	27,84±4,88	0,96±0,45	10,73±2,76
гипофиз	13,35±1,32	0,28±0,08	0,22±0,00
мышцы	0,26±0,08	0,07±0,05	0,20±0,02
костная ткань	0,03±0,01	0,18±0,11	0,03±0,01
опухоль	8,71±0,67	2,04±1,04	10,45±1,61
	1 час	2 часа
опухоль:почки	3,13	8,64
опухоль:печень	7,66	10,68
опухоль:поджелудочная железа	0,31	0,97
опухоль:кровь	10,18	27,08
опухоль:мышцы	33,74	53,51

¹¹¹In-СОЕДИНЕНИЕ 2

¹¹¹In-DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Инъецированное количество:	5 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	2000-кратное
Животное:	«голые» мыши, несущие РС3 опухоль; 3 мыши/группу
Момент времени:	1 ч, 4 ч, 4 ч блокирования, 24 ч, 48 ч, 72 ч

Орган	1 час	4 часа	4 часа блокирование	24 часа	48 часов	72 часа
кровь	0,77±0,28	0,05±0,04	0,13±0,02	0,00±0,00	0,00±0,00	0,00±0,00
сердце	0,32±0,09	0,04±0,03	0,09±0,01	0,02±0,01	0,01±0,00	0,02±0,02
печень	0,49±0,12	0,18±0,06	0,34±0,03	0,09±0,01	0,07±0,01	0,06±0,02
селезенка	0,53±0,20	0,12±0,06	0,16±0,02	0,06±0,02	0,05±0,01	0,06±0,03
легкие	0,70±0,30	0,10±0,07	0,19±0,01	0,04+0,03	0,11±0,24	0,04±0,02
почки	4,78±1,11	2,14±0,73	2,98±0,20	1,25+0,16	0,91±0,09	0,74±0,18
желудок	3,15±0,78	1,07±0,15	0,12±0,02	0,06±0,02	0,03±0,01	0,05±0,01
кишечник	2,11±0,47	0,25±0,15	0,11±0,01	0,04±0,01	0,03±0,01	0,03±0,01
Надпочеч- ник	3,46+2,07	1,17±0,54	1,10±0,60	0,71±0,29	0,54±0,29	1,01±0,74
Поджелу- дочная железа	22,64±4,71	1,55±0,48	0,10±0,00	0,32±0,09	0,19±0,04	0,19±0,02
гипофиз	7,00±5,68	0,59±0,55	0,58±0,49	0,07±0,33	0,21±0,33	0,51±0,24
мышцы	0,29±0,17	0,05±0,04	0,06±0,02	0,02±0,01	0,01±0,01	0,02±0,01
костная ткань	0,91±0,68	0,35±0.57	0,35±0,11	0,20±0,18	0,12±0,11	0,15±0,05
опухоль	15,23±4,78	11,75±2,43	0,45±0,04	6,84±1,02	4,67±0,39	4,07±0,34
Опухоль к ткани	1 час	4 часа	24 часа	48 часов	72 часа
опухоль:почки	3,2	5,5	5,5	5,1	5,5
опухоль:печень	30,9	64,6	74,1	67,2	63,0
опухоль:кровь	19,9	243,9	2744,6	3823,7	3391,2
опухоль:поджелудочная железа	0,7	7,6	21,4	24,6	21,4
опухоль:мышцы	52,0	260,2	436,6	354,5	165,4

⁶⁸Ga-СОЕДИНЕНИЕ 2

⁶⁸Ga-DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Радиоактивный лиганд:	68Ga-СОЕДИНЕНИЕ 2
Животное:	«голые» мыши, несущие мыши/группу РС3 опухоль; 3
Инъецируемое количество:	1,27 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Момент времени:	1 час

