Высокопродуктивный способ получения ослабленных штаммов salmonella

Настоящее изобретение касается способа выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, несущего мутацию в гене galE, приводящую к потере функции, и содержащего по меньшей мере одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей эукариотическую кассету экспрессии. Изобретение включает стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном исходном значении рН в масштабе ферментации, в котором глюкозу не добавляют в среду в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы, где исходное значение рН составляет от 5 до менее чем 9, и где объем среды составляет по меньшей мере примерно 10 л. Изобретение может быть использовано для промышленного крупномасштабного получения ДНК-вакцин на основе ослабленных штаммов Salmonella. 10 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому способу выращивания ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi, лишенных активности эпимеразы галактозы и несущих рекомбинантную молекулу ДНК. Способ включает в себя стадию культивирования указанного штамма Salmonella typhi без добавления глюкозы в среду в процессе ферментации, где исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы. Кроме того, изобретение относится к ослабленным мутантным штаммам Salmonella typhi, которые можно получить с помощью указанного способа, и к ослабленному мутантному штамму Salmonella typhi, содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок рецептора VEGF, для применения в качестве вакцины.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Среди разных подходов к разработке вакцин одним из самых перспективных является применение живых бактериальных вакцин, так как они имитируют путь проникновения в организм многих патогенов и способны вызывать эффективный гуморальный и клеточный иммунный ответ как на уровне системных компартментов, так и на уровне компартментов слизистой оболочки. Живые бактериальные вакцины можно вводить пероральным или назальным способом, преимущество которого заключается в простоте и безопасности по сравнению с парентеральным введением. Затраты на серийное производство являются относительно низкими, а композиции живых бактериальных вакцин обладают высокой стабильностью. Ослабление бактерий можно осуществлять путем удаления разных генов, включающих в себя гены вирулентности, регуляторные гены и метаболические гены. Ослабленные бактериальные вакцины можно использовать не только для индукции иммунитета по отношению к соответствующему патогенному штамму, но и для доставки введенных в них одного или нескольких гетерологичных антигенов.

Ослабленные производные Salmonella enterica представляют собой привлекательные средства доставки гетерологичных антигенов к иммунной системе млекопитающих, поскольку штаммы S. Enterica, которые потенциально можно доставлять путем иммунизации через слизистую оболочку, обладают способностью внедряться в ткани хозяина и сохраняться там, продолжая продуцировать гетерологичный антиген. Кроме того, штаммы Salmonella вызывают интенсивные гуморальные и клеточные иммунные ответы на уровне как системных компартментов, так и компартментов слизистой оболочки.

Показано, что несколько штаммов Salmonella typhimurium, ослабленных мутациями aro, представляют собой безопасные и эффективные средства доставки гетерологичных антигенов животным моделям.

Способы доставки конструкций ДНК, кодирующих гетерологичные антигены, в частности, белки рецепторов VEGF, в клетки-мишени мыши с помощью живых ослабленных штаммов Salmonella typhimurium описаны в WO 03/073995.

Niethammer et al. (Nature Medicine 2002, 8 (12), 1369) показали, что ослабленный штамм S. Typhimurium aroA SL7207, несущий вектор экспрессии, кодирующий рецептор 2 мышиного фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-2 или FLK-1), который необходим для опухолевого ангиогенеза, можно использовать в качестве противораковой вакцины.

Однако существует только один ослабленный серотипический штамм Salmonella enterica, а именно серотип Salmonella enterica typhi Ty21 (короткое обозначение: С. typhi Ty21a), разрешенный для введения в организм человека.

Данная хорошо переносимая живая пероральная вакцина против брюшного тифа, которую получают путем химического мутагенеза изолята вирулентных бактерий дикого типа С. typhi Ty2, несет мутацию в гене ga/E, приводящую к потере функции, а также другие менее определенные мутации. После подтверждения эффективности и безопасности указанной вакцины в эксплуатационных испытаниях во многих странах на нее была выдана лицензия как на тифозную вакцину.

