Способы диагностирования дегенеративного поражения сустава


 


Владельцы патента RU 2603484:

НЕСТЕК С.А. (CH)

Группа изобретений относится к медицине, а именно к диагностике артрита или остеоартрита. Способ диагностики артрита или остеоартрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, который заключается в: отборе пробы слюны животного; определении количества по меньшей мере трех диагностических агентов, выбранных из группы, состоящей из гамма-интерферона (IFN-γ), индуцируемого интерфероном протеина-10 (IP-10), интерлейкина-2 (IL-2) и совокупного протеина слюны (TSP) в пробе слюны; сопоставлении количества диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от сопоставимого контрольного животного, которое не страдает от дегенеративного поражения сустава; и диагностировании остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, если количество IP-10 и/или TSP и их сочетание с Il-2 и IFN-γ в пробе слюны от этого животного больше, чем количество таких же диагностических агентов, обнаруженных в пробе слюны от контрольного животного того же вида (варианты). Вышеописанные способы позволяют эффективно и быстро диагностировать повреждения сустава. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится, главным образом, к способам диагностики заболевания и конкретно к способам диагностики дегенеративного поражения сустава.

Уровень техники

Способы диагностирования состояний, относящихся к суставам, известны из уровня техники. В заявке WO 28049225 A1 раскрыты методы прогнозирования остеоартрита путем определения клеточной локализации транскрипционного фактора 1 гипофизарного гомеобокса (pitx-1) репрессорного белка или комплекса, например, прохибитина или прохибитона в пробе, например пробе суставных хондроцитов. В заявке US 20070248986 A1 раскрыты методы прогнозирования вероятности развития ревматоидного артрита для пациентов с недавним проявлением недифференцированного артрита путем определения ряда значений клинических параметров и предсказанного риска развития ревматоидного артрита путем корреляции значений параметров с заданными значениями рисков, которые связаны с диапазоном значений параметров, например уровнем в сыворотке С-реактивного белка, ревматоидных факторов, анти-ССР антител, возраста, пола, локализации заболевания суставов, длительности утренней ригидности, и числа болезненных и/или опухших суставов. В заявке US 7005274 описаны способы диагностики для раннего обнаружения риска развития артритного расстройства у людей и скрининг-анализ терапевтических агентов, применяемых при лечении артритных расстройств путем сопоставления содержания одного или нескольких индикаторов измененной митохондриальной функции, например ферментов, таких как митохондриальные ферменты, факторы биосинтеза АТФ, митохондриальная масса, число митохондрий, содержание митохондриальной ДНК, клеточные реакции на повышенное содержание внутриклеточного кальция и апоптогенов, и образование свободных радикалов. В заявке US 20040242987 A1 описаны способы прогнозирования заболевания костей или суставов, влияющего на костно-мышечную систему (например, остеопороз) путем применения микро- и макроструктурных или биомеханических параметров, полученных из изображений сустава, и анализа двух указанных параметров, например макро-морфологических параметров и биомеханических параметров. Другие известные способы включают объективное обследование, бесконтрастную пленочную радиографию, сканограммы аксиальной компьютерной томографии (CAT), сканограммы магнитной резонансной визуализации (MRI), контрастную радиографию и артроскопию.

Диагностика состояний суставов, таких как дегенеративные поражения суставов у животных, с использованием объективного обследования и бесконтрастной пленочной радиографии, является обычным. В частности, указанные способы представляют собой базовый инструмент для диагностики остеоартрита у различных животных, таких как собаки. Однако у пораженных животных часто не проявляются очевидная хромота или другие симптомы, указывающие на дегенеративное поражение сустава. К сожалению, это означает, что наблюдаемые клинические признаки являются недостаточными для обоснования предположительного диагноза дегенеративного поражения сустава, например остеоартрита. Кроме того, бесконтрастная пленочная радиография, хотя и представляет собой наиболее часто применяемую технологию обследования, регистрирует костные изменения, но часто не обнаруживает изменения в мягких тканях, таких как суставная капсула, и, таким образом, затрудняется стандартный диагноз. Аналогично, CAT и MRI сканограммы являются дорогостоящими и часто имеют ограниченную доступность. Контрастная радиография и артроскопия увеличивают степень инвазивности. Для некоторых животных, например собак, в указанных дополнительных способах воздействия всегда требуется некоторая форма ограничения, например обезболивание, что увеличивает затраты, сложность и риски. С учетом указанных ограничений известных способов дегенеративное поражение сустава часто остается нераспознанным. Следовательно, существует потребность в новых способах диагностики дегенеративного поражения сустава у животных.

Раскрытие изобретения

Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка способов диагностики дегенеративного поражения сустава у животных.

Эта и другие цели достигнуты с использованием способов диагностики дегенеративного поражения сустава у животных, которые включают отбор проб слюны у животного; определение количества одного диагностического агента, выбранного из группы, состоящей из интерферона IFNγ, IP-10, IL-2 и TSP в пробе слюны; сопоставление количества диагностического агента, найденного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, найденным в пробе слюны от одного или нескольких сопоставимых контрольных животных, которые не страдают от дегенеративного поражения сустава; и диагностирование, что животное восприимчиво или страдает от дегенеративного поражения сустава, если количество диагностического агента в пробе слюны от животного больше, чем количество такого же диагностического агента, найденное в пробе слюны от одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут вполне очевидны специалистам в этой области техники.