Орган	1 час
кровь	0,45±0,01
сердце	0,19±0,02
печень	0,41±0,04
селезенка	0,36±0,01
легкие	0,34±0,03
почки	1,87±0,08
желудок	2,13±0,34
кишечник	1,54±0,22
надпочечник	2,48±0,48
поджелудочная железа	11,63±0,19
гипофиз	0,36±019
мышцы	0,13±0,00
костная ткань	0,23±0,03
опухоль	9,31±1,58
	1 час
опухоль:почки	4,98
опухоль:печень	22,60
опухоль:поджелудочная железа	0,80
опухоль:кровь	20,85
опухоль:мышцы	74,02

¹¹¹In-Соединение 4

¹¹¹In-DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Инъецированное количество:	5 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	2000-кратное
Животное:	«голые» мыши, несущие РСЗ опухоль; 3 мыши/группу
Момент времени:	1 ч, 4 ч, 4 ч блокирования, 24 ч, 48 ч, 72 ч
Орган	1 час	4 часа	4 часа блокирование	24 часа
кровь	0,21±0,02	0,02±0,00	0,01±0,00	0,00±0,00
сердце	0,08±0,01	0,02±0,00	0,02+0,00	0,00±0,00
печень	0,22±0,01	0,09±0,01	0,09±0,01	0,03±0,01
селезенка	0,18±0,10	0,07±0,02	0,04±0,01	0,01±0,00

Орган	1 час	4 часа блокирование	4 часа	24 часа
почки	5,08±0,72	1,76±0,36	2,04±0,15	1,37±0,22
желудок	3,92±1,26	0,06±0,01	0,87±0,58	0,05±0,01
кишечник	2,39±0,42	0,03±0,01	0,17±0,10	0,05±0,02
надпочечник	3,63±0,53	0,07±0,02	0,68±0,31	0,62±0,16
Поджелудоч- ная железа	26,83±4,34	0,06±0,02	1,36±0,81	0,33±0,05
гипофиз	9,02±0,99	0,23±0,14	0,38±0,16	0,46±0,52
мышцы	0,19±0,07	0,01±0,00	0,02±0,00	0,02±0,00
костная ткань	0,34±0,04	0,03±0,03	0,08±0,02	0,08±0,02
опухоль	10,27±0,36	0,61±0,07	9,35±0,73	6,33±0,76
Опухоль к ткани	1 час	4 часа	24 часа
опухоль:кровь	13,73	319,66	1155,51
опухоль:почки	2,02	4,59	4,62
опухоль:поджелудочная железа	0,38	6,90	19,16
опухоль:мышцы	53,65	475,17	364,92
опухоль: костная ткань	29,93	124,55	76,65

¹¹¹In-Соединение 5

¹¹¹In-DOTA-(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановая кислота)-(4-амино-1-карбокси-метил-пиперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Животное:	«голые» мыши, несущие РСЗ опухоль; 3~4 мыши/группу
Инъецированное количество:	5 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	2000-кратное
Момент времени:	1 ч, 4 ч, 4 ч блокирования, 24 ч
Орган	1 час	4 часа блокирование	4 часа	24 часа
кровь	0,75±0,21	0,02±0,00	0,03±0,01	0,01±0,00
сердце	0,28±0,06	0,02±0,00	0,03±0,01	0,02±0,00
печень	0,40±0,09	0,14±0,01	0,15±0,05	0,11±0,02
селезенка	0,80±0,28	0,06±0,01	0,09±0,03	0,07±0,01
легкие	0,62±0,15	0,05±0,01	0,15±0,19	0,51±0,73

Орган	1 час	4 часа блокирование	4 часа	24 часа
почки	5,08±0,72	1,76±0,36	2,04±0,15	1,37±0,22
желудок	3,92±1,26	0,06±0,01	0,87±0,58	0,05±0,01
кишечник	2,39±0,42	0,03±0,01	0,17±0,10	0,05±0,02
надпочечник	3,63±0,53	0,07±0,02	0,68±0,31	0,62±0,16
Поджелудоч- ная железа	26,83±4,34	0,06±0,02	1,36±0,81	0,33±0,05
гипофиз	9,02±0,99	0,23±0,14	0,38±0,16	0,46±0,52
мышцы	0,19±0,07	0,01±0,00	0,02±0,00	0,02±0,00
костная ткань	0,34±0,04	0,03±0,03	0,08±0,02	0,08±0,02
опухоль	10,27±0,36	0,61±0,07	9,35±0,73	6,33±0,76
Опухоль к ткани	1 час	4 часа	24 часа
опухоль:кровь	13,73	319,66	1155,51
опухоль:почки	2,02	4,59	4,62
опухоль:поджелудочная железа	0,38	6,90	19,16
опухоль:мышцы	53,65	475,17	364,92
опухоль: костная ткань	29,93	124,55	76,65