Существует большой спрос на живые ослабленные бактериальные векторы как средства доставки гетерологичных антигенов, особенно раковых антигенов, которые являются безопасными при применении в организме человека. Применение такого ослабленного бактериального вектора в качестве ДНК-вакцины также способствует эффективному, высокопроизводительному культивированию ослабленного штамма бактерий, трансформированных указанной гетерологичной антигенной ДНК. Трансформация бактериальных штаммов конструкциями рекомбинантной ДНК часто приводит к снижению роста клеток. Таким образом, зачастую требуется усовершенствовать процесс, предпочтительно крупномасштабного, культивирования с получением жизнеспособных и функционально активных клеток с высоким выходом.

ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является усовершенствование способов выращивания ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi предшествующего уровня техники. В частности, целью настоящего изобретения является разработка эффективного способа культивирования, позволяющего достичь высокого выхода жизнеспособных бактериальных клеток, которые несут рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую гетерологичный антиген. Такой способ и ослабленные мутантные штаммы Salmonella typhi, полученные с помощью такого способа, могут способствовать удовлетворению настоятельной потребности в безопасных ослабленных штаммах Salmonella как ДНК-вакцинах, предназначенных для применения в организме человека. Такой способ, в частности, можно использовать для промышленного крупномасштабного получения ДНК-вакцин на основе ослабленных штаммов Salmonella.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что выход клеток ослабленного штамма Salmonella typhi, утратившего активность эпимеразы галактозы, можно значительно увеличить путем уменьшения количества глюкозы в среде до нуля перед достижением стационарной фазы. Авторы настоящего изобретения демонстрируют, что добавление глюкозы к среде в процессе ферментации не приводит к увеличению клеточной массы/повышению значений оптической плотности. Напротив, отсутствие добавления глюкозы в процессе культивирования ослабленного штамма Salmonella приводит к получению значений оптической плотности примерно от 6 до 8 в начале стационарной фазы роста клеток, тогда как идентичное культивирование в присутствии глюкозы на уровне, составляющем примерно от 1 до 4 г/л, предпочтительно примерно от 2 до 3 г/л (например, достигнутого в результате последовательной пульсирующей подачи среды, содержащей глюкозу), приводит к получению значений оптической плотности, составляющих примерно лишь от 3 до 5,5.

Способ выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi настоящего изобретения также позволяет получать клетки, морфология которых отличается от морфологии клеток, культивируемых в присутствии глюкозы. Клетки Salmonella typhi, выращенные в отсутствие глюкозы, меньше и короче, чем клетки, культивируемые в присутствии глюкозы. Однако указанные морфологически отличающиеся клетки, как и клетки, выращенные в среде, содержащей глюкозу, обладают полной биологической активностью и не имеют тенденции к лизису клеток.

Увеличение выхода клеток, достигнутое в результате пропуска добавления глюкозы в процессе культивирования по способу настоящего изобретения, наблюдается независимо от того, несет ли выбранный ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующей гетерологичный антиген (такую как pcDNA3.1-FLK1 или полученная из нее плазмида, такая как pVAX10.VR2-1) или нет (пустой ослабленный штамм).

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, утратившего активность эпимеразы галактозы и содержащего, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей экспрессионную кассету, где способ включает в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном исходном значении рН, в масштабе ферментации, где количество глюкозы в среде в процессе ферментации регулируют таким образом, чтобы оно снизилось до нуля перед достижением стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления глюкозу не добавляют к среде в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления указанный ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21a.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии. В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF. В конкретном варианте осуществления белок рецептора VEGF может быть выбран из группы, состоящей из человеческого VEGFR-2 и его гомолога, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%. В предпочтительном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описание которой можно найти в SEQ ID NO 1.

В конкретном варианте осуществления забуференная среда содержит пептон неживотного происхождения. В предпочтительном варианте осуществления указанная забуференная среда представляет собой трипсиновый соевый бульон (TSB) неживотного происхождения.

В конкретном варианте осуществления объем среды составляет, по меньшей мере, примерно 10 л, более предпочтительно примерно от 10 л до 10000 л, более предпочтительно примерно от 30 л до 1000 л, наиболее предпочтительно примерно от 100 л до 500 л.

