Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция



Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция
Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция

 


Владельцы патента RU 2627156:

СЕРУМ ИНСТИТЬЮТ ОФ ИНДИЯ ПРАЙВАТ ЛТД. (IN)

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X, его конъюгат с белком-носителем и иммуногенная композиция на основе конъюгата для приготовления вакцин против менингита. Способ осуществляют с использованием ферментационной среды, включающей казаминкислоту, оптимальной стратегии добавления питательного раствора и улучшенного процесса выделения и очистки полисахарида, исключающего любые хроматографические методы. Соотношение полисахарида к белку в конъюгате находится в пределах от 0,2 до 0,6. Изобретения позволяют получать очищенный полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы X с выходом от 300 до 550 мг/л, средней молекулярной массой от 400 до 550 кДа, выходом на стадии очистки от 60% до 65% и содержанием менее 0,5% белков, менее 0,5% нуклеиновых кислот и менее 5 EU/мкг эндотоксинов. Полисахарид X доводят до размера от 150 до 200 кДа и конъюгируют с белком-носителем. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к вакцинам против менингококка Neisseria meningtidis.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Менингококк (Neisseria meningtidis) является причиной эпидемического бактериального менингита. Капсульный полисахарид является основным фактором, определяющим вирулентность N.meningitidis. Среди 13 серогрупп менингококков, классифицированных на основе структуры капсульного полисахарида, серогруппы А, В, С, Y и W135 связаны с большинством случаев менингококковой инфекции. В Африканском менингитном поясе наиболее крупные эпидемии были вызваны менингококками серогруппы А, в то время как спорадические заболевания и вспышки в развитых странах, как правило, вызваны менингококками серогрупп В и С. Менингококки серогруппы Y стали основной причиной спорадических заболеваний и вспышек в Соединенных Штатах в конце 1990-х годов, а в 2000 году менингококки серогруппы W135 вызвали заболевания во всем мире в связи с паломничеством в Мекку и крупными вспышками в странах Африки южнее Сахары.

Серогруппа X Neisseria meningitidis (МеnХ), ранее редко являвшаяся причиной спорадических случаев заболевания менингитом, в последнее время оказалась связанной с увеличением заболеваемости менингококковой инфекцией и стала причиной крупных вспышек в "поясе менингита" в Африке. Вспышки были зафиксированы в Нигерии, Буркина-Фасо, Того и Гане и они изменились в размерах. В сезон менингита в 2010 году более 6500 случаев заболевания были зарегистрированы в Буркина-Фасо, и разумно предположить, что, по крайней мере, 1000 из этих случаев были обусловлены заболеванием МеnХ и локально сообщалось о 120 случаях на 100000 заболеваний. Ранее были подтверждены в рамках вспышки у нескольких пациентов заболевание с МеnХ, по крайней мере, в 82 случаях бактериального менингита на границе Кении и Уганды в 2007 году.

Капсульные полисахариды серогрупп В, С, Y и W135 менингококков состоят из производных сиаловой кислоты. Серогруппа В и С менингококков представляет собой (α 2-8) - и (α 2-9) - связанную полисиаловую кислоту, соответственно, в то время как чередующиеся последовательности D-глюкозы или D-галактозы и сиаловой кислоты представляют собой серогруппу Y и W135 N.meningitidis. В противоположность этому капсула серогруппы А менингококков состоит из (α 1-6)-связанного N-ацетилманнозамин 6-фосфата, в то время как серогруппа X N.meningitidis, синтезирует капсульные полимеры (α 1-4) -связанного N-ацетилглюкозамин 1-фосфата.

Увеличение заболеваемости МеnХ в африканском поясе менингита за последние 5 лет вызывает необходимость разработки и внедрения вакцины МеnХ в отдельных районах области для профилактики и контроля последующих эпидемий. Конъюгация менингококковых капсульных полисахаридов с белком-носителем привела к разработке моновалентных (А или С) полисахарид-конъюгированных вакцин с высокой эффективностью, и данные клинических исследований по иммуногенности показывают, что широкое использование четырехвалентных конъюгированных вакцин, охватывающих серогруппы А, С, Y и W-135 могут быть одинаково эффективны. Аналогичный подход может быть также плодотворным для МеnХ. Ссылка Ouli Xiea et al "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.

Gunnstein Norheim обсуждает, что в настоящее время вакцина против серогруппы X не доступна, и что доступные вакцины нового поколения должны быть направлены против наиболее распространенных серогрупп: A, W-135, X. Ссылка "Preventing the emerging serogroup X meningococcal disease in the African Meningitis Belt" Oxford Vaccine Group, 2011.

В последние несколько лет отсутствие вакцины против менингококка группы X является причиной внимания к вспышкам, вызванным менингококками именно этой серогруппы. Ссылка "Meningococcal vaccines: WHO position paper", November 2011.

Для того, чтобы способствовать развитию конъюгированной вакцины на основе полисахарида МеnХ, необходимо получить структурно неповрежденные полисахариды МеnХ с более высокими выходами.

В области крупномасштабного производства менингококкового полисахарида были раскрыты несколько синтетических подходов (Frantz, I. D. Jr. Growth Requirements of the Meningococcus. J. Bact., 43: 757-761, 1942; Catlin, B.W. Nutritional profiles of Neisseria lactamica, gonorrhoeae and meningitidis, in chemically defined media. J. Inf. Dis., 128(2): 178-194, 1973; Watson-Scherp Medium: Watson R G, et al. The specific hapten of group С (group IIa) meningococcus, II. Chemical nature. J Immunol 1958; 81:337-44; Marcelo Fossa da Paz; Júulia Baruque-Ramos; Haroldo Hiss; Márcio Alberto Vicentin; Maria Betania Batista Leal; Isaias Raw. Polysaccharide production in batch process of Neisseria meningitidis serogroup С comparing Frantz, modified Frantz and Catlin 6 cultivation media, Braz. J. Microbiol, vol. 34., no. 1. Sao Paulo January/April 2003).