¹¹¹In-Соединение 9

¹¹¹In-DOTA-DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Cly-His-Leuψ(СНОН-СН₂)-(СН₂)₂-СН₃

Инъецированное количество:	5 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Блокирующее соединение	2000-кратное
Животное:	«голые» мыши, несущие РСЗ опухоль; 3 мыши/группу
Момент времени:	1 ч, 4 ч, 4 ч блокирования, 24 ч, 48 ч, 72 ч
Орган	1 час	4 часа	4 часа блокирование	24 часа	48 часов	72 часа
кровь	0,43±0,10	0,12±0,03	0,04±0,00	0,01±0,00	0,01±0,00	0,01±0,00
сердце	0,17±0,03	0,09±0,02	0,15±0,05	0,03±0,01	0,02±0,00	0,08±0,03
печень	0,73±0,12	0,49±0,14	0,40+0,02	0,20±0,02	0,11±0,01	0,10+0,02
Селезен- ка	1,13±0,41	0,57±0,24	0,23±0,03	0,21±0,06	0,15±0,04	0,15±0,04
легкие	0,45±0,05	0,21±0,06	0,38±0,06	0,08±0,04	0,05±0,02	0,18±0,07
почки	5,23±3,01	2.43±0,47	2,88±1,52	1,41±0,22	0,97±0,06	0,55±0,15
желудок	4,43±2,48	5,72+4,04	0,16±0,03	1,08±0,15	0,43±0,10	0,28±0,09

Орган	1 час	4 часа	4 часа блокирование	24 часа	48 часов	72 часа
кишечник	3,61±0,61	3,31±1,61	0,14±0,02	0,35±0,05	0,16±0,07	0,10±0,01
надпочечник	10,66±2,64	5,16±1,55	1,36±0,56	2,31±0,96	2,24±1,43	1,84±0,36
поджелудочная железа	65,69±8,14	39,80±9,25	0,18±0,04	4,52±0,53	2,30±0,19	1,06±0,19
Гипо- физ	12,63±3,26	5,54±2,07	3,72+1,62	0,71±0,37	0,56±0,24	2,56±0,28
Мыш- цы	0,22±0,06	0,14±0,04	0,13±0,07	0,05±0,01	0,03±0,01	0,08±0,04
Кост- ная ткань	1,31±1,29	0,71±0,25	1,61±0,52	0,29±0,14	0,23±0,13	1,08±0,83
опухоль	9,18±1,16	13,17±5,01	0,38±0,08	8,39±0,88	5,89±0,351	3,04±1,44
Опухоль к ткани	1 час	4 часа	24 часа	48 часов	72 часа
опухоль:почки	1,8	5,4	6,0	6,1	6,2
опухоль:печень	12,7	26,7	42,4	53,0	35,0
опухоль:кровь	21,1	109,7	631,4	803,8	304,0
опухоль:поджелу дочная железа	0,2	0,3	1,9	2,6	2,9
опухоль:мышцы	42,6	94,7	169,2	191,9	42,9

Пример 8

РЕТ/СТ-визуализация. Эксперимент биораспределения у мышей, несущих опухоль РС-3 и LNCaP при воздействии Ga-68-DOTA Соединения 2, связывающая способность и стабильность