В конкретном варианте осуществления исходная концентрация глюкозы равна концентрации глюкозы в минимальной среде для бактерий или меньше данной концентрации, в частности, исходная концентрация глюкозы составляет примерно от 0 г/л до 4 г/л.

В конкретном варианте осуществления исходное значение рН находится в диапазоне примерно от 5 до менее чем примерно 9, в частности примерно от 6 до 8, более предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5.

В конкретном варианте осуществления значение рН в течение указанного периода культивирования доводят до значения, находящегося в диапазоне примерно от 6 до 8, в частности до значения, находящегося в диапазоне примерно от 6,5 до 7,5.

В конкретном варианте осуществления процесс роста отслеживают путем измерения оптической плотности (OD), в частности, путем мониторинга оптической плотности культуры in-situ, или путем отбора проб и измерения оптической плотности образцов.

В другом конкретном варианте осуществления процесс роста отслеживают путем измерения плотности клеток, в частности, с помощью микроскопа, или путем измерения электрического сопротивления, или с помощью проточной цитометрии.

В другом конкретном варианте осуществления процесс роста отслеживают путем определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в результате отбора проб и нанесения их на чашки с агаром.

В конкретном варианте осуществления клетки собирают до достижения значения оптической плотности, равного примерно 6, в частности, при оптической плотности, находящейся в диапазоне примерно от 5 до 6.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21a, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, pMB1 ori и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2, под контролем промотера CMV. В конкретном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к ослабленному мутантному штамму Salmonella typhi, лишенному активности эпимеразы галактозы и содержащему, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, которую можно получить с помощью способа выращивания штамма, включающего в себя стадию культивирования штамма в забуференной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном значении рН в масштабе ферментации, где количество глюкозы в среде в процессе ферментации регулируют таким образом, чтобы оно уменьшилось до нуля до достижения стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления глюкозу не добавляют в среду в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы исчерпывается до достижения стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую белок рецептора VEGF. В конкретном варианте осуществления, эукариотическая кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF, выбранный из группы, состоящей из человеческого VEGFR-2 и его гомолога, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%. В конкретном варианте осуществления, человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм представляет собой Salmonella typhi Ty21, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, pMB1 Ori и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующей человеческого VEGFR-2 под контролем промотора CMV. В конкретном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к ослабленному мутантному штамму Salmonella typhi Ty21a, содержащему, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, которая содержит эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую белок рецептора VEGF, где указанный штамм предназначен для применения в качестве вакцины.

В некоторых вариантах осуществления белок рецептора VEGF выбран из группы, состоящей из человеческого VEGFR-2 и его гомолога, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%.

В предпочтительном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1.

Тот факт, что с помощью способа настоящего изобретения можно достичь более высоких выходов клеток ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi, имеет важное значение в отношении безопасного и экономического производства коммерческой ДНК-вакцины на основе ослабленного штамма Salmonella, такого как апробированный штамм Salmonella typhi Ty21a. Так, Salmonella typhi Ty21 несущий рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую гетерологичный антиген, такой как экспрессионная плазмида pVAX10.VR2-1, можно культивировать с более высоким выходом, что приводит к повышению выхода ДНК-вакцины, предназначенной для применения в организме человека. Данный способ также соответствует строгим правилам безопасности, которые должны применяться при промышленном получении и культивировании Salmonella, даже в ослабленной версии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нижеследующее подробное описание изобретения и входящие в его объем примеры приведены для облегчения понимания настоящего изобретения.

