Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк



Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк
Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк

 


Владельцы патента RU 2528251:

Общество с ограниченной ответственностью "Гематологическая Корпорация" (ООО "ГемаКор") (RU)

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются слитого белка для специфического ингибирования свертывания крови, экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей такой слитый белок, бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной такой ДНК, и способу получения слитого белка. Представленный слитый белок включает тиоредоксин I E.coli и инфестин-4 и характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2. Плазмидная ДНК содержит последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую представленный слитый белок, находящуюся под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке. Способ получения упомянутого слитого белка включает культивирование упомянутых бактерий в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку указанного слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии. Охарактеризованные решения позволяют получить белок, обеспечивающий указанную специфичность, с последующим его использованием в блокировании контактной активации свертывания крови за счет ингибирования XIIa фактора и отсутствии ингибирования Ха фактора. 4 н.п. ф-лы, 10 ил., 7 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии.

Предшествующий уровень техники.

Биологические жидкости и ткани животных и растений содержат большое число ингибиторов протеаз. Большая часть хорошо изученных в настоящее время белковых ингибиторов содержит 60-70 аминокислотных остатков. Наряду с ингибиторами широкого спектра действия, такими, как альфа-2 макроглобулин, большая часть ингибиторов проявляет определенную групповую специфичность. Особенно распространены ингибиторы сериновых протеиназ. Их предложено классифицировать, как минимум, на 10 семейств. Сюда входят ингибиторы семейства панкреатического трипсинового ингибитора Куница, семейства панкреатического секреторного ингибитора (Казаля).

Семейство ингибиторов Казаля принадлежит к семейству ингибиторов I1, клан IA по классификации публичной базы данных MEROPS [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Ингибиторы Казаля воздействуют на сериновые пептидазы семейства S1, например на трипсин и эластазу. Ингибиторы Казаля в основном встречаются у многоклеточных животных, типичные представители семейства - овомукоид птиц, ингибитор акрозина и ингибитор эластазы. Известные ингибиторы этого семейства включают от одного до семи "доменов Казаля" или "повторов Казаля" [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Структура домена Казаля включает значительную долю несвернутой полипептидной цепи, две короткие альфа-спирали и один бета-слой, состоящий из трех антипараллельных цепей [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984)]. В установлении прямого межмолекулярного контакта домена Казаля и ингибируемого фермента вовлечено 11 аминокислотных остатков, при этом 8 из них являются гипервариабельными [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Варьирование аминокислот, участвующих в образовании контактов с ингибируемым ферментом, изменяет как константу ингибирования, так и специфичность ингибитора [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v.21, p.2274-84 (1982)].

Известен домен Казаля в составе белка инфестин из желудка кровососущего клопа Triatoma infestans, специфично блокирующий активированный фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана, фXIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. Домен, блокирующий фХIIa, имеет порядковый номер 4, остальные домены Казаля в составе инфестина специфически ингибируют другие факторы свертывания крови. Аминокислотная последовательность инфестина и границы доменов приведены в публичной базе данных UniProt (http://www.uniprot.org/), номер записи Q95P16. Для изолированного рекомбинантного домена 4 инфестина был получен кристалл комплекса с фХIIa [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p.2051-3 (2004)] и определена пространственная структура комплекса.

Свойство инфестина-4 ингибировать фХIIa делает его перспективным ингибитором контактной активации свертывания крови для применения в гемостазиологии, в том числе, в качестве лекарственного препарата для лечения и профилактики тромбозов и других заболеваний, связанных с гиперкоагуляционным состоянием системы свертывания крови. Из источника [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, р.512-6 (2004)] известна способность инфестина-4 ингибировать другой фактор системы свертывания, фХа, с константой ингибирования 53 нМ. Данное неспецифическое действие серьезно ограничивает возможность применения инфестина-4, поскольку фХа является одним из главных ферментов каскада свертывания. Ингибирование данного фактора может приводить к серьезным гемостатическим осложнениям, например кровотечениям [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann С, Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - Periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; 32(4):287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? // Thromb Res. Suppl 1:S41-3 (2012)].