Осуществление изобретения

Определения

Термин "животное" означает любое животное, которое восприимчиво или страдает от дегенеративного поражения сустава, включая человека, птицу, корову, собаку, лошадь, кошку, козу, волка, мышь, овцу или свинью.

Термин "сопоставимое контрольное животное" означает животное того же вида и типа или индивидуальное животное, оцениваемые в два различных момента времени.

Термин "сустав" означает соединение между двумя или несколькими соседними частями костной системы животного, или кости, или хряща.

Термин "дегенеративное поражение сустава" означает заболевание или другое состояние, вызванное воспалением, разрушением с возможной потерей хряща сустава. Дегенеративное поражение сустава также называется остеоартритом или дегенеративным артритом.

Термин "домашнее животное" означает одомашненное животное, такое как собаки, кошки, птицы, кролики, морские свинки, хорьки, хомяки, мыши, песчанки, прогулочные лошади, коровы, козы, овцы, ослы, свиньи, и более экзотические виды, которые люди содержат для компании, развлечения, психологической поддержки, экстравертной демонстрации, и всех других функций, которые люди хотят разделить с животными других видов.

Используемые в изобретении диапазоны применяются здесь условно, для того чтобы избежать наличия перечня и описания всякого и любого значения в указанном диапазоне. Может быть выбрано любое подходящее значение внутри диапазона, где это необходимо, как верхнее значение, нижнее значение или конечное значение ряда.

Используемая в изобретении форма единственного числа включает в себя и множественное число, и наоборот, если из контекста ясно не следует иное. Например, ссылка на "сустав" или "способ" включает в себя множественное число "суставы" или "способ." Аналогично, слова "содержат", "содержит" и "содержащий" следует истолковывать скорее как включающие в себя, чем исключающие. Подобным образом, все слова "включают", "включающий" и "или" следует истолковывать включительно, если из контекста ясно не запрещается такая конструкция.

Раскрытые в изобретении способы, композиции и другие достижения не ограничиваются конкретной методологией, протоколами и описанными реагентами, поскольку эти приемы могут изменяться, как могут признать специалисты в этой области техники. Кроме того, используемая в изобретении терминология предназначается только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначается для ограничения объема описания или притязаний.

Если не обусловлено другое, все технические и научные термины, специальные термины и сокращения, использованные в изобретении, имеют общепринятые значения, понятные специалистам в области техники настоящего изобретения, или в отраслях, где указанный термин используется. Хотя любые композиции, способы, промышленные изделия, или другие средства или материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в изобретении, могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения, предпочтительные композиции, способы, промышленные изделия, или другие средства или материалы, описаны в изобретении.

Все патенты, заявки на патенты, публикации, технические и/или научные статьи и другие ссылки, цитированные или рассматриваемые в изобретении, полностью включены в изобретение как ссылки, в степени, разрешенной законом. Рассмотрение указанных ссылок имеет целью простое обобщение уровня техники, достигнутого в этой области. Отсутствует признание факта, что любые такие патенты, заявки на патенты, публикации, или ссылки, или любые их части, представляют собой релевантные материалы или прототип. Авторы оставляют за собой право оспаривать точность и применимость любого утверждения в таких патентах, заявках на патенты, публикациях и других ссылках в качестве релевантных материалов или прототипа.

В одном аспекте, в настоящем изобретении разработаны способы диагностирования дегенеративного поражения сустава у животных. Указанные способы включают в себя: отбор проб слюны животного; определение количества одного диагностического агента, выбранного из группы, состоящей из гамма-интерферона (IFNγ), индуцируемого интерфероном протеина-10 (IP-10), интерлейкина-2 (IL-2) и совокупного протеина слюны (TSP) в пробе слюны; сопоставление количества диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от одного или нескольких сопоставимых контрольных животных, которые не страдают от дегенеративного поражения сустава; и диагностирование факта, что животное восприимчиво или страдает от дегенеративного поражения сустава, если количество диагностического агента в пробе слюны от этого животного больше, чем количество такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

Настоящее изобретение основано на открытии, что диагностические агенты изобретения присутствуют в слюне животного и что количество диагностического агента в слюне служит биохимическим индикатором для диагностики дегенеративного поражения сустава путем демонстрации или прогнозирования порога дегенеративного поражения сустава. Изобретение позволяет ветеринару и другим практикующим врачам проводить тестирование на указанные "биомаркеры" в слюне и определять, является ли животное восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава и существует ли потребность в дополнительном диагностировании или лечении. Когда установлена потребность в дополнительном диагностировании или лечении, затраты и риски указанного дополнительного диагностирования или лечения являются обоснованными.