1) Salmonella typhi, в том числе Salmonella typhi Ty2 дикого типа и ослабленный штамм Salmonella typhi Ty21a

В описанном способе можно использовать любой ослабленный штамм Salmonella typhi. Ослабленный штамм S. typhi Ty21a является активным компонентом Typhoral L®, также известным как Vivotif® (производимый Berna Biotech Ltd., Crucell Company, Switzerland). В настоящее время это единственная лицензированная живая пероральная вакцина против брюшного тифа. Данная вакцина запатентована более чем в 40 странах. Номером разрешения на реализацию Typhoral L® является PL 15747/0001 от 16 декабря 1996 года. Одна доза вакцины содержит, по меньшей мере, 2×10⁹ жизнеспособных колониеобразующих единиц S. typhi Ty21a и, по меньшей мере, 5×10⁹ нежизнеспособных клеток S. typhi Ty21a. Штамм вакцины выращивают в ферментерах при контролируемых условиях в среде, содержащей гидролизат дрожжевого экстракта, кислый гидролизат казеина, глюкозы и галактозы.

Одним из биохимических свойств бактериального штамма Salmonella typhi Ty21a, используемого в соответствии с настоящим изобретением, является неспособность метаболизировать галактозу. Рекомбинантный ослабленный бактериальный штамм также не способен восстанавливать сульфат до сульфида, что отличает его от штамма Salmonella typhi Ty2 дикого типа. Что касается серологических характеристик штамма Salmonella typhi Ty21a, он содержит O9-антиген, представляющий собой полисахарид наружной мембраны бактерий, и не содержит O5-антиген, который, в свою очередь, является характерным компонентом Salmonella typhi Ty2. Опять же, данная серологическая характеристика обосновывает включение соответствующего теста в ряд тестов по идентификации для выпуска серии.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi, выращенный по способу настоящего изобретения, представляет собой Salmonella typhi Ty21a, несущий, по меньшей мере, одну копию ДНК-плазмиды, pVAX10.VR2-1, кодирующей эукариотическую кассету экспрессии человеческого рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR-2). Этот ослабленный мутантный штамм, обозначенный VXM01, можно использовать в качестве пероральной противораковой вакцины.

В соответствии с настоящим изобретением ослабленный штамм Salmonella typhi Ty21 функционирует как носитель бактериальной плазмидной ДНК, кодирующей гетерологичный антиген, представляющий собой рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR-2), при пероральной доставке ДНК-вакцины, обозначаемой VXM01.

Доставка вакцин с использованием технологии плазмидных ДНК инициирует широкий спектр иммунных ответов как в слизистой оболочке, так и системных. Живые реплицирующиеся векторы продуцируют in situ свои собственные иммуномодулирующие факторы, такие как липополисахариды (LPS), что может иметь преимущество по сравнению с другими способами введения, такими как микрокапсуляция. Кроме того, доказано, что использование естественного способа введения имеет преимущество, поскольку многие бактерии, такие как Salmonella, покидают просвет кишечника через М-клетки пейеровых бляшек и мигрируют в конечном итоге в лимфатические узлы и селезенку, что позволяет направлять вакцины в индукционные участки иммунной системы. В настоящее время показано, что вакцинный штамм Salmonella typhi Ty21a имеет превосходный профиль безопасности. После выхода из просвета кишечника через М-клетки бактерии поглощаются фагоцитирующими клетками, такими как макрофаги и дендритные клетки. Указанные клетки активируются патогеном, после чего они начинают дифференцироваться и, возможно, мигрировать в лимфатические узлы и селезенку. Благодаря ослабляющим мутациям бактерии штамма S. typhi Ty21 не способны существовать в указанных фагоцитах и погибают в данный момент времени. В настоящее время отсутствуют доступные данные, свидетельствующие о том, что S. typhi Ty21a способен попадать в кровоток системно. Таким образом, вакцина, содержащая живой ослабленный штамм Salmonella typhi Ty21a, обеспечивает специфическую направленность иммунной системы при проявлении превосходного профиля безопасности.

Живые ослабленные бактериальные носители, несущие ДНК, кодирующую целевые антигены, можно использовать в качестве средств для пероральной доставки указанных антигенов. Живые реплицирующиеся векторы продуцируют in situ свои собственные иммуномодулирующие факторы, такие как липополисахариды (LPS), что может иметь преимущество по сравнению с другими способами введения, такими как микрокапсуляция.