Известны два метода получения рекомбинантного инфестина-4: в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris с дополнительным С-концевым пептидом и в составе слитого белка с сывороточным альбумином человека. Оба метода описаны в работе [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510-7 (2010)]. Продуктивность дрожжевой системы экспрессии инфестина-4 составляет 4 мг/л культуры, продуктивность системы экспрессии слитого белка альбумина и инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих неизвестна.

Указанные системы экспрессии инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих не могут быть использованы из-за высокой стоимости культивирования, а известная система экспрессии инфестина-4 в дрожжах обладает слишком низкой продуктивностью. При этом указанные системы экспрессии инфестина-4 не могут быть использованы из-за неспецифического ингибирования фХа продуцируемым белком. Известен способ получения целевых белков в активной и растворимой форме с высокой продуктивностью (патент US 5270181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, выдан 14.12.1993), который заключается в экспрессии целевого гетерологического белка, слитого с белком тиоредоксином или тиоредоксинподобным белком, в клетках хозяина. Однако описанный способ получения целевого белка не предполагает изменения функциональной активности целевого белка при экспрессии в виде слитого белка с тиоредоксином.

Краткое изложение изобретения

Технический результат, который может быть получен при реализации данного изобретения, заключается в эффективном и специфичном блокировании контактной активации свертывания за счет ингибирования фактора ХIIa и отсутствия ингибирования фактора Ха с упрощенной технологией получения белка, обеспечивающего указанную специфичность.

Указанный технический результат обеспечивается за счет получения слитого белка, включающего тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, обладающего повышенной специфичностью ингибирования фХIIa и имеющего пониженную активность ингибирования фХа по сравнению с нативным инфестином-4.

А также за счет получения экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей упомянутый слитый белок и находящейся под контролем промотера, функционирующего в бактериальной клетке.

А также за счет получения бактерии-продуцента упомянутого слитого белка, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной указанной плазмидной ДНК.

А также за счет создания способа получения упомянутого слитого белка, включающего культивирование упомянутой бактерии в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку указанного слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии.

Существо заявляемого решения

В основе заявляемого решения лежат разработанные авторами, в частности, плазмидная ДНК pET32a-Inf4 длиной 6106 п.о., кодирующая расщепляемый слитый белок, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера, линкерный участок, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и расположенный на С-конце молекулы полипептид домена 4 инфестина Т. Infestans. Открытая рамка считывания указанного домена инфестина содержит оптимальные для E.coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие белка-партнера обеспечивает поддержание слитого белка в растворимой форме в цитоплазме E.coli, правильное замыкание дисульфидных связей, позволяет проводить очистку слитого белка с помощью металлохелатного сорбента, что приводит к значительному увеличению выхода очищенного слитого белка, а также упрощению процедур выделения и очистки продукта.

В процессе получения указанного белка авторами неожиданно было установлено, что инфестин-4 в бактериях E.coli в форме белка-предшественника или слитого белка с тиоредоксином существенно увеличивает специфичность целевого белка по отношению к фХIIa, понижая активность ингибирования фXa, а также может быть достигнута высокая продуктивность системы экспрессии инфестина-4.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans в составе слитого белка, включающего последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий, в свою очередь, тиоредоксин I E.coli, олигогистидиновые кластеры, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и домен 4 инфестина T.infestans. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в Е.coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей слитый белок и в особенности рекомбинантный домен 4 инфестина Т.infestans, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в генах Е.coli кодонами. Последовательность гена Trx-Inf4, кодирующего домен 4 инфестина Т.infestans в составе слитого белка согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность слитого белка, включающего домен 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность интактного рекомбинантного домена 4 инфестина Т.infestans представляет собой последовательность под номером SEQ ID NO: 2 без 182 первых аминокислот (т.е. аминокислоты 183 - 238).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего слитый белок, включающий домен 4 инфестина Т.infestans, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ингибитора фактора ХIIа, определяются по его способности ингибировать свертывание крови, инициированное по "внутреннему" пути. Так, например, активность домена 4 инфестина Triatoma infestans можно детектировать в коагулометрическом тесте "каолиновое время", как описано в Примере 6. Считается, что вариант белка обладает свойствами домена 4 инфестина Т.infestans при условии, что указанный вариант увеличивает время свертывания плазмы крови не менее чем на 30% при концентрации не выше чем 5 мкМ.