В US 5494808 сообщается о крупномасштабном процессе ферментации с высокой плотностью клеток (5 г/л сухого веса клеток, и оптической плотностью в диапазоне от приблизительно 10-13 при 600 нм) для культивирования N.meningitidis, (серогруппы В 11). Указанный патент раскрывает следующую среду (так называемая "МС.6") для культивирования менингококка для выделения ОМРС ("белковый комплекс внешней мембраны")

US 7399615 раскрывает композицию для ферментации, где композиция не содержит NH4Cl, а также улучшенный способ ферментации Neisseria (серогрупп А, С, и W135) в композиции для ферментации, в которой хлорид аммония (источник азота) заменен на соевый пептон (HSP-A; Nutricepts, Inc;. Миннеаполис, штат Миннесота). Указанная периодическая ферментация с добавлением субстрата (2L), отличающаяся тем, что ферментационная среда, также как и раствор субстрата содержит HSP-A, приводит к полисахариду Men А с выходом около 1300-1400 мг/л при средней максимальной оптической плотности (OD) между 14-20.

US 7491517 раскрывает Neisseria meningtidis питательную культуральную среду (NMFM) для получения капсульных полисахаридов из менингококка (серогрупп А, С, Y и W135), содержащую: DI (деионизированную) воду, NaCl, K2SO4, KCl, тринатриевую соль лимонной кислоты *2Н2O (дигидрат), MgSO4*7H2O, MnSO4*H2O, MnCl2*6H2O, витамин В12, НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид) тиамин HCI, соевый пептон, D-глюкозу, L-глутаминовую кислоту, L-аргинин, L-серин, L-цистеин, глицин, морфолинпропансульфокислоту [MOPS], СаСО3 для поддержания рН в пределах от 6,5 до 7,0 и Fe2(SO4)3 для серогруппы А и NH4Cl для серогруппы W-135. Указанная ферментация приводит к полисахариду с выходом около 30-40 мг/л при средней максимальной оптической плотности (OD) 10.

David Bundle и др. обсуждает получение и выделение МеnХ полисахарида из N.meningitidis, штамма 247 X (лабораторный центр по контролю над заболеваниями Laboratory Center for Disease Control), в котором указанный штамм выращивают на химически определенной среде (NCDM) в течение 18 часов. Указанная ферментация приводит к МеnХ полисахариду с выходом около 20 мг/л. Ссылка "Studies on the Group-specific Polysaccharide of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure для its isolation" JBC, 1974.

Ouli Xiea и др раскрывают получение МеnХ PS из штаммов BF7/07 и BF12/03. Вкратце, штаммы МеnХ выращивают в чашках с агаром на сердечно-мозговом бульоне с дОDолнением Levinthals, и после предкультурального этапа в 0,2 л среды Франца, штамм культивируют в четырех отдельных встряхиваемых колбах с перегородками объемом 2,8 л, каждая содержит 1,0 или 1,5 л модифицированной жидкой среды Франца. Жидкие культуры инактивируют спустя 16 ч роста, путем добавления формальдегида до конечной концентрации 1% (об/об). Выход МеnХ PS на литр культуральной среды оказался немного выше, для изолята BF7/07 (4,5 мг/л) чем для изолята BF12/03 (3,8 мг/л). Ссылка "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.

В предшествующем уровне техники обсуждаются исследования по улучшению структуры и выхода полисахаридов из серогрупп Men А, С, Y и W135. Однако ни один из источников уровня техники не обращается к давно испытываемой потребности в получении Men X полисахарида с более высоким выходом, который является необходимым условием для развития простого MenX полисахарида и вакцин с белок-конъюгированным MenX полисахаридом.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что стратегии периодической подпитки (фидинга) из предшествующего уровня техники основанные на статическом уровне рН, при скачках и постоянной скоростью, которые подходят для ферментации Men А С Y W135, тем не менее, характеризуются следующими недостатками в случае MenX: i) удовлетворительный рост, но меньший выход полисахарида ii) ограниченный рост и меньший выход полисахарида и iii) удовлетворительный рост, но ранняя фаза замедления роста, т.е. стадия отмирания. Более того методы из предшествующего уровня техники используют соевый пептон вместе с дрожжевым экстрактом в качестве питательных компонентов среды, что приводит к снижению выхода полисахарида, связанного с повышенной загрузкой белковыми загрязнениями.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенных культуральных, ферментативных и очищающих условий получения полисахаридов менингококка X с высоким выходом и минимальными примесями. С указанными усовершенствованиями, изготовление вакцин с белок-конъюгированным MenX полисахаридом может быть экономичным, и впоследствии вакцина может быть сделана доступной для детей в развивающихся странах по доступным ценам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение возникает из неожиданного открытия, что можно получить MenX полисахарид с высоким выходом и высокой степенью чистоты путем использования а) ферментационной среды, содержащей казаминокислоту наряду с другими компонентами, б) новой непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и состава питательной среды, что может привести к задержке фазы замедления роста, с) оптимальных условий ферментера и d) улучшенного процесса очистки, свободного от хроматографических методов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 - Профиль роста "N. meningitidis X 8210» в среде, содержащей казаминокислоту по сравнению со средой, содержащий соевый пептон.