В различных вариантах осуществления, у одного или нескольких сопоставимых контрольных животных, которые не являются животными, обследуемыми на дегенеративное поражение сустава, и которые определенно не страдают от дегенеративного поражения сустава, оценивается содержание одного или нескольких диагностических агентов, и результаты указанных оценок используются в качестве эталонного значения при сопоставлении с результатами для животных, обследуемыми на наличие одного или нескольких диагностических агентов. В предпочтительных вариантах осуществления, эталонное содержание диагностического агента определяется путем оценки многочисленных сопоставимых контрольных животных.

В другом аспекте, количество одного диагностического агента определяется у животного в различные моменты в течение жизни животного, причем результаты используются для определения, является ли животное восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава, например, если количество одного диагностического агента возрастает по мере старения животного, это животное может быть диагностировано как восприимчивое или страдающее от дегенеративного поражения сустава. В предпочтительных вариантах осуществления, животное обследуется периодически, с регистрацией результатов для диагностических агентов. Тогда, если следующая оценка демонстрирует, что количество одного или нескольких диагностических агентов увеличивается с момента последнего обследования (обследований), животное диагностируется как восприимчивое или страдающее от дегенеративного поражения сустава.

В одном варианте осуществления, определяют, что животное является восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава, если количество IFNγ в слюне обследуемого животного является в 1,2 раза больше количества IFNγ, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных. В различных вариантах осуществления, количество IFNγ у обследуемого животного составляет приблизительно от 1,2 до 20 раз больше количества IFNγ, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

В другом варианте осуществления, определяют, что животное является восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава, если количество IP-10 в слюне обследуемого животного является в 1,4 раза больше количества IP-10, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных. В различных вариантах осуществления, количество IP-10 у обследуемого животного составляет приблизительно от 1,4 до 20 раз больше количества IP-10, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

В дополнительном варианте осуществления, определяют, что животное является восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава, если количество IL-2 в слюне обследуемого животного является в 1,6 раза больше количества IL-2, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных. В различных вариантах осуществления, количество IL-2 у обследуемого животного составляет приблизительно от 1,6 до 20 раз больше количества IL-2, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

В другом варианте осуществления, определяют, что животное является восприимчивым или страдающим от дегенеративного поражения сустава, если количество TSP в слюне обследуемого животного является в 1,8 раза больше количества TSP, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных. В различных вариантах осуществления, количество TSP у обследуемого животного составляет приблизительно от 1,8 до 20 раз больше количества TSP, обнаруженного в слюне одного или нескольких сопоставимых контрольных животных.

Хотя использование одного из диагностических средств является достаточным для диагностирования дегенеративного поражения сустава, применение двух или более указанных диагностических агентов в изобретении является целесообразным и может быть предпочтительным во многих случаях. В одном варианте осуществления, диагноз основывается на двух диагностических агентах, в другом - используют три диагностических агента, в еще одном - все четыре диагностических агента. Диагностические агенты можно оценивать и использовать для диагноза в любых сочетаниях. В одном предпочтительном варианте осуществления, диагноз основывается на двух диагностических агентах, а именно на IFNγ и IP-10. В другом предпочтительном варианте осуществления, диагноз основывается на всех четырех диагностических агентах.

С использованием способов настоящего изобретения можно диагностировать любую поврежденную часть сустава. Типичные суставы включают (но не ограничиваются) скользящие суставы (Arthrodia), шарнирные суставы (Ginglymus), мыщелковые суставы (Condylarthrosis), седловидные суставы (Articulus sellaris), шаро-шарнирные суставы (Enarthrosis) и поворотные суставы (Trochoides). Конкретные суставы включают в себя (но не ограничиваются) коленный, локтевой, межфаланговый, пястно-фаланговый, запястный, запястно-фаланговый, сустав большого пальца руки, плечевой, тазобедренный, височно-нижнечелюстной и лучелоктевой суставы. Плечевой и тазобедренный суставы особенно восприимчивы к дегенеративному поражению сустава.

В различных вариантах осуществления, животное представляет собой человека или домашнее животное. Предпочтительно, домашнее животное означает собаку или кошку.

Способы сбора (отбора) слюны от животного известны специалистам в этой области техники, например с использованием игрушки или аналогичного устройства, с которым животное взаимодействует орально в виде шутливой игры, или просто используют тампон на стержне или аналогичное устройство для сбора пробы слюны. Одно такое устройство описано в предварительной заявке на патент США №61/455152, имеющей название «Оральный контактный комплект».

Способы определения количества диагностического агента в слюне хорошо известны из уровня техники. Для специалистов в этой области техники в продаже имеются различные химические анализаторы, ручные или автоматизированные, для измерения концентрации в слюне диагностических средств согласно изобретению, например, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Примеры указанных способов приведены в разделе Примеры изобретения.

Примеры

Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, хотя следует понимать, что указанные примеры включены просто с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения, если конкретно не указано другое.

Пример 1

Сбор слюны: Для сбора слюны у собак используют товарное устройство сбора слюны Salivette® (SARSTEDT, Germany). Собакам открывают пасть и вставляют туда тампон на стержне Salivette® таким образом, чтобы животное жевало тампон приблизительно от 30 до 45 секунд. Затем тампон Salivette® удаляют и переносят его в пробирку для сбора Salivette®. Слюну сразу отделяют путем вращения пробирки для сбора с ускорением 1000 g в течение 2 минут. Окончательно пробу слюны, собранную в нижней части пробирки для сбора, переносят в чистый микроконтейнер и сразу замораживают контейнер при -80°C для последующего анализа.