Термин «специфичность ингибирования фХIIа» означает свойства ингибитора фХIIa, заключающиеся в ингибировании фХIIa с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ или ниже) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы XIa, IXa, Ха, IIa (он же тромбин), и VIIa. Нативный инфестин-4 ингибирует фХIIa с константой 0,1 нМ, при этом белок ингибирует фХa с константой 53 нМ. Слитый белок тиоредоксина и инфестина-4 обладает такой же константой ингибирования фХIIa, как и нативный ингибитор, но константа ингибирования фХa составляет 2,5 мкМ, т.е. в 50 раз выше. Таким образом, полученный слитый белок обладает повышенной специфичностью к фХIIa по сравнению с нативным белком.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, содержащий домен 4 инфестина Т.Infestans и включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера (6 и 10 гистидинов), 2 последовательности узнавания специфической эндопротеиназой (DDDDK) и расположенный на С-конце слитого белка непосредственно за последним сайтом узнавания DDDDK домен 4 инфестина Т.infestans, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, рЕТ32а, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.

Одним из вариантов реализации настоящего изобретения является плазмида pET32a-Inf4 размером 6106 п.о., которая состоит из:

1) фрагмента HindIII-NheI (1-204) длиной 204 п.о., содержащего участок, кодирующий домен 4 инфестина Т.infestans и слитую с ним в рамке последовательность FLAG-эпитопа, включающую в себя сайт узнавания энтерокиназы

2) фрагмента NheI-NcoI (205-245)-длиной 41 п.о., содержащего участок, кодирующий пептид SAGHHHHHHHHHHG, содержащий декагистидиновый кластер

3) фрагмента NcoI-HindIII (246-6106) вектора рЕТ32а(+) длиной 5861 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона; последовательность, кодирующую тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновый таг и сайт расщепления энтерокиназой. Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919).

Структура плазмиды pET32a-Inf4 приведена на Фиг.3 и в SEQ ID 3.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию рода Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии слитого белка, содержащего домен 4 инфестина Т.infestans, может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой необходима для экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac А. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) //Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» также означает клетку, которая способна накапливать слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans в количестве не менее чем 2 мг/л культуры, более предпочтительно, не менее чем 20 мг/л культуры. Указанный слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans накапливается в указанной клетке предпочтительно в цитоплазме в растворимой форме.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки, образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, ампициллина 50 мкг/мл.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB+) λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой pET32a-Inf4 приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, который обеспечивает синтез рекомбинантного слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) Т.infestans в количестве более 5% от суммарного содержания белка клеток.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4 кодирует слитый белок Trx-Inf4, состоящий из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера (тиоредоксина E.coli), содержащего сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой домена 4 инфестина Т.infestans.

Способ получения слитого белка Trx-Inf4, состоящего из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера тиоредоксина I E.coli согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, индукцию промотора гена слитого белка Trx-Inf4, сбор биомассы клеток, их разрушение, отделение нерастворимых белков и дебриса, очистку слитого белка Trx-Inf4 металлохелатной хроматографией в нативных условиях и последующей анионообменной хроматографией.

Особенности плазмиды и результаты практического применения приведены на следующих фигурах.

Краткое описание фигур:

На Фиг.1 показана схема сборки синтетического гена домена 4 инфестина Triatoma infestans из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид p10E- Inf4 и pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения:

Inf4 - домен 4 инфестина Triatoma infestans, соответствующий домену 4 типа Казаль. В скобках указаны первая и последняя аминокислоты фрагментов. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК.

На Фиг.2 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322» - точка начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «fl ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; Inf4 - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида домена 4 инфестина Triatoma infestans; "FLAG" - эпитоп моноклонального антитела FLAG; "EK-PRO" - сайт узнавания энтерокиназы, "10Е tag" - отделяемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер, эпитоп FLAG и сайт узнавания энтерокиназы; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фиг.3 показана карта экспрессионной плазмиды pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322 origin» - область начала репликации плазмиды pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «BIa (AmpR)» - последовательность, обеспечивающую устойчивость бактерий к ампициллину; «Т7 promoter» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 terminator» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «Trx-Inf4» - ОРС слитого белка; «Inf4» - ОРС домена 4 инфестина Triatoma infestans; «Trx» - ОРС тиоредоксина I E.coli; «10xHis» - декагистидиновый кластер; «6xHis» - гексагистидиновый кластер; «ЕК-PRO» - участок, кодирующий сайт узнавания энтерокиназой; «FLAG» - эпитоп моноклонального антитела FLAG; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фиг.4 показана электрофореграмма тотального белка из клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4 (4 колонии) и контрольного штамма BL21 [DE3]/pET32a при индукции ИПТГ.