Визуализация+Биораспределение

Соединение 2: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂

Эмпирическая формула: C78H115N20019Ga; Молекулярный вес: 1704,89

Ga-68-DOTA- Соединение 2 визуализировали на microPET/CT (Inveon, Siemens) у мышей, несущих опухоль РС-3 и LNCaP, через 1 час после инъекции 10 МБк радиоактивного индикатора. Вследствие быстрого почечного клиренса этого антагониста бомбезина наблюдали очень низкую фоновую активность при незначительном всасывании в почках и в мочевом пузыре. Высокая видимость контрастной опухоли в обоих ксенотрансплантатх эффективно блокировалась либо 100 мкг бомбезина или самим нерадиоактивными Соединением 2. Рецепторы бомбезина эффективно блокировались с помощью бомбезина, что приводило к критической потере сигнала в опухоли фигура 3а и 3b у мышей, несущих опухоль PC-3, +фигура 4а и 4b у мышей, несущих опухоль LNCaP).

Связывающая способность

Связывающую способность Ga-68-DOTA- Соединения 2 к GRPr определяли с помощью двух различных методов, включающих авторадиографию рецептора на тканях человека и клеточное исследование, используя PC-3 клетки. Оба метода указывали на высокую связывающую способность Соединения 2 с IC₅₀ ~8 нМ на основании нерадиоактивного DOTA-Соединение 2 пептида.

Стабильность в плазме и микросомах мышей Ga-68-DOTA-

Соединение 2 проявляло хорошую метаболическую стабильность, которую измеряли с помощью различных методов т vitro и т vivo. Стабильность в плазме в условиях in vivo Ga-68-DOTA- Соединения 2 исследовали в мышей без опухоли. Кровь и мочу анализировали с помощью ВЭЖХ через 1, 3, 5, 10 и 15 после внутривенной инъекции около 20 МБк Ga-68-DOTA- Соединения 2 (Фигура 10а, b, с, d, e). Через несколько минут, было обнаружено незначительное разложение в плазме радиоактивного индикатора, на что указывало наличие двух очень небольших/полярных метаболитов при времени удерживании 1,3 минуты и 1,5 минуты, которые также обнаруживались в качестве основных метаболитов в моче. Само соединение проявляет время удерживания 11,6-11,7, при этом двойной пик наблюдается, начиная с 5 минут после инъекции.

Микросомальную стабильность Ga-68-DOTA- Соединения 2 определяли, используя микросомы мышей и человека, инкубируемые с радиоактивным индикатором, и их анализировали с помощью ВЭЖХ. Не было обнаружено разложения Ga-68-DOTA-Соединения 2 в микросомах мышей или человека. Незначительные примеси, обнаруженные на хроматограммах, также наблюдали без микросомального ко-фактора.

Пример 9

SPECT/CT-визуализация и исследование биораспределения 99mTc-ARN4-06 у мышей, несущих РС-3-опухоль

См. вышеописанный протокол опыта

Радиоактивный лиганд:	99mTc-ARN4-06
Животное:	«голые» мыши, несущие РС-3 опухоль; 3 мыши/группу
Инъецируемое количество:	10 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Момент времени:	1 час, 4 часа и 24 часа

орган	1 час	Среднекв. откл.	4 часа	Среднекв. откл.	24 часа	Среднекв. откл.
кровь	1,32	0,07	0,33	0,05	0,04	0,01
сердце	0,64	0,15	0,22	0,03	0,10	0,04
печень	6,31	1,16	3,62	1,16	1,19	0,36
селезенка	3,91	0,66	1,29	0,53	0,87	0,18
легкие	5,11	1,00	3,17	1,51	1,69	0,84
левая почка	6,55	0,59	2,73	0,42	1,28	0,30
желудок	8,09	1,45	5,44	1,26	0,61	0,09
кишечник	8,41	2,39	2,02	0,80	0,16	0,08
надпочечник	11,99	1,62	6,31	0,27	1,41	0,45
поджелудочная железа	72,50	8,98	11,18	2,89	0,41	0,20
гипофиз	6,86	2,85	2,12	0,59	0,83	0,31
мышцы	0,27	0,03	0,07	0,00	0,18	0,12
костная ткань	0,78	0,13	0,45	0,18	0,35	0,20
опухоль	28,66	1,75	34,68	3,71	18,40	2,58