Анализ собачьего цитокина: определяют 14 цитокинов с помощью собачьего цитокина Luminex, произведенного на фирме Millipore, № по каталогу CCYTO-90K. Используется стандартная методика от изготовителя. Все пробы слюны подвергают центрифугированию с ускорением 14000 g в течение 2 мин, непосредственно перед использованием. Затем жидкость над осадком осторожно переносят в чистый микроконтейнер, разбавляют буферным раствором Luminex Assay Buffer (Millipore, № по каталогу L-AB) 1-3 раза. Индивидуальные пробы помещают на предварительно смоченный фильтровальный планшет с 96 лунками (поставляется изготовителем) с Контролем качества собачьего цитокина 1 и 2 (Millipore, № по каталогу LCC-6090) и стандартами (Millipore, № по каталогу LCC-8090). Планшеты обрабатывают в соответствии с инструкцией изготовителя. Пробы слюны смешивают с микробусинами с фиксированными антителами против 14 цитокин/хемокинов (GM-CSF, IFNγ, KC, IP-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-15, IL-18, MCP-1 и TNFα) и культивируют в течение ночи с интенсивным встряхиванием с использованием лабораторного аппарата для встряхивания планшетов (фирма Lab-Line Instruments, № модели 4625) при 4°C. На следующий день в планшет добавляют Антитела, регистрирующие собачий цитокин (№ по каталогу LCC-1090), после промывки планшета буферным раствором Luminex Wash Buffer (№ по каталогу L-WB). Затем планшет герметизируют и культивируют 1 час при комнатной температуре с интенсивным встряхиванием в аппарате для встряхивания планшетов. Впоследствии к планшету добавляют Streptavidin-Phycoerythrin (№ по каталогу L-SAPE3), и планшет закрывают крышкой (поставляется изготовителем), чтобы исключить воздействие света. Затем закрытый планшет культивируют еще в течение 30 мин с интенсивным перемешиванием. После указанного культивирования планшет промывают буфером Luminex Wash Buffer, и микробусины в лунках повторно суспендируют в покрывающем флюиде Luminex и считывают на анализаторе Luminex 100 IS. Концентрацию цитокина в пробах слюны рассчитывают с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT (версия 3.1.871.0).

Анализ вещества Р ELISA: Собачью слюну анализируют с использованием промышленного набора ELISA - Анализ параметрического вещества Р (фирма R&D Systems, № по каталогу KGE 007). В этом анализе пробу собачьей слюны разбавляют в 20 раз Калибрующим разбавителем RD5-45 (в составе набора). Стандарты и регистрирующие антитела (в составе набора) готовят в тех же разбавителях, которые указаны в наборе. Это конкурентный анализ ELISA. В течение 3 часового культивирования вещество Р (SP) в пробах или стандартах будет конкурировать с фиксированным количеством меченного пероксидазой хрена вещества Р (HRP-SP) за места связывания на мышиных антителах анти-вещества Р (SP). Через 3 часа культивирования смывают несвязанное/избыточное вещество SP-HRP; только связанные SP и SP-HRP могут образовать связь с антителом в предварительно покрытом 96-луночном планшете (в составе набора), за счет взаимодействия между антителом, покрывающим планшет, и мышиными антителами анти-вещества SP. Окончательно раствор хромогена (тетраметилбензидин) добавляют в 96-луночный планшет. В отличие от связанного SP вещество SP-HRP может взаимодействовать с этим хромогеновым субстратом с образованием синего окрашивания. После прекращения реакции добавлением 2N серной кислоты измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм с использованием планшет-ридера (Bio-TEK PowerWave X). Концентрация SP в пробе обратно пропорциональна оптической плотности и рассчитывается по стандартной кривой, построенной с помощью последовательно разбавленного стандартного раствора SP с использованием программного обеспечения, именуемого КС Junior (версия 1.41).

Определение иммуноглобулина A (IgA) ELISA: IgA в слюне собаки анализируют с использованием промышленного набора ELISA (фирма Bethyl Laboratories, Inc., № по каталогу Е40-104), в котором имеются все антитела и стандарты. Обычные буферы ELISA были приготовлены на месте с использованием реактивов, поставленных фирмой Sigma-Aldrich (Сент-Люис, шт. Миссури) или непосредственно от других поставщиков, как указано ниже:

(1) Покрывающий буфер, 0,05 М Carbonate-Bicarbonate, pH 9,6;

(2) Промывающий раствор, 50 mM Трис, 0,14 М NaCl, 0,05% Твин 20, pH 8,0;

(3) Блокирующий раствор, 50 mM Трис, 0,14 М NaCl, 1% Бычий сывороточный альбумин (BSA), pH 8,0;

4) Разбавитель пробы/конъюгата, 50 мМ Трис, 0,14 М NaCl, 1% BSA, 0,05% Твин 20;

(4) Ферментный субстрат ТМВ, заранее приготовленный раствор SureBlue™ (KPL, № по каталогу 52-00-03); и

(5) Стоп-раствор, 4N раствор серной кислоты.