Индукция 1 мМ ИПТГ, 30°C; 0,4 и 16 ч. Обозначения: Inf cl. - соответствующая колония штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, Trx (К-) - колония контрольного штамма BL21[DE3]/pET32a, 0h - 16h - время индукции, ч; М - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка и контрольного белка-партнера указано стрелками. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Вычисленная продуктивность для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4: 20-40 мг/л, доля целевого белка: >5% (по денситометрии геля).

На Фиг.5 приведены электрофореграммы белковых фракций, полученных при выделении и одностадийной хроматографической очистке слитого белка Trx-Inf4 и контрольного белка-партнера Trx.

Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «IP» - тотальный белок после индукции, «IB» - нерастворимые белки, «SO» - растворимые белки, «7R» - осадок после термокоагуляции, «7S» - супернатант после термокоагуляции, «AS» - супернатант при осаждении сульфатом аммония, «IM» - перерастворенный осадок после осаждения сульфатом аммония, «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии, «100», «200», «500» - фракции элюатов с металлохелатной колонки соответствующими концентрациями имидазола, «Е» - фракция элюции ЭДТА-Na, «NA» - фракция элюции при регенерации колонки NaOH. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка Trx-Inf4 указано стрелкой.

На Фиг.6 показана электрофореграмма белковых фракций, полученных при градиентной элюции слитого белка Trx-Inf4 с сорбента Capto Q. Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «200» - полуочищенный Trx-Inf4 перед нанесением; «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии; «F1»-«F8» - соответствующие собранные фракции элюата. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка указано стрелкой.

На Фиг.7 показана хроматограмма ОФ-ВЭЖХ анализа очищенного слитого белка Trx-Inf4 и результаты интеграции пиков. Канал детекции 280 нм, чистота белка 99,06%.

На Фиг.8 показана электрофореграмма дорожки с очищенным Trx-Inf4 и результаты ее денситометрии. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим, чистота белка 99,48%.

На Фиг.9 приведен график зависимости времени свертывания плазмы крови в "каолиновом тесте" от концентрации в плазме Trx-Inf4.

На Фиг.10 приведен график зависимости активности фХа, определяемой по скорости расщепления хромогенного субстрата, от концентрации Trx-Inf4.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие, не ограничивающие настоящее изобретение, примеры.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-Inf4

Для аминокислотной последовательности, включающей 56 аминокислот домена 4 инфестина Triatoma infestans (аминокислоты 167-222 из записи Q95P16 публичной базы данных UniprotKB, расположенной по адресу http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) с добавленным аминокислотным N-концевым пептидом (SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в Е.coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов. В последовательность ДНК также были включены стоп-кодоны и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:5. Физический фрагмент EKsite-Kaz-4 (SEQ ID NO:5) собирали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из перекрывающихся олигонуклеотидных праймеров AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ-5R, приведенных в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, соответственно.

ПЦР проводили на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Препаративные реакции проводили в объеме 50 мкл. Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пмоль каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация 94°C, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 62°C, 30 сек, достройка 72°C, 120 сек; 1 цикл - достройка 72°C, 10 мин. Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего дотировали в Т-вектор pAL-TA («Евроген», РФ) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°C на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл питательного бульона LB и инкубировали при 37°C 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара и помещали в термостат на 37°C 18 часов. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды: M13dir (SEQ ID NO:11) и M13rev (SEQ ID NO:12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона LB и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность конструкции верифицировали методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и SP6 (SEQ ID NO:14).

Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК p10E-Inf4.

Реципиентную плазмиду p10E рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°C в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°C в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Реакцию лигирования очищенного фрагмента NheIHindIII плазмиды pAL-Inf4, соответствующего минигену домена 4 инфестина и реципиентной плазмиды, проводили, как описано в примере 1. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5 альфа, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и T7term (SEQ ID NO:15).

Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT с канамицином, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США). При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-Inf4 определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom и T7term. В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена домена 4 инфестина. Карта экспрессионной конструкции приведена на Фиг.2 и в SEQ ID NO:16, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:17.

Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pET32a-Inf4.

Реципиентную плазмиду рЕТ32а (+) (Novagen, США) рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и HindIII, как описано в примере 2. Донорную плазмиду p10E-Inf4 рестрицировали NcoI и HindIII и очищали из 1,5% агарозного геля набором «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США). Выделенные фрагменты лигировали, трансформировали лигаты в Е.coli штамма DH5-альфа и производили селекцию клонов, как описано в примере 2. Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT-Amp, выделяли плазмидную ДНК набором «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» и определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7term. Карта конструкции приведена на Фиг.3, последовательность в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность целевого белка приведена в SEQ ID NO:2.

Пример 4. Получение штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4 и Е.coli BL21[DE3]/pET32a-Inf4, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белка.

Для получения штаммов-продуцентов слитого белка тиоредоксина E.coli, линкерного участка и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) и белка-предшественника 10Е-Inf4 конструкции, полученные по примерам 2 и 3, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) (с генотипом F- oтpT hsdSB (r-m-) gal dcm (DE3)).

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4-продуцента белка-предшественника домена 4 инфестина Triatoma infestans в составе клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой p10E-Inf4.

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4-продуцента слитого белка Trx-Inf4 клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET32a-Inf4.

Аналогично получали контрольный штамм Е.coli BL21[DE3]/pET32a-продуцент тиоредоксина I E.coli (Trx), трансформируя клетки Е.coli BL21[DE3] плазмидой рЕТ32а.

Трансформанты Е.coli высевали на агаризованную среду 2xYT с добавлением глюкозы до 2% и селективных антибиотиков - 30 мкг/мл канамицина для BL21[DE3]/p10E-Inf4 или 50 мкг/мл ампициллина для BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и BL21[DE3]/pET32a; проводили индукцию экспрессии целевых белков для четырех случайно выбранных колоний с типичным фенотипом. Колонии подращивали в питательном бульоне с добавлением соответствующего антибиотика и раствора глюкозы до 2% в течение 14 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 1-1,5 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом и культивировали еще 16 ч, отобрав аликвоты суспензии после 4 ч индукции. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4 приведены на Фиг.4. Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетным значениям. По данным гель-электрофореза белковых фракций (Фиг.5) целевой белок Trx-Inf4 и контрольный белок-партнер Trx практически полностью были локализованы в растворимой фракции белков. В случае штамма BL21[DE3]/p10E-Inf4 электрофоретический анализ показал отсутствие видимого продукта экспрессии.

Пример 5. Выделение и очистка слитого белка Trx-Inf4

Штамм-продуцент BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и контрольный штамм BL21[DE3]/pET32a высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Одну отдельную колонию каждого штамма переносили в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы и растили на качалке 14 часов при +37°C. Содержимым инокулировали 2 колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific broth, дополнительно содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 ч при +30°C. Осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавили лизоцим до 0,1 мг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Проводили термокоагуляцию примесных белков в полученном осветленном лизате инкубацией при температуре +70°C (максимально возможная для Trx-Inf4) в течение 10 мин. Отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Осаждали целевые белки добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония, выдерживали 30 мин на льду, центрифугировали 20 мин на 5000 об/мин, супернатант отбрасывали. Осадок суспендировали в 10 мл раствора В (50 мM Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,4), отделяли денатурированные белки центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. Супернатант фильтровали через дисковый фильтр с порами 0,45 мкм и наносили на 1 мл колонку с сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow («GE Healthcare», США), содержащим хелатированные ионы никеля, и уравновешенным раствором В. Нанесение вели на скорости 0,5 мл/мин. Проскок собирали для дальнейшего анализа. Проводили ступенчатую элюцию адсорбированных белков раствором В с концентрацией имидазола 100, 200, 500 мМ на скорости потока 1 мл/мин. Удаляли иммобилизованные ионы никеля раствором B+50 мМ ЭДТА-Na, рН 8,0. Регенерировали колонку 10 мл раствора 0,1 М гидроксида натрия. Элюат при промывке гидроксидом натрия немедленно нейтрализовали 1,2 моль-эквивалента уксусной кислоты. Аликвоты всех полученных белковых фракций анализировали при помощи ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (Фиг.5).