орган	1 час	Среднекв. откл.	4 часа	Среднекв. откл.	24 часа	Среднекв. откл.
почки	6,26	0,48	2,84	0,49	1,24	0,32
Соотношение опухоль:орган	1 час	4 часа	24 часа
опухоль:кровь	20,79	85,11	455,94
опухоль:сердце	36,75	150,38	176,45
опухоль:печень	4,37	9,50	15,47
опухоль:селезенка	7,50	20,51	21,05
опухоль:легкие	5,64	11,78	10,88
опухоль:почки	4,26	12,92	14,35
Радиоактивный лиганд:	99mTc-ARN-05
Животное:	«голые» мыши, несущие РС-3 опухоль; 6-9 мышей/группу
Инъецируемое количество:	10 мкКи/10 пмоль/100 мкл/мышь
Момент времени:	1 час, 4 часа, 24 часа
опухоль:желудок	3,32	5,83	30,02
опухольжишечник	3,20	16,51	117,53
опухоль:надпочечник	2,31	2,62	13,07
опухоль:поджелудочная железа	0,38	3,28	44,93
опухоль:гипофиз	4,43	4,40	22,14
опухоль:мышцы	116,82	283,06	99,65
опухоль:костная ткань	34,10	35,16	52,06
опухоль:почки	4,25	12,25	14,87

На фигуре 6 показано SPECT/CT изображение для ^99mTc-ARN4-06 (15 МБк/200 пмоль)

Пример 10

SPECT/CT-визуализация и исследование биораспределения для ^99mTc-ARN4-05 у мышей, несущих РС-3-опухоль

См. вышеописанный протокол опыта

орган	1 час	Среднекв. откл.	4 часа	Среднекв. откл.	24 часа	Среднекв. откл.
кровь	1,69	0,14	0,40	0,05	0,09	0,02
сердце	0,68	0,02	0,20	0,03	0,14	0,07
печень	12,32	1,01	7,75	0,62	3,88	0,40
селезенка	4,00	0,60	1,72	0,34	0,83	0,22
легкие	3,11	0,47	1,24	0,41	1,15	1,47
левая почка	10,50	1,20	6,12	1,17	1,42	0,13
желудок	5,68	0,01	4,86	1,04	0,42	0,15
кишечник	6,97	1,57	2,12	0,37	0,12	0,01
надпочечник	19,05	3,06	7,91	2,70	2,08	0,31
поджелудоч- ная железа	64,86	6,72	19,86	2,35	0,57	0,21
гипофиз	3,67	2,03	1,15	0,11	1,53	1,33
мышцы	0,43	0,16	0,08	0,02	0,11	0,04
костная ткань	1,34	0,26	0,57	0,11	0,41	0,19
опухоль	22,50	2,62	29,91	4,00	15,16	0,45
Соотношение опухоль:орган	1 час	4 часа	24 часа
опухоль:кровь	13,30	74,77	167,74
опухоль:сердце	33,19	149,55	105,06
опухоль:печень	1,83	3,86	3,91
опухоль:селезенка	5,62	17,41	18,21
опухоль:легкие	7,24	24,11	13,21
опухоль:почки	2,14	4,89	10,71
опухоль:желудок	3,96	6,15	35,99
опухоль:кишечник	3,23	14,09	129,43
опухоль:надпочечник	1,18	3,78	7,30
опухоль:поджелудочная	0,35	1,51	26,66

Соотношение опухоль:орган	1 час	4 часа	24 часа
железа
Опухоль:гипофиз	6,14	25,96	9,93
опухоль:мышцы	52,54	364,22	133,21
опухоль:костная ткань	16,80	52,85	37,06

На фигуре 8 показано SPECT/CT изображение ^99mTc-ARN4-05 (15 МБк/200 пмоль)

Пример 11

Синтез Ga-68-DOTA Соединения 2

Стадия 1: Нерадиоактивные пептиды синтезировали путем твердофазного пептидного синтеза (SPPS) согласно стандартной Fmoc стратегии, используя Rink амид полимер на полистирольной подложке.