Следуют стандартной методике сэндвич-ELISA. Покрывают 96-луночный планшет ELISA свежеприготовленным раствором анти-собачьего IgA антитела в покрывающем буфере в течение часа, затем планшет промывают Промывающим раствором, добавляют Блокирующий раствор и культивируют в течение 30 минут. После промывки в лунки планшета добавляют предварительно разбавленные пробы или стандартные растворы. Большую часть проб слюны разбавляют с использованием Разбавителя пробы/конъюгата в соотношении 1 к 5000, регулировку проводят, когда измеренные концентрации IgA выходят за пределы динамического диапазона стандартной кривой. Через 1 час культивирования с другой стадией промывки в этот планшет добавляют раствор HRP-конъюгированного детектирующего антитела (разбавленного Разбавителем пробы/конъюгата) и культивируют в течение часа. После промывки инициируют колориметрическое проявление указанного планшета, добавляя Ферментный субстрат ТМВ. После 10-15 минут проявления (до появления соответствующего темно-синего окрашивания) цветную реакцию прекращают путем добавления Стоп-раствора. В конце измеряют оптическую плотность планшета при длине волны 450 нм с использованием планшет-ридера (Bio-TEK PowerWave X). Концентрацию IgA в пробах рассчитывают с использованием программного обеспечения KC Junior (версия 1.41).

Измерения совокупного протеина слюны проводят, используя промышленный аналитический набор бицинхониновой кислоты (ВСА) протеина (Thermo Scientific, № по каталогу 23225), как указано в инструкции. Получают последовательно разбавленные стандартные растворы Бычьего сывороточного альбумина (в диапазоне от 0 до 2 мг/мл) в дистиллированной и деионизированной воде из стандартного исходного раствора BSA, предусмотренного в наборе. Затем пробы слюны разбавляют в надлежащей кратности, чтобы соответствовать концентрации протеина на стандартной кривой BSA. Может потребоваться некоторое время для нахождения правильного разбавления индивидуальных проб. После этого хорошо смешивают аналитический реагент-А ВСА протеина (Thermo Scientific, № по каталогу 23221) и реагент-В (Thermo Scientific, № по каталогу 23224) в соотношении 50:1 (по объему) в чистой пластиковой пробирке в приборе для встряхивания. После этого разбавленные пробы или BSA стандарты добавляют в лунки пластикового 96-луночного планшета с прозрачным дном, затем в эти лунки добавляют смесь реагентов А и В, и культивируют планшет при комнатной температуре в течение 30 мин. В ходе культивирования содержащийся в реагенте В пентагидрат сульфата меди реагирует с протеином в пробах, Cu2+ восстанавливается до Cu1+, и затем бицинхониновая кислота в реагенте А взаимодействует с восстановленным катионом одновалентной меди, образуя раствор пурпурного цвета, для которого наблюдается строго линейная зависимость поглощения при 562 нм с увеличением концентрации протеина. Данные планшета с пробами и стандарты можно считывать с помощью планшет-ридера (Bio-TEK PowerWave X) при длине волны 562 нм. Концентрацию совокупного протеина слюны в пробах рассчитывают с помощью программного обеспечения KC Junior (версия 1.41).

Статистический анализ: Расчеты критерия Стьюдента осуществляли с пакетом "R" программного обеспечения для анализа (www.r-project.org) для всех данных, полученных в этом исследовании. Статистическую значимость различий между двумя группами исследовали для индивидуальных биомаркеров слюны. Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2. При рассмотрении данных таблицы 1 и таблицы 2 видно, что концентрации IFNγ, IP-10, IL-2 и совокупного протеина слюны значительно отличаются для здоровых животных и животных, имеющих дегенеративное поражение сустава. Следовательно, указанные вещества служат биомаркерами для дегенеративного поражения сустава у животных