Окончательную очистку целевого белка проводили при помощи анионообменной хроматографии с использованием декстранового сорбента Capto Q («GE Healthcare», США). Колонку объемом 1 мл уравновешивали раствором A (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,4), промывали 5 объемами раствора В (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН=7,4) и повторно промывали 5 объемами раствора А. Раствор полуочищенного Trx-Inf4 после металлохелатной хроматографии разбавляли водой, очищенной в 10 раз, и наносили на уравновешенную колонку Capto Q на скорости 3 мл/мин. Колонку промывали 10 объемами раствора A и проводили градиентную элюцию от 0 до 100% раствора B за 20 мин при скорости потока 1 мл/мин. Собирали фракции, содержащие белок по данным УФ-детектора, и анализировали их при помощи ДСН-ПААГ (Фиг.6).

Фракции, содержащие только целевой белок, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией при помощи одноразовой ячейки Vivaspin 6 PES 5 kDa (Sartorius Stedim, Германия) до конечного объема 1,5 мл. Концентрированный раствор переносили в микропробирку, добавляли консервант тимеросаль (Sigma, США) до конечной концентрации 0,02%, разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на хранение на минус 20°C.

Пример 6. Анализ очищенного слитого белка Trx-Inf4

В полученном растворе очищенного Trx-Inf4 измеряли концентрацию основного вещества и долю полипептидных примесей при помощи обращеннофазовой хроматографии. Использовали колонку SOURCE RPC 4.6 ST («GE Healthcare», США) подвижные фазы A - 5% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде; B - 80% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде, программа градиента - 5 мин 100% раствора A, от 0 до 100% раствора B за 40 мин, 3 мин 100% раствора B, от 100 до 0% раствора B за 1 мин, 3 мин 100% раствора A, скорость 1 мл/мин, температура колонки +40°C. Объем вводимой пробы - 15 мкл, пробоподготовка - добавление ацетонитрила до 10% и труфторуксусной кислоты до 1%, разбавление пробы 1,11 раза. Детекцию вели на длинах волн 280 и 214 нм.

Чистота основного вещества была сходной при анализе данных обоих каналов детекции и составила более 98%. Хроматограмма для канала 280 нм приведена на Фиг.7.

При обработке биомассы, полученной из 500 мл бактериальной суспензии, было получено 24 мг очищенного белка Trx-Inf4 (по данным ОФ-ВЭЖХ, в предположении 80% элюции основного вещества при анализе), что соответствует продуктивности разработанной системы 48 мг слитого белка с одного литра бактериальной культуры при выращивании в колбах.

Для выявления родственных примесей, которые могли коэлюировать с пиком основного вещества при ОФ-ВЭЖХ, провели электрофоретический анализ полученного очищенного Trx-Inf4 в восстанавливающих условиях с последующей денситометрией электрофореграммы. Была детектирована одна полоса примеси с объемом денситометрированного пика около 0,5% от объема денситометрированного пика основного вещества (Фиг.8).

Функциональную активность Trx-Inf4, т.е. способность замедлять свертывание плазмы крови по "внутреннему" пути вследствие ингибирования фактора ХIIa, исследовали при помощи "каолинового теста". Использовали суспензию каолина и лиофилизованную нормальную плазму производства НПО Ренам (Россия); измерения проводили на полуавтоматическом коагулометре ThromboScreen 400 (Pacific Hemostasis, США) по инструкциям производителей прибора и реагента. Исследуемый образец Trx-Inf4 вносили в плазму за 1 мин до внесения суспензии каолина в объеме не более 10 мкл. При внесении Trx-Inf4 в плазму в конечной концентрации 0,4 мг/мл (7,5 мкМ) время свертывания составило 192 с, для контрольного белка Trx в конечной концентрации 0,4 мг/мл - 65 с, для интактной плазмы - 57 с. Таким образом, было установлено, что слитый белок Trx-Inf4 в высокой концентрации способен замедлить время свертывания плазмы в каолиновом тесте в 3 раза. Для установления практически применимой при коагулометрической диагностике рабочей концентрации Trx-Inf4 провели измерения каолинового времени для различных концентраций внесенного Trx-Inf4 (Фиг.9). Время свертывания плазмы быстро увеличивается при возрастании концентрации Trx-Inf4 от 150 до 300 нМ и при дальнейшем увеличении концентрации ингибитора меняется слабо, что соответствует полному блокированию активированного на поверхности частиц каолина фактора XII и последующему неспецифическому ингибированию других трипсиноподобных факторов свертывания крови.

Пример 7. Определение анти-фХа активности белка Trx-Inf4.

Для определения ингибирующей активности Trx-Inf4 по отношению к фактору Ха (фХа) использовали реакцию расщепления фХа (Hematologic Technologies Inc., США) специфичного хромогенного субстрата S-2765 (Chromogenix, Швеция). В ячейки планшета последовательно помещали 50 мкл раствора фХа (финальная концентрация 0,5 нМ) в буфере С (50 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl и 0,5% БСА, рН 8,3), 50 мкл раствора Trx-Inf4 в буфере C или растворителя (0,3 М Hepes, рН 7,4). Перед началом реакции смесь инкубировали 15 минут при 37°C, после чего добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата (финальная концентрация S-2765 500 мкМ). Начальную скорость гидролиза субстрата измеряли спектрофотометрически на длине волны 405 нм. Определяли процент ингибирования скорости гидролиза в присутствии различных концентраций Trx-Inf4 (относительно скорости в пробе без ингибитора) и величину концентрации Trx-Inf4, снижающую скорость гидролиза на 50% (IC50). IC50 составило 7,5 мкМ. Константа ингибирования KI по отношению к фХа может быть вычислена по уравнению Ченга-Прусоффа (KI = IC50/(1+S/Km)), в котором S - концентрация субстрата, Km - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к фХа, составляющая 250 мкМ. KI для Trx-Inf4 по отношению к фХа составила 2,5 мкМ, т.е. примерно в 50 раз выше, чем известно для нативного инфестина-4, и примерно в 10 раз выше рабочей концентрации, практически применимой при коагулометрической диагностике. Таким образом, слитый белок Trx-Inf4, по сравнению с нативным инфестином-4, является более специфичным ингибитором фХIIа.

Приведенные результаты показали, что включение в последовательность получаемого полипептида N-концевого белка-партнера тиоредоксина в сочетании с синтетическим геном домена 4 инфестина, кодируемого оптимальными для Е.coli кодонами, сохраняет функциональные свойства домена 4 инфестина, заключающиеся в ингибировании фХIIa и контактной активации свертывания, и значительно увеличивает уровень экспрессии, обеспечивает корректный фолдинг гетерологичного белкового домена в бактериальной цитоплазме.

Преимуществом данного изобретения является повышение специфичности полученного ингибитора Trx-Inf4 к фХIIa по сравнению с нативным инфестином-4, которая заключается в том, что Trx-Inf4 ингибирует фХа в 50 раз слабее. Это позволяет предполагать, что при применении слитого белка тиоредоксина и инфестина-4 в диапазоне рабочих концентраций, при которых эффективно ингибируется контактная активация, не будет проявляться нежелательный эффект неспецифического ингибирования других протеаз свертывания, кроме фХIIа.

Преимущества предлагаемого штамма E.coli BL21[DE3] заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OтpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного полипептида и контаминации выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli. Встроенный в геном штамма-реципиента ген РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора при использовании Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмидах приводит к быстрой и эффективной продукции белка.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

1. Слитый белок для специфического ингибирования свертывания крови, включающий тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, характеризующийся последовательностью SEQ ID NO: 2, при этом он обладает повышенной специфичностью ингибирования фХIIа и имеет пониженную ингибирующую активность к фХа по сравнению с нативным инфестином-4.

2. Экспрессионная плазмидная ДНК,
содержащая последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую слитый белок по п.1 и находящуюся под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке, преимущественно промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, причем она содержит один или несколько из указанных участков: область начала репликации плазмиды, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, участок терминации транскрипции, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона, последовательность, кодирующую тиоредоксин I E.coli, последовательность, кодирующую полигистидиновый таг.

3. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидной ДНК по п.2, для продуцирования слитого белка по п.1.

4. Способ получения слитого белка по п.1, включающий культивирование бактерий по п.3 в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к питательной среде для культивирования легионелл. Питательная среда для культивирования легионелл, в состав которой входит: ферментативный гидролизат сои бобов, калий фосфорнокислый 1 - замещенный, калий фосфорнокислый 2 - замещенный - 3 - водный, L-цистеина гидрохлорид, уголь активный древесный, агар микробиологический и ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, вода дистиллированная, взятые в определенном соотношении.
Изобретения относятся к биохимии. Предложен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты рекомбинантных штаммов бактерий Escherichia coli, являющихся продуцентами янтарной кислоты и содержащих ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.

Изобретение относится к области биохимии и микробиологии и касается биологически активного пептида. Охарактеризованный пептид хоминин KLP-1, продуцируется штаммом Staphylococcus hominis KLP-1 и проявляет антибактериальную активность против представителей следующих родов бактерий: Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Streptococcus, имеет молекулярную массу 2985 Да, чувствителен к протеазам, обладает высокой термостабильностью и имеет следующий аминокислотный: 51,1% катионных и 31,7% гидрофобных аминокислот, а также специфическую аминокислоту - лантионин.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для разработки антитоксических препаратов и кормовых добавок для профилактики микотоксикозов у сельскохозяйственных животных и птицы.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для регулирования проницаемости метан-продуцирующей клетки. Получают полипептид, который способен проникать в метан-продуцирующую клетку и повышать ее проницаемость, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:117, 118 или 119 или по меньшей мере 90% идентичностью к указанной последовательности или по меньшей мере 15 последовательно расположенными аминокислотами указанной последовательности.

Изобретение касается способа определения генотипов золотистого стафилококка. Представленный способ включает получение чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде с последующим выделением и амплификацией ДНК возбудителя с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и с детекцией результатов методом электрофореза в агарозном геле.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ДЗИВ-12 обладает высокими биохимическими и технологическими свойствами.
Изобретение относится к биохимии. Предложен способ очистки воды и мерзлотной почвы от нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и готовят из него суспензию, в которую вносят в мерзлотную почву и водную среду.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения цитохрома С. Способ предусматривает обезжиривание сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента биологически активного флагеллина. Охарактеризованный штамм получен трансформацией культуры клеток E.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения наноструктурированного материала на основе рекомбинантных жгутиков архей H.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложен вариант полипептида Fc человеческого IgG с заменами 259I и 308F, где нумерация положений приведена согласно индексу EU Kabat.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона альфа-2 человека. Гибридные белки GFN80 и GFN100 конструируют на основе рекомбинантныго интерферона альфа-2 человека, слитого с N-конца с аминокислотной последовательностью полипептида S(G4S)16 или S(G4S)20 соответственно.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен выделенный химерный полинуклеотид для усиления продуцирования представляющего интерес гетерологичного белка, содержащий полинуклеотидную последовательность промотора SigA или SigH, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим белок YmaH, причем химерный полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 13.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пищевой грибной биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен очищенный препарат рекомбинантного фермента N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза (GALNS) человека, где указанный фермент включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную аминокислотам 27-522 SEQ ID NO:4, пригодный для лечения субъекта, страдающего лизосомальной болезнью накопления, которая ассоциирована с GALNS, где: (a) указанный препарат фермента GALNS имеет чистоту, по меньшей мере, приблизительно 95% при определении окрашиванием кумасси синим при SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях; и (b) остаток цистеина в положении 79, по меньшей мере, приблизительно в 50% молекул фермента GALNS в указанном препарате фермента GALNS преобразован в Cα-формилглицин (FGly); где указанный фермент GALNS является гликозилированным N-связанным гликозилированием по остаткам аспарагина в положениях 204 и 423, где, по меньшей мере, приблизительно 50% олигоманнозных цепей, присоединенных к остатку аспарагина в положении 204, являются бис-фосфорилированными.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933.

Изобретение относится к способу получения ферментированного натурального продукта. Способ предусматривает получение первого ферментного экстракта в главном ферментере путем ферментирования сырья, выбранного из фруктов, овощей, бобовых, грибов, орехов, пшеницы, риса, трав, корней, листьев, цветов, по отдельности или в комбинации в присутствии микроорганизмов в количестве от 106 до 1012 клеток/мл, предпочтительно от 108 до 1010 клеток/мл.
Наверх