Стадия 2:

350 мкл 0,25М HEPES в Wheaton V-сосуде

- Добавляли [68Ga]GaCl3 в 400 мкл 97,6% ацетона/0,05 н. HCl

- Значение рН доводили до ~3,5 с помощью 0,1 М HCl

- Добавляли 40 мкг пептида в 40 мкл воды

- Нагревали 75 Вт (95°С) в течение 30 с

- Отстаивали в течение 30 с

- Повторяли нагревали и отстаивание еще три раза

- Добавляли 5 мл воды к реакционной смеси

- Иммобилизовали на tC 18 Light SPE

- Промывали водой (5 мл)

- Элюировали EtOH (500 мкл)

Радиохимический выход (неоптимизированный)	79-231 МБк (32-60% d.c.)
Исходная активность	189-593 МБк
Без радиоактивной метки	10
Ошибки	0
Радиохимическая чистота	>98% (с помощью ВЭЖХ и ITLC)
Удельная активность	3,2-11,8 ГБк/мкмоль

На фигуре 9 показан ВЭЖХ анализ для Ga-68-DOTA Соединения 2 на колонке с обращенной фазой.

Чистота продукта

Колонка: АСЕ 5µ С 18 50×4,6 мм

Растворитель: Растворитель А: H₂O+0,1% ТФУ

Растворитель В: MeCN+0,1% ТФУ

Градиент: 5-95% за 7 мин

Поток. 2 мл/мин

Пример 12

Стабильность в сыворотке Lu-177-DOTA Соединения 2

Соединение 2: DOTA-4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Cly-His-Sta-Leu-NH₂

Стабильность в сыворотке Lu-177-DOTA Соединения 2, радиоактивно меченного с помощью Lu-177, также исследовали в сыворотке крови человека. После инкубирования в течение 96 часов Lu-177-DOTA Соединения 2 в сыворотке человека все еще сохранялось 70% соединения, на что указывал анализ с помощью ВЭЖХ (Фигура 2). К 1 мл свежеприготовленной сыворотки человека, предварительно уравновешенной в 5% CO₂ среде при 37°С, добавляли 0,03 нмоль стандартного раствора ¹⁷⁷Lu-меченого пептида. Смесь инкубировали в среде 5% CO₂, 37°С. В различные промежутки времени, 100-мкл аликвот (в трех повторах) удаляли и обрабатывали с 200 мкл EtOH для осаждения сывороточных белков. После этого пробы центрифугировали в течение 15 минут при 5000 об./мин. 50 мкл супернатанта удаляли для подсчета активности на γ-счетчике для лунок, осадок промывали два раза с помощью 1 мл EtOH и подсчитывали, и активность в супернатанте сравнивали с активностью в осадке после центрифугирования для получения процента пептидов, несвязанных с белками, или радиоактивного металла, перенесенного на белки сыворотки. Супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ (элюенты: А=0,1% трифтороуксусная кислота в воде и В=ацетонитрил; градиент: 0 мин. 95% А; 20 минут 50% А) для определения стабильности пептида в сыворотке.

На фигуре 11 показано стабильность Lu-177-DOTA Соединения 2 в сыворотке человека.

Пример 13

Сравнение с F18-холином и F18-FDG

Ga-68-

DOTA-

4-амино-1-карбоксиметил-пиперидин-

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Через 1 час после инъекции мышей, несущих РС-3 опухоль, сравнивали с F-18 индикатором [¹⁸F]фторэтилхолин (FEC), используемым для визуализации рака предстательной железы, и FDG золотой стандарт F18 индикатор в онкологии. Высокие соотношения опухоль-к-ткани подчеркивают диагностическую полезность Ga-68 соединения RM2 для PET визуализации

См. фигуру 12.

1. Конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу (I)

где
x представляет собой целое число от 1 до 3,
n представляет собой целое число от 1 до 6,
A представляет собой хелатор металла для трехвалентных металлов, содержащий по меньшей мере один радионуклидный металл, который выбирают из группы, включающей хелаторы на основе DOTA, NODASA, NODAGA, NOTA, DTPA, EDTA, ТЕТА и TRITA,
B представляет собой спейсер, связанный с N-концом C, или ковалентную связь, где спейсер B, связанный с N-концом C, имеет общую формулу II:
$$(II)B_1-B_2$$
где
B₁ представляет собой невстречающуюся в природе аминокислоту,
B₂ представляет собой невстречающуюся в природе аминокислоту,
C представляет собой антагонист пептида аналога бомбезина с последовательностью С-1-С-4, где:
C-1: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His¹²-Xaa₃ ¹³-Xaa₄ ¹⁴-ZH,
где:
Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже


K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,
Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,
Xaa₃ представляет собой статин, 4-Am, 5-MeHpA, 4-Am, 5-MeHxA,
Xaa₄ представляет собой Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle или изо-Bu-Gly, и
Z представляет собой NH, O;
C-2: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His¹²-Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃, где:
Leuψ(CHOH-CH₂)-(CH₂)₂-CH₃ представляет собой
Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже

, и
K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,
Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala;
C-3: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His^l2-Xaa₅ ¹³-Xaa₆ ¹⁴-ZH,
где:
Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже

,
K представляет собой F, Cl, I, или NO₂,
Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,
Xaa₅ представляет собой Leuψ-CH₂NH-,
Xaa₆ представляет собой Cys, Phe, Trp, Tpi или Tac,
где Tpi и Tac имеют следующие значения:

и
Z представляет собой NH, или O;
C-4: Xaa₁ ⁶-Gln⁷-Trp⁸-Ala⁹-Val¹⁰-Xaa₂ ¹¹-His¹²-Xaa₇,
где:
Xaa₁ представляет собой D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp или остаток, имеющий любую из формул, представленных ниже


K представляет собой F, Cl, I, или NO₂
Xaa₂ представляет собой Gly или β-Ala,
Xaa₇ представляет собой Leu-O-Алкил,
или конъюгат имеет общую формулу (I')

где
A' включен вместо A и имеет такие же значение, как и А, за исключением того, что он представляет собой хелатор металла без радионуклидного металла,
B и C имеют вышеуказанные значения,
и их фармацевтически приемлемые соли неорганических или органических кислот, их комплексы, сложные эфиры, амиды.

2. Конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина по п.1, где радионуклидный металл для визуализации выбирают из группы, включающей ^133mIn, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁵²Fe, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ²⁰³Pb, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁵¹Cr, ^52mMn и ¹⁵⁷Gd.

3. Конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина по п.1, где радионуклидный металл для лучевой терапии выбирают из группы, включающей ¹⁸⁶Re, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ⁶⁹Er, ¹²¹Sn, ¹²⁷Te, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁶¹Tb, ¹⁰⁹Pd, ¹⁸⁸Rd, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁷⁷As, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵¹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁷²Tm, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ²¹³Bi, ²²⁵Ac и ^177mSn.

4. Конъюгат антагониста пептида аналога бомбезина по п.1, где невстречающаяся в природе аминокислота представляет собой соединение, имеющее любую из общих формул III, IV, V или VI
где
III

где
a представляет собой целое число от 0 до 3,
b представляет собой целое число от 0 до 3,
и относительные схемы замещения или необязательно 1,2-, 1,3- или 1,4-;

где
c представляет собой целое число от 1 до 24,
d представляет собой целое число от 1 до 6;

где
E' представляет собой NH или CH₂,
f представляет собой целое число от 0 до 6,
g представляет собой целое число от 0 до 6;
когда E' представляет собой CH₂, то 6-ти членное кольцо необязательно замещено в любом положении углерода 6-ти членного кольца на том же самом углероде кольца или на различных углеродах,
когда E' представляет собой NH, то 6-ти членное кольцо необязательно замещено в любом положении углерода 6-ти членного кольца на том же самом атоме углерода кольца или на различных атомах углерода и/или на атоме азота при условии, что f или g представляет собой целое число, равное или больше 1;
VI

где
i представляет собой целое число от 1 до 6,
j представляет собой целое число от 1 до 6,
P представляет собой O или H₂,
предпочтительно,
i представляет собой целое число от 1 до 3,
j представляет собой целое число от 1 до 3,
P представляет собой O.