Таблица 1
Идентификация животного Пол Порода Возраст Состояние здоровья Оценка экстерьера (BCS) Совокупный протеин слюны (мг/мл) IgA слюны (мкг/мл)*
28 самка/s Бордер-терьер 14 остеоартрит 15,63 5650,03
48 М/n GRSHPD 10 остеоартрит BCS 4 1,29 2003,24
30 самец/n лабрадор 14 остеоартрит, слабоумие BCS 6 0,87 372,41
31 самец/n лабрадор 10 остеоартрит BCS 7 0,57 493,85
32 самка/s лабрадор 10 остеоартрит BCS 5 1,07 1562,29
35 самка/s лабрадор 14 остеоартрит BCS 5 2,88 429,12
36 самка/s лабрадор 14 остеоартрит BCS 5 2,62 2774,87
37 самка/s лабрадор 13 остеоартрит BCS 5 1,49 2823,45
38 самка/s лабрадор 12 остеоартрит BCS 5 0,73 1642,76
46 самка/s лабрадор 14 остеоартрит BCS 6 1,79 2317,79
47 самец/n лабрадор 14 остеоартрит BCS 4 1,40 1694,37
29 самка/s сеттер 14 остеоартрит, рак молочных желез BCS 4 0,56 283,66
34 самец/n сеттер 14 остеоартрит BCS 5 0,89 541,31
39 самка/s сеттер 14 остеоартрит BCS 4 1,09 828,66
44 самка/s сеттер 8 Артрит BCS 6 13,5 3297,19
33 самка/s сибирский хаски 6 остеоартрит BCS 5 2,78 2048,21
самка/s сеттер 14 Контроль BCS 5 1,78 533,45
самка/s лабрадор 12 Контроль BCS 5 1,56 336,50
самка/s лабрадор 10 Контроль BCS 5 1,42 1235,88
11В самка/s лабрадор 2 Контроль BCS 5 0,44 362,20
12В самка/s лабрадор 2 Контроль BCS 5 0,37 361,27
72 самец/n лабрадор 6 Контроль BCS 5 0,74 724,12
81 самец лабрадор 7 Контроль BCS 5 1,60 3839,68
53 самец/n лабрадор 9 Контроль BCS 6 1,79 1183
57 самка/s лабрадор 10 Контроль BCS 6 0,82 1652
64 самка лабрадор 6 Контроль BCS 6 0,59 418
65 самка лабрадор 4 Контроль BCS 6 0,58 474
72 самец/n лабрадор 6 Контроль BCS 5 0,74 724
81 самец лабрадор 7 Контроль BCS 5 1,60 3840
самка/s лабрадор 14 Контроль BCS 5 3,12 5844
15В самка/s лабрадор 1 Контроль BCS 5 2,89 895
самка/s сеттер 4 Контроль BCS 5 1,43 5295,47
17В самец/n сеттер 14 Контроль BCS 4 2,20 4815,07
19В самка/s сеттер 13 Контроль BCS 3 2,27 3005,73
68 самец/n сеттер 10 Контроль BCS 5 0,74 284,30
73 самец/n сеттер 5 Контроль BCS 5 3,12 10294,31
74 самец/n сеттер 4 Контроль BCS 5 1,43 3575,66
78 самец/n сеттер 2 Контроль BCS 5 1,14 2162,50
Таблица 1 (продолжение)
GM-CSF IFNγ IL-10 IL-15 IL-18 IL-2 IL-4
(пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл)
39,02 4,4 1,6 106,65 16,47 38,33 28,8
199,84 4,4 39,41 25,95 42,12 6,4 28,8
49,95 26,24 1,6 31,11 7,15 36,58 28,8
25,34 98,48 1,6 36,46 14,38 27,61 28,8
29,91 3,55 1,6 19,04 2,28 12,81 28,8
48,13 42,18 16,22 53,42 14,36 53,59 28,8
41,76 4,4 1,6 32,31 21,03 15,68 28,8
22,16 4,4 1,6 24,56 8,44 14,09 28,8
85,11 147,40 3,92 72,94 99,14 162,01 86,88
14,4 4,4 31,11 14,8 38,75 6,4 28,8
14,4 4,4 22,70 14,8 16,33 6,4 28,8
36,27 23,27 1,6 50,51 11,00 28,73 28,8
39,08 4,4 1,6 14,8 7,13 15,91 28,8
41,05 10,16 0,19 38,53 27,98 50,80 28,8
14,4 4,4 4,84 27,58 12,45 6,4 28,8
60,41 8,88 1,6 Слишком много 24,31 39,67 28,8
18,775 60,395 1,6 14,8 5,805 37,98 28,8
56,855 103,23 2,03 77,77 14,575 48,575 28,8
51,75 100,045 1,31 47,59 9,97 47,735 28,8
93,365 89,745 19,855 52,815 49,675 68,045 138,93
54,49 66,52 19,5 20,18 29,39 76,17 138,93
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
29,84 14,40 1,55 46,18 17,72 69,72 106,09
29,45 47,23 1,60 11,56 10,58 22,43 28,80
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
52,00 56,50 1,60 14,80 14,20 76,18 28,80
19,71 25,74 4,55 30,19 4,60 25,96 12,37
22,955 37,665 1,6 14,8 4,69 19,335 28,8
97,14 125,91 10,34 113,41 21,84 157,59 28,8
54,43 4,4 1,6 52,26 9,30 72,57 28,8
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA cDUA DUA DUA DUA
Таблица 1, продолжение
IL-4 IL-6 IL-7 IL-8 IP-10 KC MCP-1 TNF-α
(пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл)
28,8 12,1 9,43 20526,36 75,56 2906,47 185,41 53,05
28,8 67,93 25,88 5347,21 44,68 1516,46 86,42 49,60
28,8 12,1 11,73 3854,66 2,4 1054,65 82,13 21,93
28,8 12,1 25,26 4092,34 60,33 539,35 65,91 18,01
28,8 12,1 6,00 2408,24 2,4 1281,21 63,40 6,91
28,8 61,36 14,41 1578,69 120,57 1249,71 68,87 4,59
28,8 12,1 30,47 4251,10 95,79 620,63 56,54 13,29
28,8 12,1 12,30 6265,12 41,85 3034,49 71,32 39,44
86,88 12,1 37,00 3294,73 80,66 1833,44 124,43 8,28
28,8 49,12 34,76 4824,00 2,4 1654,22 69,52 25,10
28,8 26,13 14,21 5785,39 27,14 1277,45 47,76 10,18
28,8 12,1 8,17 4106,65 2,4 2184,59 69,21 4,13
28,8 12,1 13,66 2663,76 2,4 926,64 44,35 8,23
28,8 12,1 10,32 1573,32 129,12 551,25 68,35 12,96
28,8 18,80 9,05 13365,17 2,4 1755,42 299,53 346,56
28,8 12,1 17,38 3941,90 161,22 836,66 62,60 39,38
28,8 12,1 5,705 2008,645 2,4 1912,415 51,04 34,35
28,8 12,1 11,625 2369,905 2,4 1179,165 77,575 173,705
28,8 12,1 4,17 1639,415 2,4 2573,56 73,18 34,995
138,93 12,1 22,43 3994,99 2,4 1058,355 100,17 8,44
138,93 12,1 7,26 1211,25 2,4 322,87 60,69 4,97
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
106,09 12,10 22,45 3550,94 92,07 644,57 124,32 21,45
28,80 12,10 17,21 3475,75 2,40 870,09 76,38 0,40
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
28,80 12,10 26,21 3732,87 2,40 1155,56 100,86 294,79
12,37 33,00 4,60 469,39 80,25 292,56 31,76 0,40
28,8 12,1 4,6 2469,515 2,4 3129,81 58,605 13,845
28,8 12,1 63,79 21111,16 13,53 2679,59 101,79 96,33
28,8 12,1 12,72 2778,60 43,89 1015,67 96,20 9,80
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA DUA
DUA = данные отсутствуют
Таблица 2
Биомаркеры слюны Группа остеоартрита Контрольная группа Значение p Стандартная ошибка
Среднее значение Количество исследованных животных Среднее значение Количество исследованных животных
Совокупный протеин слюны 3,409 16 1,471 22 0,071* 0,525
Вещество Р 1307,357 16 728,5 14 0,571 498,575
IgA слюны 2007,653 16 2357,097 22 0,639 356,161
GM-CSF 48,215 16 48,397 12 0,991 7,58
IFNγ 24,704 16 60,982 12 0,035** 8,706
IL-10 9,256 16 5,595 12 0,389 2,072
IL-15 37,065 16 41,363 12 0,712 5,646
IL-18 24,655 16 16,029 12 0,281 3,913
IL-2 32,579 16 60,191 12 0,087* 8,034
IL-4 32,949 16 52,227 12 0,157 6,731
IL-6 23,731 16 13,842 12 0,115 3,112
IL-7 18,581 16 16,898 12 0,755 2,612
I-,8 5708,381 16 4067,702 12 0,44 1033,569
IP-10 60,466 16 20,745 12 0,032** 9,418
KC 1427,386 16 1402,851 12 0,943 165,802
MCP-1 93,886 16 79,381 12 0,502 10,5
TNF-a 45,399 16 57,79 12 0,727 17,176
остеоартрит = Дегенеративное поражение сустава
** = значимый; * = минимально значимый