Фиг. 2 - 13С ЯМР-спектр MenX

Фиг. 3 - 31Р-ЯМР-спектр MenX

Фиг. 4 - 1ЯМР-спектр MenX

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому воплощению, настоящее изобретение предпочтительно использует ферментационную среду, содержащую казаминокислоту в качестве источника азота вместо соевого пептона или дрожжевого экстракта, таким образом, обеспечивая следующие преимущества i) значительное увеличение выхода полисахарида из-за задержки фазы отмирания в результате использования новой непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и) 50% снижение концентрации белковых и нуклеиновокислотных загрязняющих веществ непосредственно на стадии сбора клеток в биореакторе 100 кДа, обеспечивая, таким образом, условия, которые позволяют в результате последующего процесса очистки легко удалить оставшиеся примеси iii) масштабирование ферментационной среды, содержащей казаминокислоту, которое может быть простым и экономичным.

Второе воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанная, менингококковая ферментационная среда для получения капсульных полисахаридов из менингококка X может содержать декстрозу между 9 и 10 г/л, хлорид натрия от 5,5 до 6 г/л, сульфат калия от 0,8 до 1 г/л, двухосновный фосфат калия от 3,5 до 4 г/л, хлорид аммония от 0,14 до 0,19 г/л, глутаминовую кислоту от 4,5 до 5,5 г/л, L-аргинин между 0,2 и 0,4 г/л, L-серин между 0,4 и 0,6 г/л, L -цистеин между 0,24 и 0,26 г/л, хлорид магния от 0,18 до 0,20, хлорид кальция 0,02 г/л сульфат железа 0.002 г/л и казаминокислоту между 5 и 20 г/л.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанная менингококковая ферментационная среда для получения капсульных полисахаридов из Neisseria meningtidis X может содержать декстрозу 10 г/л, хлорид натрия между 5,8 и 6 г/л, сульфат калия между 0,9 и 1 г/л, двухосновный фосфат калия между 3,8 до 4 г/л, хлорид аммония между 0,14 и 0,17 г/л, глутаминовую кислоту между 4,8 до 5 г/л, L-аргинин между 0,2 и 0,3 г/л, L-серин между 0,4 и 0,5 г/л, L-цистеин между 0,24 и 0,25 г/л, хлорид мания между 0,18 до 0,19, хлорид кальция 0,02 г/л, сульфат железа 0.002 г/л и казаминокислоту между 5 и 10 г/л.

Важным аспектом настоящего изобретения является то, что авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили преимущество непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки, которая может поддерживать клетки в стационарной фазе в течение более длительного времени, таким образом, повышая выход полисахарида N. meningitidis X, так, что добавление начальной подпитки может быть начато, когда оптическая плотность OD при 590 нм находится между 3 и 4 со скоростью 10 мл/ч/1,5 л, которую постепенно увеличивают до 30 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока оптическая плотность культуры OD не повысится, а затем поддерживается на уровне 60 мл/ч/1,5 л до тех пор, пока оптическая плотность культуры OD не достигнет 50% от высшего значения оптической плотности, после чего культура может быть собрана.

В дальнейшем изобретатели обнаружили, что во время ферментации, чтобы избежать падения рН в результате накопления образующихся клеточных метаболитов, могут непрерывно подаваться NaOH в концентрации между 0,25N и 0,5N и ортофосфорная кислота в концентрации от 5 до 10% с помощью находящихся в каскаде дозирующих насосов, поддерживая рН в заданной точке, где соотношение карбоната натрия (20%) к NaOH (0,5N) поддерживается на уровне 1: 3.

Одним из важных аспектов настоящего изобретения является то, что указанный штамм N.meningitidis X 8210, как было установлено, имеет Лаг-фазу (логарифмическую фазу) между 5-ым и 9-ым часом, стационарную фазу между 9-ым и 12-ым часом и фазу замедления роста между 12-ым и 19-ым часом.

Ферментация по настоящему изобретению может быть осуществлена в статичном режиме или в периодическом режиме с подпиткой, предпочтительно в непрерывном режиме с подпиткой.

В еще одном аспекте настоящего изобретения, указанный питательный раствор может содержать декстрозу от 72 до 76 г/л, глутамат натрия от 38 до 42 г/л, L-аргинин от 2,8 до 3,2 г/л, L-серин от 2,8 до 3,2 г/л, L-цистеин от 1,9 до 2,1 г/л, хлорид магния от 1,9 до 2,1, хлористый кальций от 0,13 до 0,15 г/л и сульфат железа 0,02 г/л.

В третьем воплощении, настоящее изобретение обеспечивает МеnХ капсульный полисахарид, имеющий выход от 600 мг/л до 800 мг/л при 100 кДа на стадии сбора клеток, выросших в культуре ферментера, где оптическая плотность, измеренная при 590 нм может быть от 8 до 15, предпочтительно от 8 до 11.

Третье воплощение настоящего изобретения заключается в том, что ферментация менингококка X может быть выполнена при заданных значениях i) рН от 7 до приблизительно 7,2, и) температура между 36 и 37°С и при каскадных значениях для i) растворенный кислород от 15 до 25%, и) перемешивание от 350-500 оборотов в минуту, iii) потока газа от 1 до 1,5, iv) воздух от 0 до 100% и v) кислород от 0 до 100%.

Четвертое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что собранные диафильтрацией клетки, выросшие в культуре при 100 кДа, могут быть дополнительно подвергнуты стадиям очистки состоящим из:

(a) удаления белковых примесей и эндотоксинов с использованием дезоксихолата в концентрации 1%, в сочетании с этилендиаминтетрауксусной кислотой в концентрации 2 мМ и этанола в концентрации 40%;

(b) добавления от 4 до 6% ацетата натрия для удаления нуклеиновых кислот;

(c) добавления цетилтриметиламмоний бромида в концентрации от 3 до 4% для связывания полисахарида и примесей;

(d) осаждения полисахарида из комплекса бромид цетилтриметиламмония-полисахарида путем использования хлорида натрия в концентрации 0,05М в присутствии 96% абсолютного этанола;

(e) удаления примесей белков и нуклеиновых кислот путем промывки гранул этанолом с концентрацией 45% в присутствии хлорида натрия в концентрации 0,4 М;

(f) селективного осаждения полисахарида с использованием 96% абсолютного этанола;

(g) растворения полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком,

при этом в указанном процессе очистки не используется какая либо хроматография и указанный очищенный полисахарид имеет выход от 300 до 500 мг/л, средний молекулярный вес от 400 до 550 кДа, содержит менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот, менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов, и со стадией очистки извлекается от 60% до 65%.

Другой аспект четвертого воплощения заключается в том, что указанный способ очистки N.meningitidis X полисахарида является надежным и экономически эффективным, поскольку он обеспечивает извлечение примерно от 60 до 70% полисахарида и не требует каких-либо дополнительных хроматографических стадий очистки.

Пятый аспект настоящего изобретения заключается в том, что указанный способ может быть применим к N.meningitidis серотипов X, А, В, CD, Y, Z, 29Е и W-135, предпочтительно, N.meningitidis серотипа X штаммов, выбранных из М9601, М9592, М9591, 247Х, М9554, М8210 и М2526, 5967 штамма (ST 750), наиболее предпочтительно "М8210".

Шестое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанный N.meningitidis X полисахарид по настоящему изобретению может быть использован для приготовления композиции полисахарид-белкового конъюгата способами, Описанными в WO 2013114268, где i) полисахарид X может быть доведен до размера механически, чтобы получить фрагменты, имеющие размер от 150 до 200 кДа, ii) измеренный сахарид может быть конъюгирован с белком-носителем через линкер с помощью цианилирования путем химического конъюгирования iii) соотношение сахарида к белку в окончательном конъюгате может быть в пределах от 0,2 до 0,6.

В одном аспекте шестого воплощения указанный полисахарид N.meningitidis X по настоящему изобретению также может быть использован для получения поливалентной менингококковой конъюгированной полисахаридной композиции, содержащей капсульный сахарид из серогрупп X и, по крайней мере, один дополнительный капсульный полисахарид из А, С, W135 и Y с помощью способов, раскрытых ранее в WO 2013114268.

Седьмое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанный белок-носитель может быть выбран из группы, но, не ограничиваясь такими как CRM 197, токсоид дифтерии, токсоид столбняка, коклюшный токсоид, E. coli LT, Е: coli ST, и экзотоксин А из синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), белковый комплекс внешней мембраны (ОМРС), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, поверхностный пневмококковый белок A (PspA), белок адгезии пневмококков (PSAA), поверхностные пневмококковые белки BVH-3 и BVH-11, защитный антиген (РА) возбудителя сибирской язвы(Васillus anthracis) и детоксифицированного фактора отека (EF) и летального фактора (LF) из возбудителя сибирской язвы, овальбумина, гемоцианин лимфы улитки (KLH), сывороточного альбумина человека, бычьего сывороточного альбумина (BSA) и очищенного белкового производного туберкулина (PPD). Предпочтительно, белки-носители могут быть выбраны из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина и CRM 197.

Моновалентные или поливалентные иммуногенные композиции, содержащие N.meningitidis X полисахарид могут быть в буферной жидкой форме или в лиофилизованной форме. Предпочтительно, указанные белок-конъюгированные полисахариды могут быть лиофилизованы, как описано ранее, в заявке US2013/0209503, где композиция может быть стабильна по крайней мере 6 месяцев при 40°С и содержание свободного полисахарида может быть меньше, чем 11% вес/вес.

Композиция лиофилизованной вакцины по настоящему изобретению может быть преобразована с помощью средства доставки в виде носителя, имеющего рН от примерно 6 до 7,5, особенно с физиологическим раствором или PBS.

Композиции могут дополнительно содержать соли алюминия, добавленные в количестве 25-125 мкг Аl+++ на 0,5 мл.

Также указанная композиция может содержать консервант, выбранный из тиомерсала и 2-феноксиэтанола.

Композиция лиофилизованной вакцины по настоящему изобретению может быть дана в виде 1,5 или 10 дозированного состава.

Указанный полисахарид или его конъюгат предпочтительно вводят парентерально, например, путем внутривенной инъекции или инфузии, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным или внутриочаговым путем.

Примеры:

I) Методика ферментации:

Семенной флакон, содержащий 3 мл "N.meningitidis, X М8210" (CBER) культуры, имеющей оптическую плотность (OD) 1/мл замораживают при -70°С. Затем флакон размораживают и высевают в 30 мл посевной питательной среды, которую инкубируют при 37°С и перемешивают при 150-180 оборотах в минуту. Объем удваивают до 60 мл, когда оптическая плотность OD станет выше 0,7, доводят до 120 мл, и 210 мл соответственно.

Культуру, имеющую оптическую плотность OD 1.0±0.2 с объемом 70±10 мл высевают в реактор, где объем среды в реакторе составляет 1500 мл. После инокуляции реактора 0 ч оптическую плотность поддерживают на уровне от 0,04 до 0,05.

Полный процесс ферментации проводят в стеклянном биореакторе NBS bio flow Celligen 115 (2.2L), в котором цикл ферментации проводят в режиме непрерывной подпитки и общая длительность цикла ферментации составляет 19 часов.

II) Композиция ферментационной среды:

Фаза логарифмического роста была определена между 5-ым и 9-ым часом, стационарная фаза между 9-ым и 12-ым часом и фаза отмирания между 12-ым и 19-ым часами.

Новая стратегия подпитки:

Стратегия подпитки была разработана таким образом, что начальное добавление подпитки может быть начато, когда OD при 590 нм составляет от 3 до 4, со скоростью 10 мл/ч/1.5 л, которую постепенно увеличивают до 30 мл/ч/1.5 л до увеличения OD культуры, а затем поддерживается на уровне 60 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока OD культуры не достигнет 50% наивысшего значения OD, после чего культура может быть собрана.

Питательный раствор:

Результаты:

Стратегия непрерывной экспоненциальной подпитки привела к поддержанию клеток в стационарной фазе в течение более длительного периода, увеличивая, таким образом, выход N.meningitidis X полисахарида. Было обнаружено, что использование казаминовой кислоты в качестве источника азота, обеспечивает высокий выход и высокий молекулярный вес МеnХ полисахарида с минимальными примесями при 100 кДа, по сравнению с соевым пептоном в качестве источника азота.

В случае, когда только декстроза и глутамат натрия используется в качестве питательного раствора (FS-2), морфология клеток повреждается, в конечном счете, приводя к неблагоприятным характеристикам полисахарида. В то время как, использование FS-1 (содержащего аминокислоты, соли, в дополнение к декстрозе и глутамату натрия) обнаруживает, что морфология клеток улучшается, тем самым увеличивая выход полисахарида и обеспечивая полисахарид с благоприятными характеристиками.

Исследование профиля роста N.meningitidis X 8210 показывает, что в процессе ферментации было отмечено снижение рН в результате накопления высвобождаемых клеточных метаболитов, что отрицательно сказывается на скорости получения капсульных полисахаридов. Чтобы избежать такого снижения рН, непрерывно обеспечивают NaOH в концентрации между 0,25N и 0,5N и ортофосфорную кислоту в концентрации от 5 до 10%, с помощью каскада дозирующих насосов, поддерживая рН в заданной точке, где соотношение карбоната натрия (20%) в NaOH (0,5N) поддерживается на уровне 1:3.

IV) Условия ферментации

Результаты:

Для питательной среды NMXM-CA, содержащей казаминокислоты, на этапе 100 кДа, выход полисахарида составляет между 500 и 650 мг/л с минимальной загрузкой на которой был проведен сбор клеток тогда, когда значение OD достигает 50% наивысшего значения OD культуры. В то время как для среды NMXM-SP, содержащей соевый пептон, на этапе 100 кДа, выход полисахарида был сравнительно низким, то есть между 450 и 500 мг/л с большей загрузкой примесей.

V) Сбор клеток и Инактивация

Ферментацию прекращают, как только наблюдается падение оптической плотности, после чего проводят инактивацию с использованием 1% формальдегида в течение 2 ч при 37°С.Далее температуру снижают со скоростью 10°С и инкубируют в течение 30 минут. Сбор клеток выгружают и центрифугируют при 14,500 g в течение 45 минут.

Затем супернатант подвергают фильтрации с размером пор 0.2 мкм с последующей диафильтрацией 100 кДа (10-15 раз) и дополнительно концентрируют с помощью воды для инъекций. Затем проводят стерилизующую фильтрацию с размером пор 0,2 мкм.

VI) Очистка Men X полисахарида

Протокол 1:

Добавляют 0,5% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с кассетной мембраной 100 кДа. Затем 10% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0.05М NaCl при 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.

Протокол 2:

Добавляют 1,5% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с 100 кДа кассетной мембраной. Затем 6% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0,05М NaCI, при температуре 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Затем осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.

Протокол 3:

Добавляют 1% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с 100 кДа кассетной мембраной. Затем 3% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0,05М NaCl, при температуре 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Затем осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.

Протокол 1, имеющий низкий DOC, указывает на неэффективность удаления загрязняющих веществ (белок/нуклеиновые кислоты), также как и высокие концентрации СТАВ в конечном комплексе СТАВ-полисахарид, который не был легко отделим.

Протокол 2, имеющий более высокий DOC, указывает на более вязкие растворы полисахарида, что таким образом, делает его трудным для обработки ТГФ. К тому же, промежуточная концентрация СТАВ в комплексе СТАВ-полисахарид указывает на то, что он не является легко отделяемым.

Протокол 3, имеющий промежуточный DOC и меньшую концентрацию СТАВ был установлен, как более эффективный, чем Протоколы 1/2 и, следовательно, был завершен очисткой N.meningitidis X полисахарида.

Очищенный N. meningitidis, X полисахарид полученный в соответствии с Протоколом 3, был протестирован на наличие загрязнений, таких как белок, нуклеиновые кислоты, эндотоксин и на определение молекулярного размера. Несмотря на то, что ВОЗ спецификации/рекомендации для МеnХ полисахарида не были доступны, очищенный N. meningitidis X полисахарид был найден удовлетворяющим спецификациям ВОЗ, уже установленным для аналогичного фосфодиэфира, содержащего полисахарид, т.е. N.meningitidis А.

Кроме того, сравнение отнесения 1Н, 13С, 31Р спектров ЯМР для SIIL's МеnХ полисахарида с недавно опубликованными Х-отнесенными ЯМР данными (Vaccine 30,2012, 5812-5823 & Vaccine 30, 2012, 6409-6415) подтвердило структурную идентичность SllL's МеnХ полисахарида.

Результаты:

Оба, и NMXM-CA NMXM-SP, основанные серии Men X полисахарида были обнаружены как соответствующие спецификациям ВОЗ, установленным для N. meningitidis А полисахарида.