Генетическая иммунизация может иметь преимущество по сравнению с традиционными способами вакцинации. ДНК-мишень, которую можно детектировать в течение длительного периода времени, может действовать как депо антигена. Мотивы последовательностей, присутствующие в некоторых плазмидах, такие как островки GpC, оказывают иммуностимулирующее действие и могут функционировать как адъюванты, способствуя иммуностимуляции благодаря наличию LPS и других бактериальных компонентов.

Как указано выше, рекомбинантные бактерии Salmonella поглощаются фагоцитирующими клетками на выходе из просвета кишечника при посредстве М-клеток. Указанные фагоциты активируются патогенном, начинают дифференцироваться и, возможно, мигрировать в лимфатические узлы и селезенку. В течение данного периода бактерии погибают вследствие ослабляющей мутации и высвобождают плазмидные эукариотические векторы экспрессии с последующим перемещением плазмид в цитозоль при посредстве специфической транспортной системы или в результате истечения из эндосом. Наконец, вектор проникает в ядро, где он транскрибируется, обеспечивая экспрессию антигена в цитозоле клетки-хозяина. Конкретные цитотоксические Т-клетки против гетерологичного антигена, предпочтительно человеческого VEGFR-2, индуцируются активированными клетками, презентирующими антиген (APC).

В конкретном варианте осуществления рекомбинантная молекула ДНК, которую несет штамм Salmonella typhi Ty21a, представляет собой плазмидную ДНК, pVAX10.VR2-1 (7,58 т.о.), содержащую эукариотический предранний промотор цитомегаловируса человека (CMV), обеспечивающий эффективную транскрипцию белка VEGFR-2 в клетке-хозяине, и прокариотический участок начала репликации (ori), отвечающий за размножение в бактериальном хозяине. Коммерчески доступный вектор pcDNA3 (Invitrogen) модифицируют в соответствии с нормативными требованиями, удаляя последовательности, которые не являются необходимыми для репликации в E.coli или для экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, чтобы ограничить число последовательностей ДНК с возможной гомологией по отношению к геному человека и свести к минимуму возможность хромосомной интеграции. Кроме того, ген устойчивости к канамицину заменяют на ген устойчивости к ампициллину. В ослабленном мутантном штамме Salmonella typhi VXM01, полученном по способу настоящего изобретения, высококопийный участок начала репликации pUC плазмиды pVAX1-Flk-1 заменяют на низкокопийный участок начала репликации pBR322 в pVAX10.VR2-1. Низкокопийную модификацию проводят для того, чтобы уменьшить метаболическую нагрузку и сделать конструкцию более стабильной. Конструкция плазмиды pVAX10.VR2-1 подробно изображена на фиг. 2.

2) Рецептор фактора роста эндотелия сосудов

Фактор роста эндотелия сосудов VEGF (Kd 75-760 пМ) является членом семейства шести структурно родственных белков (VEGF-A [также известный как VEGF], -B, -C, -D, -Е и PLGF [плацентарный фактор роста, также известный как PGF или PIGF-2]), которые регулируют рост и дифференцировку нескольких компонентов сосудистой системы, особенно кровеносных и лимфатических сосудов. Роль VEGF в ангиогенезе по-видимому, опосредуется взаимодействием данного белка с VEGFR-2. VEGFR-2, также известный как рецептор, содержащий вставку киназного домена (KDR), имеет длину 1356 аминокислот и молекулярную массу 200-230 кДа и является высокоаффинным рецептором VEGF, а также VEGF-C и VEGF-D. Идентифицированный у человека в результате анализа эндотелиальной кДНК рецепторов тирозинкиназы, VEGFR-2 на 85% идентичен последовательности ранее обнаруженного мышиного VEGFR-2, также известного как фетальная печеночная киназа 1 (Flk-1). VEGFR-2, как правило, экспрессируется в предшественниках эндотелиальных и гематопоэтических клеток, а также в эндотелиальных клетках, образующихся гемопоэтических стволовых клетках и строме пупочного канатика. Однако в спокойной сосудистой сети взрослой особи мРНК VEGFR-2, по-видимому, подвергается понижающей регуляции.

Внеклеточный домен VEGFR-2 содержит 18 потенциальных N-связанных участков гликозилирования. VEGFR-2 первоначально синтезируется в виде белка размером 150 кДа, быстро гликозилируется с образованием промежуточной формы размером 200 кДа и затем дополнительно гликозилируется с меньшей скоростью с получением зрелого белка размером 230 кДа, который экспрессируется на поверхности клетки.

Аминокислотная последовательность человеческого VEGFR-2, кодируемая последовательностью кДНК, клонированной в плазмиде pVAX10.VR2-1, представлена на фиг. 1.

3) Промышленное получение пустого и рекомбинантного Salmonella typhi Ty21a

Процесс промышленного получения ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, проводимый по способу настоящего изобретения, включает в себя культивирование ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi в среде, которая содержит пептон в качестве источника аминокислот и пептидов. Среда, подходящая для применения в способе настоящего изобретения, включает в себя, без ограничения, стандартную среду TSB, а также среду TSB неживотного происхождения. Как стандартная TSB, так и TSB неживотного происхождения содержат 2,5 г/л глюкозы. Как правило, исходное количество глюкозы, присутствующее в TSB или в TSB-подобной среде, более или менее полностью потребляется после 3-5 ч культивирования ослабленного штамма Salmonella typhi, поэтому каждые 3-5 ч нужно добавлять свежую глюкозу, чтобы поддерживать более или менее постоянный уровень глюкозы в питательной среде. Тот факт, что пропуск добавления глюкозы при культивировании ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi, необязательно несущих рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую гетерологичный антиген, приводит к увеличению роста клеток по сравнению с культивированием с добавлением глюкозы является очень неожиданным и позволяет предположить, что отдельные метаболические пути в бактериальных клетках запускаются в отсутствие глюкозы. Описанный эффект также можно наблюдать в том случае, если среда TSB или TSB-подобная среда не содержит глюкозу в начале процесса культивирования. Таким образом, помимо высоких выходов клеток и, как следствие, более высоких выходов конечной ДНК-вакцины, способ настоящего изобретения имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что данный способ является более дешевым и более простым, поскольку стадии добавления глюкозы в процессе ферментации являются необязательными.

Пример способа промышленного получения ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi Ty21a, проводимого в соответствии с настоящим изобретением, описан в нижеследующей таблице 1:

Клетки I (Salmonella typhi Ty21a дикого типа) или клетки II (Salmonella typhi Ty21a - pVAX10.VR2-1) ↓ 2×500 мл TSB + канамицин (500 мкл) (OD600>0,3) ↓ 10×1000мл TSB + канамицин (75 мл) (OD600≥0,5)

Ферментационный объем 100 л) TSB + 0,001% галактозы - 30°С - поток воздуха 100 л/мин (1 vvm) - давление не регулируется - pH 7,0, регулируемое с помощью NaOH - регулятор пенообразования (Corning) - pO2≥40%, регулируемое мешалкой - скорость перемешивания минимум 200 об/мин - отсутствие подачи глюкозы - конечное OD600нм (конец экспоненциальной фазы роста) - Охлаждение, по меньшей мере, до 25°С перед сбором

Фильтрование в перекрестном потоке - 10-кратное концентрирование - замена буфера после 10-кратного концентрирования на раствор, содержащий 15% сахарозы, 0,45% аскорбата, pH 7,2, методом диафильтрации с последующим дополнительным концентрированием до объема, составляющего 1/20 от объема исходного сбора Хранят при 2-8°С до заполнения в течение примерно 24 часов

Более подробно: Все культуры (среда TSB плюс 25 мкг/мл канамицина) инокулируют разными образцами штаммов сальмонеллы (пустой Ty21a и рекомбинантный Ty21a (pVAX10.VR2-1). При получении образцов клеток используют среду TSB, содержащую 2,5-3,0 г/л глюкозы, предпочтительно 2,5 г/л. В одной контрольной среде глюкоза отсутствует. Кроме того, среда содержит канамицин, предпочтительно 25 мг/мл. Культуры инкубируют при 30°C±2°C при встряхивании до достижения оптической плотности OD_600нм>0,1. Другие подробности описаны в разделе примеры.

Технологические контроли первой и второй стадий прекультивирования по завершению периодов инкубации включают в себя анализ бактериального роста путем измерения OD_600нм, рН и КОЕ/мл, а также, при необходимости, определение стабильности плазмиды (PST) и бактериологический анализ. Последний основан на анализе кровяного агара с целью определения гемолитической реакции требовательных патогенных микроорганизмов. Значение КОЕ оценивают до и после фильтрования в перекрестном потоке (CFF). При получении конечного бактериального концентрата КОЕ и показатель преломления измеряют в композиции с самой низкой концентрацией бактерий.

Способ настоящего изобретения, в котором пропускают подачу глюкозы, является менее трудоемким и более эффективным, что приводит к повышению выхода клеток.

4) Влияние подачи глюкозы в процессе культивирования клеток

Рост клеток пустого и рекомбинантного штаммов Salmonella typhi Ty21a анализируют в среде TSB или TSB-подобной среде путем культивировании клеток в течение периода от 0 до 30 часов при 25-35°C, предпочтительно при 30°С, и при рН в диапазоне от 6,5 до 7,5, предпочтительно при рН 7,0. Рост измеряют в единицах OD или КОЕ/мл (колониеобразующих единиц).

Результаты данных экспериментов демонстрируют, что добавление глюкозы не приводит к росту значений OD/выходу клеточной массы у штамма дикого типа, несмотря на потребления глюкозы. И, наоборот, в колбах, в которые не добавляют глюкозу, достигаются более высокие значения OD (6 для предварительной культуры 1, 8 для предварительной культуры 2). Примерно через 1 ч после добавления глюкозы OD остается неизменным (или даже несколько снижается) по сравнению с ростом, наблюдающимся без добавления глюкозы. При повторных добавлениях потребление глюкозы снижается и добавочное/аддитивное влияние на рост не наблюдается. В процессе ферментации также определяют значения рН, которые в некоторых экспериментах доводят до исходного значения рН, если можно наблюдать сдвиги.

После истощения глюкозы в отсутствие ее добавления наблюдается сдвиг рН в щелочную область, тогда как периодическое добавление глюкозы приводит к снижению значения рН (сравните фиг. 8, на которой изображена предварительная культура 1, и фиг. 9, на которой изображена предварительная культура 2). Указанные явления наблюдаются во всех используемых предварительных культурах, что указывает на отсутствие влияния номера поколения. Добавление глюкозы проводят 1-5 раз (предпочтительно 1-3 раза) в течение среднего времени культивирования не более 30 часов. Как правило, примерно через 5-15 часов рост клеток достигает стационарной фазы после экспоненциальной фазы, в зависимости от исходных условий культивирования клеток. Если предварительную культуру, выращенную с периодическим добавлением глюкозы, вносят в свежую среду, наблюдаются те же характеристики роста (повышенные значения OD/сдвиг рН в щелочную область в отсутствие добавления глюкозы). Отсутствие подачи глюкозы в фазе роста или даже отсутствие глюкозы в исходной среде с самого начала приводит к сдвигу рН в щелочную область (примерно от 7 до 8), хотя система среды является забуференной. Это может способствовать доведению значения рН в процессе роста клеток до первоначального исходного значения рН, составляющего примерно 7,0.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что концентрации глюкозы, превышающие сравнительно низкий предел (примерно 2,5 г/л), вызывают обратимое изменение метаболизма (глюкозы). Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы полагают, что вещество, еще не идентифицированное, секретируется в среду, которая ингибирует дальнейший рост, даже если уровень глюкозы снова снижается ниже порогового уровня. После инокуляции в новую среду это вещество разбавляется до концентрации ниже эффективного уровня. Похожие результаты можно получить в том случае, если исходная среда не содержит глюкозу.