В описании раскрыты типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения. Хотя используются специальные термины, они применяются только в общем и описательном значениях и не с целью ограничения. Объем изобретения изложен в формуле изобретения. Очевидно, что в свете вышеуказанных рекомендаций возможны многие модификации и вариации изобретения. Поэтому следует понимать, что в объеме прилагаемой формулы изобретения изобретение может быть осуществлено иным образом, чем это конкретно описано.

1. Способ диагностики артрита или остеоартрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, который включает в себя:
отбор пробы слюны животного;
определение количества по меньшей мере трех диагностических агентов, выбранных из группы, состоящей из гамма-интерферона (IFN-γ), индуцируемого интерфероном протеина-10 (IP-10), интерлейкина-2 (IL-2) и совокупного протеина слюны (TSP) в пробе слюны;
сопоставление количества диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от сопоставимого контрольного животного, которое не страдает от дегенеративного поражения сустава; и
и диагностирование остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, если количество IP-10 и/или TSP и их сочетание с Il-2 и IFN-γ в пробе слюны от этого животного больше, чем количество таких же диагностических агентов, обнаруженных в пробе слюны от контрольного животного того же вида.

2. Способ по п. 1, в котором диагноз основан на определении количества всех четырех диагностических агентов.

3. Способ по п. 1, в котором у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, диагностируется остеоартрит или артрит, если количество IFNγ в слюне является по меньшей мере в 1,2 раза больше, количество IP-10 в слюне является по меньшей мере в 1,4 раза больше, количество IL-2 в слюне является по меньшей мере в 1,6 раза больше или количество TSP в слюне является по меньшей мере в 1,8 раза больше количества такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от контрольного животного того же вида.

4. Способ по п. 1, в котором у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, диагностируется остеоартрит или артрит, если количество IFNγ в слюне является по меньшей мере в 1,2 раза больше и количество IP-10 в слюне является по меньшей мере в 1,4 раза больше количества такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от контрольного животного того же вида.

5. Способ по п. 1, в котором у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, диагностируется остеоартрит или артрит, если количество IFNγ в слюне является по меньшей мере в 1,2 раза больше, количество IP-10 в слюне является по меньшей мере в 1,4 раза больше, количество IL-2 в слюне является по меньшей мере в 1,6 раза больше и количество TSP в слюне является по меньшей мере в 1,8 раза больше количества такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от контрольного животного того же вида.

6. Способ по п. 1, в котором сустав представляет собой скользящий сустав, шарнирный сустав, мыщелковый сустав, седловидный сустав, шаро-шарнирный сустав, или поворотный сустав.

7. Способ по п. 1, в котором сустав является коленным, локтевым, межфаланговым, пястно-фаланговым, запястным, запястно-фаланговым, суставом большого пальца руки, плечевым, тазобедренным, височно-нижнечелюстным или лучелоктевым суставом.

8. Способ по п. 1, в котором сустав является плечевым суставом.

9. Способ по п. 1, в котором сустав является тазобедренным суставом.

10. Способ по п. 1, в котором животным является человек.

11. Способ по п. 1, в котором животным является домашнее животное.

12. Способ по п. 11, в котором животное относится к псовым.

13. Способ по п. 12, в котором животным является собака.

14. Способ по п. 11, в котором животное относится к кошачьим.

15. Способ по п. 14, в котором животным является кошка.

16. Способ диагностики остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего дегенеративным поражением сустава, который включает в себя:
отбор пробы слюны животного;
определение количества по меньшей мере трех диагностических агентов, выбранных из группы, состоящей из IFNγ, IP-10, IL-2 и TSP в пробе слюны; и
сопоставление количества диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от контрольного животного того же вида, которое не страдает от дегенеративного поражения сустава; и
диагностирование остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, если количество IFNγ в слюне обследуемого животного является по меньшей мере в 1,2 раза больше количества IFNγ, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, количество IP-10 в слюне обследуемого животного является по меньшей мере в 1,4 раза больше количества IP-10, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, количество IL-2 в слюне обследуемого животного является по меньшей мере в 1,6 раза больше количества IL-2, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, или количество TSP в слюне обследуемого животного является по меньшей мере в 1,8 раза больше количества TSP, обнаруженного в слюне контрольного животного того же вида.

17. Способ диагностики остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, который включает в себя:
отбор пробы слюны животного;
определение количества по меньшей мере трех диагностических агентов, выбранных из группы, состоящей из IFNγ, IP-10, IL-2 и TSP в пробе слюны; и
сопоставление количества диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны, с соответствующим количеством такого же диагностического агента, обнаруженного в пробе слюны от контрольного животного того же вида, которое не страдает от дегенеративного поражения сустава; и
диагностирование остеоартрита или артрита у животного, восприимчивого или страдающего от дегенеративного поражения сустава, если количество IFNγ у обследуемого животного составляет приблизительно в 1,2-20 раз больше количества IFNγ, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, количество IP-10 у обследуемого животного составляет приблизительно в 1,4-20 раз больше количества IP-10, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, количество IL-2 у обследуемого животного составляет приблизительно в 1,6-20 раз больше количества IL-2, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида, или количество TSP у обследуемого животного составляет приблизительно в 1,8-20 раз больше количества TSP, обнаруженного в слюне от контрольного животного того же вида.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области медицины, в частности молекулярной биологии, иммунологии и нейробиологии. Предложены способ ex vivo детекции антител в содержащем антитела образце, включающий контактирование содержащего антитела образца с подложкой с закрепленным на ней пептоидом и детекцию антител, связавшихся с указанным пептоидом, и способ детекции антитела в биологической жидкости, включающий стадии инкубации панели пептоидов с блокирующим буфером, удаления блокирующего буфера, инкубации панели пептоидов с раствором образца, содержащим бактериальный лизат и детекции антитела, связавшегося с панелью пептоидов.

Группа изобретений относится к медицине, а именно диагностике глютен-чувствительной энтеропатии у генетически предрасположенных пациентов, и может быть использована для уточнения диагноза аутоиммунного заболевания.
Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК). Сущность изобретения состоит в том, что преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека, готовят путем обработки 0,01 М Трис-HCl-буфером, содержащим 8,3%-ный ПЭГ 3350, 3,3%-ный ПВП 12600 и 0,15 М NaCl, pH 7,4 в соотношении 1:1,2.
Настоящее изобретение относится к иммунологическому тесту для обнаружения и специфического определения аутоантител против антигенов семенников, которые присутствуют при воспалительных заболеваниях половой системы самцов млекопитающих, в биологическом образце самца млекопитающего, в частности для обнаружения тестикулярных аутоантител к ER-60 и/или трансферриновых аутоантител.

Изобретение относится к области медицины и касается улучшенных способов иммуноанализа для выявления болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию у млекопитающего.

Изобретение относится к медицине и биохимии и касается способа обнаружения нейтрализующих антител к терапевтическому антителу, такому как антитело против CD20. .

Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинской диагностике. .
Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для оценки тяжести преэклампсии у беременных. .

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами. .
Наверх