5. Фармацевтическая композиция для лечения и предотвращения заболеваний, связанных с опухолевыми клетками и/или опухолевыми и периоопухолевыми сосудами, содержащая любые из конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина по любому из пп.1-4 в эффективном количестве.

6. Применение конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина по любому из пп.1-4 для связывания с рецепторами бомбезина и/или для ингибирования рецепторов бомбезина, предпочтительно рецептора гастрин-высвобождающего пептида (GRP).

7. Способ приготовления любого одного из конъюгатов антагониста пептида аналога бомбезина по п.1, который включает стадию
- радиоактивное хелатирование конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина, который имеет общую формулу , как определено выше, с подходящим радионуклидным металлом или атомом металла.

8. Способ визуализации рецепторов бомбезина, предпочтительно опухолевых клеток, которые экспрессируют GRP рецептор, и/или опухолевых и периопухолевых сосудов, у пациента, который включает стадии:
- введение пациенту радиофармацевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина по любому из пп.1-4;
- визуализацию радионуклидного металла у пациента.

9. Применение радиофармацевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина по любому из пп.1-4 для приготовления визуализирующего средства для визуализации рецепторов бомбезина, предпочтительно опухолевых клеток, которые экспрессируют GRP рецептор и/или опухолевых и периопухолевых сосудов.

10. Применение по п.9, где указанные опухолевые клетки относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:
- рак предстательной железы, включая метастазы
- рак молочной железы, включая метастазы
- желудочно-кишечные стромальные опухоли
- мелкоклеточный рак легкого
- почечноклеточный рак,
- нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы,
- плоскоклеточный рак головы и шеи,
- нейробластомы, и
- плоскоклеточный рак пищевода
и где
указанные опухолевые и периопухолевые сосуды относятся к злокачественным новообразованиям, которые выбирают из группы, включающей:
- рак яичников,
- рак эндометрия, и
- рак поджелудочной железы.

11. Способ лечения или предотвращения заболеваний, связанных с опухолевыми клетками и/или опухолевыми и периоопухолевыми сосудами, который включает стадию:
- введение терапевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина в соответствии с любым из пп.1-4.

12. Применение терапевтически эффективного количества конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина в соответствии с любым из пп.1-4 для приготовления лекарственного средства для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с опухолевыми клетками и/или опухолевыми и периоопухолевыми сосудами.

13. Применение по п.12, где указанные заболевания, связанные с опухолевыми клетками, выбирают из группы, включающей:
- рак предстательной железы, включая метастазы,
- рак молочной железы, включая метастазы,
- желудочно-кишечные стромальные опухоли,
- мелкоклеточный рак легкого,
- почечноклеточный рак,
- нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы,
- плоскоклеточный рак головы и шеи,
- нейробластомы, и
- плоскоклеточный рак пищевода
и где
указанные заболевания, связанные с опухолевыми и периопухолевыми сосудами, выбирают из группы, включающей:
- рак предстательной железы, включая метастазы, и
- рак молочной железы, включая метастазы.

14. Набор для препарата радиотерапевтического средства и визуализирующего средства, который включает флакон, содержащий заранее определенное количество конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина по п.1 и приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или адъювант для мечения хелатора металла радиоактивным изотопом.

15. Набор для препарата радиофармацевтического визуализирующего средства, который включает флакон, содержащий заранее определенное количество конъюгата антагониста пептида аналога бомбезина по п.1 и приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или адъювант для мечения хелатора металла радиоактивным изотопом.

16. [⁶⁸Ga]-DOTA-4-амино-1-карбоксиметилпиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂.

17. DOTA-4-амино-1-карбоксиметилпиперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂.