Питательная среда плотная для культивирования и сбора биомассы чумного микроба вакцинного штамма y.pestis ev



Владельцы патента RU 2626568:

Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования и выращивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, соль Мора, агар микробиологический и питьевую воду в заданных соотношениях ингредиентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы вакцинного штамма чумного микроба ЕВ. 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы Y.pestis EV и может быть использована в получении достаточного количества биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.

Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащего аминный азот 0,12%; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернистокислый 0,04; кислота соляная (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; питьевая вода до 1 литра (Промышленный регламент на производство, вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. ПР 01897080-09-09. Регистрационный №2134-09. 2009 г. 253 с.).

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению относится питательная среда, состоящая из смеси двух гидролизатов в отношении 1:2 для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат кукурузного экстракта, содержащего аминный азот 0,45%; гидролизат казеиновый, содержащий аминный азот 0,45%, - 85; натрий хлористый 3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0; натрий сернистокислый 0,4; молибденовый аммоний 0,5; агар микробиологический 30,0; pH 7,0±0,2 питьевая вода до 1 литра. Смесь тщательно перемешивают и выливают в загрузочный люк установки для сушки белковых гидролизатов. Высушивание ведут при температуре (80±2)°C, под вакуумом не менее 0,6 атм (НПО» Аллерген» г. Ставрополь). Высушенный агар измельчают керамическими шарами в сушильной камере в течение 2,5-3 ч, периодически (каждые 15-20 мин), меняя ее положение (от горизонтального до предельного наклона влево и право) для перемешивания. (Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук., Саратов 1994 г. Гюлушанян К.С.)

Недостатком данной среды является ее сложность и громоздкость.

Целью изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV на белковой основе из растительного сырья - ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток, а также значительный экономический эффект.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда плотная в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный), натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, питьевую воду, с добавлением в среду стимулирующей добавки - соли Мора при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат кукурузного экстракта
(сгущенный) 40,0-56,0
Натрий хлористый 4,0-6,0
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0
Соль Мора 0,08-0,12
Агар микробиологический 15,0-19,0
Питьевая вода до 1 л

В качестве исходного сырья используют кукурузный экстракт-(сгущенный), содержащий в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), экстракт является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков и витаминов. Кроме того, он богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, %: фосфор 0,25; натрий 0,04; кальций 0,59; калий 0,36; магний 0,12; сера 0,11; хлор 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидин 72,0; лейцин 72,0; изолейцин 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизин 0,96; метионин 0,56; триптофан 0,22; метионин + цистин 0,27, и витаминами, мг/кг: каротин (витамин A) 8,0; B1 4,0; B2 1,0; B3 (пантотеновая кислота) 6,5; B4 (холин) 400; B5 17; B6 2,9. Как известно (И.В. Петрухин, 1989), кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как изолейцин, лейцин, аргинин, фенилаланин. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.А. Газов, X.С. Морган, / США / 1989).

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2 замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).

Соль Мора ГОСТ 4208-72. Двойная сернокислая соль закиси железа и аммония. Не горюча, не ядовита. Партия 14, дата изготовления октябрь 2014 г. Срок годности 3 года. Поставщиком соли Мора является ООО «НПФ Невский химик» Санкт-Петербург (Нева реактив).

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г.

Питьевая вода-ГОСТ Р 51232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям.

Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузного экстракта (сгущенного).

Способ приготовления питательной основы для выращивания чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV заключается в следующем: кукурузный экстракт (сгущенный) в количестве 4,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 24 л питьевой воды кипятят в течение 5 минут, устанавливают pH до 8,2 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 52 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 46°C. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 30,0 на 1 л, устанавливают pH до 8,2-8,5, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 46°C в течение 10 сут. В первые 24 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составил 1120 мг %, а сухой остаток соответственно 25,5%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°C.

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для культивирования чумного микроба и выращивания вакцинного штамма Y. pestis EV готовят следующим способом: ферментативный гидролизат, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% 48 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0; агар микробиологический 17,0; питьевая вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают pH 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулирующую добавку: соль Мора в концентрации соответственно 0,1 г/л, разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°C, затем скашивают.

Перед приготовлением производственной культуры проводят анимализацию вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV путем пассажа через организм морской свинки. Все стерильные бактериологические пипетки перед работой хранят в условиях холодильника при (4±1)°C. Ампулу с сухой культурой штамма EV вскрывают с соблюдением правил асептики, разводят ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера pH 7,1±0,1 (исходная культура или культура I генерации). Одновременно контролируют ее культурально-морфологические и ферментативные свойства, высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, и высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,3±0,1. Также культуру высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,1±0,1, которые в дальнейшем используют последовательного рассева с целью получения изолированных колоний. Все чашки Петри с посевами помещают на (48±2) ч для выращивания в термостат при температуре (27±1)°C. В том случае, если культура без диссоциации, т.е. морфология колоний типична для чумного микроба и вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип, исходную культуру I генерации пересевают в бактериологические пробирки (культура II генерации). Посевы инкубируют (24±1) ч при (27±1)°C. Через сутки пробирки с культурой II генерации используют для культивирования вакцинного штамма чумного микроба на скошенные поверхности во флаконы (матрацы). В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, pH 7,2±0,1 при температуре (27±1)°C. Затем готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед. по оптическому стандартного образца мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×109 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1×1 из 1,0×109 доводят содержания в 1 мл 500 млн. м.к. из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°C.

Учет результатов проводят через (48±2) ч. После чего производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствором натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отсасывания биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности.

Методика подсчета количества микробных клеток

Питательные среды из ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для определения количества живых микробных клеток должны обеспечивать, без добавления стимуляторов, рост микробов вакцинного штамма Y. pestis EV на всех чашках Петри с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10МЕ. В качестве стимулятора роста, к питательным средам перед розливом их в чашки Петри, добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°C. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10-1). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлористого, начиная с 10-1 по (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида, заканчивая (10-7) и (10-8). Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10-7) и (10-8) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (pH 7,2±0,1) и выдерживают при температуре (27±1)°C 2-3 суток. (Промышленный регламент ПР на производство Вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекционного накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-09) от 11.12.2009 г.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 40,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2- замещенный 12-водный 3,0; соль Мора 0,08; агар микробиологический 15,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составляет 13 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 59 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 51, после сушки получено 20% живых микробных клеток.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 48,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; соль Мора 0,1; агар микробиологический 17,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 15 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 100 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 86,6, после сушки получено 43,8% живых микробных клеток.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 56,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 5,0; соль Мора 0,12; агар микробиологический 19,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 14 мл взвеси, в 0.1 мл, которой получено 65 млрд. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч соответственно 65, после сушки получено 23% живых микробных клеток.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), может применяться для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток и значительный экономический эффект при замене мясных питательных основ на кукурузные. Рентабельность среды составляет 31%.

Питательная среда плотная для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV, включающая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный и дополнительно содержит в качестве стимулирующей добавки соль Мора при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат кукурузного экстракта
сгущенный 40,0-56,0
Натрий хлористый 4,0-6,0
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0
Соль Мора 0,08-0,12
Агар микробиологический 15,0-19,0
Питьевая вода до 1 л



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus С1 обладает способностью продуцировать этанол.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для биоиндикации вод, загрязненных поверхностно-активными веществами (ПАВ). Способ предусматривает инкубацию рачков Epischura baicalensis Sars отряда Copepoda в исследуемом и контрольном растворах с последующим просмотром их под микроскопом.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и для стимуляции их роста и урожайности. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12464.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии сельскохозяйственных животных, вызываемой бактериями Clostridium perfringens (Cl.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Диагностический штамм вируса гриппа RN2/66-human A(H7N2) получен путем скрещивания вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) с холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/66/395(Н2N2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-12683, продуцент ксилоглюканазы семейства GH12, кодируемой геном AsCeGH12b (SEQ ID NO 1), клонированным из Aspergillus cervinus ВКПМ F-612.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е.
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охраны окружающей среды. Штамм бактерий Salinibacterium amurskyense ARC 14 обладает способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов в водной среде.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Nocardia coeliaca ARC 12 обладает нефтеокисляющей способностью.
Изобретение относится к биотехнологии и клинической микробиологии. Предложен способ определения чувствительности микроорганизмов полости рта в биопленке к антимикробным средствам.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии, и касается способа оценки эффективности фаготерапии при лечении инфекционных заболеваний.

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного обнаружения патогенных маннитположительных стафилококков в пищевых продуктах, клиническом материале и других объектах.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ идентификации микроводорослей.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ выявления микобактерий с поверхностей предусматривает сбор исследуемого материала с поверхности смоченным физиологическим раствором тампоном и обработку его дезинфицирующим средством «Септустин» в виде 1%-ного водного раствора.

Изобретение относится к способу высокоэффективного отбора микроорганизма, имеющего антагонистическую активность против грибкового или бактериального патогена растений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлено применение штамма Rickettsia raoultii «23/95-Еланда» генотипа DnS28, депонированного во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ НИИЭМ им.

Изобретение относится к области микробиологии и медицины. Способ представлен диагностикой состояния микробиоты кишечника на фоне эрадикационной терапии Helicobacter pylori, заключающейся в установлении нуклеотидных последовательностей отдельных микроорганизмов микробиоты кишечника пациента по бактериальному гену 16S рРНК, на основании которых рассчитывают состав, количество видов и индекс разнообразия Шеннона H микробного сообщества до, в процессе и после эрадикации.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает следующее.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает забор исследуемого материала, посев его на селективные питательные среды, инкубирование посевов при заданных параметрах с последующей идентификацией выросших колоний.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Paenibacillus mucilaginosus, стимулирующий рост растений и обладающий повышенной способностью к синтезу бактерицинов с широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12259.

Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования и выращивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, соль Мора, агар микробиологический и питьевую воду в заданных соотношениях ингредиентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы вакцинного штамма чумного микроба ЕВ. 3 пр.

Наверх