Для NMXM-CA среды, содержащей казаминокислоту, на заключительном этапе очистки, выделение на стадии очистки составляет между 60 и 65%, выход полисахарида составляет между 350 и 500 мг/л с минимальной нагрузкой примесей, в случае когда сбор клеток проводили когда OD культуры достигает 50% наивысшего значения OD культуры. В то время как для NMXM-SP среды, содержащей соевый пептон, на заключительном этапе очистки, выделение на стадии очистки для полисахарида, также выход полисахарида были сравнительно низкими, наряду с большей нагрузкой примесей.

Описанный выше высокий выход МеnХ полисахарида был достигнут без использования каких-либо дополнительных хроматографических методов, тем самым демонстрируя, что описанный выше протокол очистки является надежным и экономически эффективным.

VII) Получение лиофилизованных, иммуногенных конъюгатов MenX полисахарид-белок:

Моновалентные или поливалентные иммуногенные композиции, содержащие полисахарид N.meningitidis Х-столбнячный анатоксин могут находится в буферизированной жидкой форме или в лиофилизованной форме.

Предпочтительно, указанный конъюгат полисахарид-белок может быть лиофилизирован, как описано ранее в заявке США 2013/0209503, где композиция может быть стабильной, по крайней мере, 6 месяцев при 40°С и содержание свободного полисахарида может быть меньше, чем 11% вес/вес.

Полисахарид MenX по настоящему изобретению может быть использован для приготовления иммуногенных поливалентных менингококковых конъюгированных с белком полисахаридных композиции, содержащих капсульный сахарид из серогрупп X и, по крайней мере, один капсульный сахарид из А, С, W135 и Y, как описано выше в WO 2013114268.

Ввиду многих возможных воплощений, к которым могут быть применены принципы раскрытого изобретения, следует признать, что проиллюстрированные воплощения являются только предпочтительными примерами изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Скорее, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения. Также заявляется в качестве настоящего изобретения все, что подпадает под область и дух этих пунктов формулы изобретения.

1. Способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitides серогруппы X с выходом от 300 до 550 мг/л, включающий следующие стадии:

(a) приготовление водной ферментационной питательной среды, содержащей казаминокислоту;

(b) инокуляцию ферментационной питательной среды с бактериями Neisseria meningitides X, имеющей оптическую плотность от 0,8 до 1,2;

(c) непрерывную экспоненциальную подпитку с помощью раствора питательной среды, содержащего декстрозу, глутамат натрия, аминокислоты и соли, со скоростью добавления, колеблющейся между 10 мл/ч/1.5 л и 60 мл/ч/1.5 л, начиная с оптической плотности OD между 3 и 4;

(d) инкубирование инокулированной ферментационной питательной среды в контролируемых условиях рН, температуры и процента растворенного кислорода;

(e) сбор клеток капсульного сахарида, полученного на стадии (d), когда оптическая плотность при 590 нм составляет менее 60% от наивысшего значения OD культуры;

(f) очистку капсульного сахарида, полученного на стадии (е) без использования хроматографии, состоящую из следующих стадий:

I. удаление белковых и эндотоксиновых загрязнений с использованием дезоксихолата в концентрации от 1 до 1.2% в комбинации с хелатирующим агентом в концентрации от 1.5 до 3 мМ и спиртом в концентрации от 40 до 50%;

II. добавление ацетата натрия в концентрации от 4 до 6% для удаления нуклеиновых кислот;

III. добавление цетилтриметиламмонний бромида в концентрации от 3 до 4% для связывания полисахарида и примесей;

IV. осаждение полисахарида из катионного комплекса детергент-полисахарид, используя хлорид натрия в концентрации 0.05 М в присутствии 96% спирта;

V. удаление белковых и нуклеиновокислотных примесей путем промывания осадка с помощью 45% спирта в присутствии хлорида натрия в концентрации 0.4 М;

VI. селективное осаждение полисахарида с использованием 96% спирта;

VII. растворение полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком;

(g) необязательное концентрирование очищенного капсульного полисахарида, полученного на стадии (f).

2. Способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitides серогруппы X по п.1, в котором:

(a) указанный капсульный полисахарид продуцируют бактерии, выбранные из N.meningitidis X штаммов М8210, М9601, М9591, М9592, М9554, М2526, 247Х и 5967 (ST 750);

(b) указанная ферментационная питательная среда включает в себя:

I. казаминокислоты в количестве от 5 г/л до 20 г/л, от 0.14 г/л до 0.19 г/л хлорида аммония, от 10 г/л до 11 г/л декстрозы, от 5.8 г/л до 6 г/л хлорида натрия, от 0.9 г/л до 1 г/л сульфата калия, от 3.8 г/л до 4 г/л двухосновного фосфата калия, от 4.8 г/л до 5 г/л глутаминовой кислоты, от 0.2 г/л до 0.3 г/л L-аргинина, от 0.4 г/л до 0.5 г/л L-серина, от 0.24 г/л до 0.25 г/л L-цистеина, от 0.18 г/л до 0.19 г/л хлорида магния, 0.02 г/л хлорида кальция и 0.002 г/л сульфата железа, таким образом, что концентрация компонентов в среде может изменяться в пределах ±10% или

II. казаминокислоты в количестве от 5 г/л до 10 г/л, от 0.14 г/л до 0.17 г/л хлорида аммония, от 10 г/л до 11 г/л декстрозы, от 5.8 г/л до 6 г/л хлорида натрия, от 0.9 г/л до 1 г/л сульфата калия, от 3.8 г/л до 4 г/л двухосновного фосфата калия, от 4.8 г/л до 5 г/л глутаминовой кислоты, от 0.2 г/л до 0.3 г/л L-аргинина, от 0.4 г/л до 0.5 г/л L-серина, от 0.24 г/л до 0.25 г/л L-цистеина, от 0.18 г/л до 0.19 г/л хлорида магния, 0.02 г/л хлорида кальция и 0.002 г/л сульфата железа, таким образом, что концентрация компонентов в среде может изменяться в пределах ±10%;

(c) указанная инокуляция ферментационной питательной среды происходит с помощью семенного инокулята, имеющего оптическую плотность от 0.8 до 1;

(d) указанная непрерывная экспоненциальная подпитка начинается с инициирующего добавления питательной среды со скоростью 10 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока значение OD при 590 нм не будет между 3 и 4, которая градиентно увеличивается до 30 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока OD культуры не станет наивысшей, и затем поддерживается при 60 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока OD культуры не достигнет 50% от наивысшего значения OD, после чего культура может быть собрана;

(e) указанный раствор для подпитки включает от 72 до 76 г/л декстрозы, от 38 г/л до 42 г/л глутамата натрия, от 2.8 г/л до 3.2 г/л L-аргинина, от 2.8 г/л до 3.2 г/л L-серина, от 1.9 г/л до 2.1 г/л L-цистеина, от 1.9 г/л до 2 г/л хлорида магния, от 0.13 г/л до 0.15 г/л хлорида кальция и 0.02 г/л сульфата железа, таким образом, что концентрация компонентов в питательном растворе может изменяться в пределах ±10%

(f) указанное инкубирование осуществляют:

I. при температуре от 36°С до 37°С, при значении рН 7-7.2, от 350 до 500 об/мин, с процентом растворенного кислорода от 15 до 25%, с газовым потоком от 1 до 1.5, воздухом от 0 до 100% и кислородом от 0 до 100%, в течение от 7 до 10 часов, или

II. при температуре 36°С, при значении рН 7.2, при перемешивании приблизительно 400 об/мин, с процентом растворенного кислорода 25%, с газовым потоком от 1 до 1.5, содержание воздуха от 0 до 100% и кислорода от 0 до 100% в течение от 8 до 9 часов;

(g) указанная инактивация осуществляется с использованием 1% формальдегида в течение от 1 до 2 часов при температуре 37°С, с последующим инкубированием при 10°С в течение 30 минут;

(h) указанный сбор клеток осуществляют путем

I. центрифугирования при 14500 g в течение 45 минут, чтобы удалить все остатки клеток;

II. полученный супернатант фильтруют до 0.2 мк с последующей 100 кДа диафильтрацией и концентрируют с водой для инъекций (WFI);

и (i) указанный процесс осуществляют в культуральной системе с непрерывной подпиткой.

3. Способ по п.1, где очистка включает следующие стадии:

(a) удаление белковых и эндотоксиновых загрязнений с использованием дезоксихолата в концентрации 1% в комбинации с этилендиаминтетрауксусной кислотой в концентрации 2 мМ и спиртом в концентрации 40%;

(b) добавление от 4 до 6% ацетата натрия для удаления нуклеиновых кислот;

(c) добавление цетилтриметиламмонийбромида в концентрации 3% для связывания полисахарида и примесей;

(d) осаждение полисахарида из комплекса цетилтриметиламмонийбромид-полисахарид с использованием хлорида натрия в концентрации 0.05М в присутствии 96% этанола;

(e) удаление белковых и нуклеиновокислых примесей путем промывания осадка с помощью этанола в концентрации 45% в присутствии хлорида натрия в концентрации 0.4 М;

(f) селективное осаждение полисахарида с использованием 96% этанола;

(g) растворение полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком; и

отличающийся тем, что в указанном процессе очистки не используют какую-либо хроматографию.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию (h), где очищенный N.meningitidis X полисахарид доводят до среднего размера между 100 и 150 кДа путем использования системы для разрушения клеток высокого давления.

5. Способ получения конъюгата белок-сахарид, включающий в себя: получение капсульного полисахарида Neisseria meningitides серогруппы X способом по п.1, дополнительно включающим стадию (h), где очищенный N.meningitidis X полисахарид доводят до среднего размера между 100 и 150 кДа путем использования системы для разрушения клеток высокого давления, с последующим проведением стадии (i), на которой указанный полисахарид уменьшенного размера конъюгируют с белком-носителем.

6. Способ по п.5, где указанный N. meningitidis X сахарид конъюгируют с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С ТТ, белка D, ОМРС и пневмолизина.

7. Способ по п.5, где указанный N. meningitidis X сахарид конъюгируют с белком-носителем через гетеро- или гомо-бифункциональный линкер с помощью конъюгирования путем химического цианилирования.

8. Способ по п.7, где указанный цианилирующий реагент выбирают из группы 1-циано-4-пирролидинопиридиния тетрафторбората (СРРТ), 1-циано-имидазола (1-Cl), 1-цианобензотриазола (1-СВТ), или 2-цианопиридазин-3(2Н)она (2-СРО), или их функционального производного, или их модификации.

9. Иммуногенная композиция для изготовления вакцин против менингита, содержащая конъюгат белок-сахарид, полученный по п.5, где конъюгат белок-сахарид находится в лиофилизованной форме.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биохимии. Штамм бактерий Tsukamurella tyrosinosolvens PS2 обладает способностью утилизировать алифатические углеводороды и продуцировать биологически поверхностно-активные вещества.
Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования и выращивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus С1 обладает способностью продуцировать этанол.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для биоиндикации вод, загрязненных поверхностно-активными веществами (ПАВ). Способ предусматривает инкубацию рачков Epischura baicalensis Sars отряда Copepoda в исследуемом и контрольном растворах с последующим просмотром их под микроскопом.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и для стимуляции их роста и урожайности. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12464.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии сельскохозяйственных животных, вызываемой бактериями Clostridium perfringens (Cl.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Диагностический штамм вируса гриппа RN2/66-human A(H7N2) получен путем скрещивания вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) с холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/66/395(Н2N2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-12683, продуцент ксилоглюканазы семейства GH12, кодируемой геном AsCeGH12b (SEQ ID NO 1), клонированным из Aspergillus cervinus ВКПМ F-612.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, обладающий высокоактивной продуктивностью капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7884.

Настоящее изобретение относится к способу переработки лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает подготовку лигноцеллюлозной биомассы, которая содержит первую твердую фракцию, содержащую целлюлозу и лигнин, первую жидкую фракцию; отделение указанной первой твердой фракции от указанной первой жидкой фракции; смешивание указанной первой твердой фракции с водой с образованием суспензии; где указанная суспензия имеет рН от рН 3,0 до рН 4,5; повышение указанного рН указанной суспензии на величину от 0,5 единицы рН до 5,0 единиц рН, чтобы получить суспензию со скорректированным рН; где указанная суспензия со скорректированным рН имеет рН от рН 5,0 до рН 8,0; необязательно, предварительное нагревание указанной суспензии со скорректированным рН до температуры, которая ниже критической точки воды; приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с текучим веществом для второй реакции, содержащим сверхкритическое или близкое к сверхкритическому текучее вещество, с получением реакционной смеси, которая содержит вторую твердую фракцию, содержащую лигнин; и вторую жидкую фракцию, содержащую растворимый С6-сахарид, выбранный из группы, состоящей из целлоолигосахаридов, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей; где указанное сверхкритическое или близкое к критическому текучее вещество содержит воду и, необязательно, СО2 при температуре, равной 300°С или выше, и давлении, по меньшей мере достаточно высоком для того, чтобы гарантировать, что все текучее вещество для второй реакции находится в жидкой фазе или сверхкритической фазе; и где указанное приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с указанным текучим веществом для второй реакции имеет длительность больше чем 2 секунды; необязательно, снижение температуры указанной реакционной смеси до температуры ниже 280°С; и необязательно, гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием С6-сахарида, выбранного из группы, состоящей из С6-олигосахарида, имеющего звенья с меньшей степенью полимеризации, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Настоящее изобретение относится к способу гидролиза лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает предоставление фракционированной лигноцеллюлозной биомассы, содержащей фракцию твердых веществ, содержащую необязательно нерастворимый С5-олигосахарид, целлюлозу и лигнин, и первую жидкую фракцию при первой температуре не более 240°С, содержащую растворимые C5-сахариды, выбранные из C5-олигосахаридов, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; контактирование указанной первой жидкой фракции с твердым кислотным катализатором с образованием второй жидкой фракции при температуре не более 240°С; где указанная вторая температура меньше, чем указанная первая температура; где указанное контактирование сдвигает молекулярно-массовое распределение указанных растворимых C5-сахаридов к меньшей средней молекулярной массе; необязательно гидролиз указанной второй жидкой фракции с использованием кислоты или фермента с получением C5-сахаридов, выбранных из C5-олигосахаридов, содержащих меньше мономерных звеньев, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; где указанную фракционированную лигноцеллюлозную биомассу получают приведением указанной целлюлозной биомассы в контакт с первой реакционной жидкостью, содержащей горячую воду под давлением и необязательно диоксид углерода; где указанная первая реакционная жидкость дополнительно содержит кислоту, где указанная лигноцеллюлозная биомасса содержит древесину мягких пород; где указанная первая реакционная жидкость находится при температуре менее 100°С под давлением, достаточным для поддержания указываемой первой реакционной жидкости в жидкой форме.

Настоящее изобретение относится к способам переработки лигноцеллюлозной биомассы. Предложенный способ включает подачу лигноцеллюлозной биомассы, включающей первую твердую фракцию целлюлозы и лигнина и первую жидкую фракцию; необязательно, разделение указанных твердой и жидкой фракций; смешение указанной твердой фракции с водой с образованием пульпы с предварительным нагреванием пульпы до 210°С-240°С при 225-250 бар; контактирование указанной пульпы со второй реакционной жидкостью с образованием второй реакционной смеси, включающей вторую твердую фракцию лигнина и вторую жидкую фракцию растворимого С6 сахарида, выбранного из С6 моносахаридов, С6 олигосахаридов и их смесей; где указанная вторая реакционная жидкость включает сверхкритическую воду и, необязательно, диоксид углерода и находится при температуре, по меньшей мере, 374,2°С и давлении, достаточном для поддержания указанной второй реакционной жидкости в сверхкритическом состоянии; понижение температуры указанной пульпы ниже 140°С; необязательно кислотный гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием композиции, включающей С6 сахарид, выбранный из С6 олигосахарида, имеющего меньшее число элементарных звеньев, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом.

Предложен бактериальный макромолекулярный комплекс для профилактики или лечения воспалительного ревматизма и остеоартрита. Комплекс продуцирован штаммом бактерий Bifidobacterium longum CNCM I-3994.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения сиалированной сахарной цепи.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование симбиотической культуры Medusomyces gisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка.

Предложены жидкая композиция для изготовления хлебобулочных изделий, способ ее получения и ее применение в пищевых производствах. Указанная композиция включает ферментированную(ые) фракцию(и) измельченного зерна, молочнокислые бактерии и необязательно дрожжи, где указанные молочнокислые бактерии выбраны из Leuconostoc или lactobacilli; эндоксиланазу.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения липополисахарида Chlamydia trachomatis.
Изобретение относится к биохимии. Штамм бактерий Tsukamurella tyrosinosolvens PS2 обладает способностью утилизировать алифатические углеводороды и продуцировать биологически поверхностно-активные вещества.
Наверх