Тот факт, что такие же результаты можно получить с использованием не только пустого штамма Salmonella typhi Ty21a, но и рекомбинантного штамма Salmonella typhi Ty21a-pVAX10.VR2-1 (VXM01), является интересным и свидетельствует о том, что этот неожиданный эффект не является следствием применения искусственно полученной бактериальной конструкции. Однако, как можно видеть из фиг. 12, клеточный рост рекомбинантной бактерии в отсутствие подачи глюкозы, как и ожидалось, протекает медленнее, чем рост штамма дикого типа, но в конечном счете можно получить такие же высокие значения оптической плотности (OD 7-8), как и в случае штамма дикого типа, тогда как в случае рекомбинантного штамма Salmonella, культивированного в присутствии глюкозы, обеспечиваемом периодической подачей глюкозы, никогда не достигают указанных высоких значений оптической плотности, причем рост клеток останавливается, как правило, при плотности клеток, соответствующей OD 3 или менее.

Пустой и рекомбинантный штаммы С. typhi Ty21a демонстрируют сопоставимые характеристики роста независимо от того, выращивают их в присутствии или в отсутствие добавления глюкозы.

Таким образом, результаты настоящего изобретения, описанные выше и ниже, демонстрируют, что при использовании обоих штаммов добавление глюкозы не приводит к более высоким значениям OD/выходам клеточной массы. И наоборот, в колбах, в которые не добавляют глюкозу, наблюдаются более высокие значения оптической плотности. В отсутствие добавления глюкозы сдвиг рН в щелочную область наблюдается после истощения глюкозы, тогда как при периодическом добавлении глюкозы рН падает. Один эффект зависимого от концентрации глюкозы изменения в обмене веществ в процессе выращивания Salmonella typhi Ty21a предположительно включает в себя экскрецию в питательную среду ингибиторного вещества, которое на настоящий момент не известно.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, утратившего активность эпимеразы галактозы и содержащего, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, где способ включает в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном значении рН, начиная с масштаба ферментации, в котором количество глюкозы в среде в процессе ферментации регулируют таким образом, чтобы количество глюкозы снизилось до нуля до достижения стационарной фазы.

В контексте настоящего изобретения термин "содержит" или "содержащий" означает "включающий, но не ограничивающийся ими". Предполагается, что данный термин допускает изменения и свидетельствует о присутствии любых указанных признаков, элементов, целых чисел, стадий или компонентов, но не исключает наличия или добавления одного или нескольких других признаков, элементов, целых чисел, стадий, компонентов или их сочетаний. Таким образом, термин "содержащий" включает в себя более ограниченные термины "состоящий из" и "по существу состоящий из".

В контексте настоящего изобретения термин "примерно" или "приблизительно" означает, что величина значения находится в пределах 20%, альтернативно в пределах 10%, в том числе в пределах 5% от заданного значения или диапазона. Альтернативно, особенно в биологических системах, термин "примерно" означает, что значение находится в пределах примерно log (т.е. порядка) от заданного значения, в том числе оно может отличаться от него в два раза.

В контексте настоящего изобретения термины "выращивание" и "культивирование" используются как синонимы и относятся к размножению микроорганизмов в среде, способствующей их росту.

В контексте настоящего изобретения термин "ферментация" относится к крупномасштабному культивированию микроорганизмов, обычно проводимому в ферментере, т.е. устройстве, которое поддерживает оптимальные условия для роста указанных микроорганизмов, с получением целевого микробного продукта с высоким выходом, в том числе метаболитов и самих микроорганизмов.

В контексте настоящего изобретения термин "ослабленный" относится к бактериальному штамму пониженной вирулентности по сравнению с родительским бактериальным штаммом, не несущим ослабляющую мутацию. Ослабленные бактериальные штаммы предпочтительно утрачивают вирулентность, но сохраняют способность индуцировать защитный иммунитет. Ослабленные бактерии можно обнаружить в природе, или их можно получить в лаборатории, например, путем адаптации к новой среде или клеточной культуре, или их можно получить с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

В контексте настоящего изобретения термин "мутантный штамм" относится к бактериальному штамму, несущему мутацию в геноме. В данном контексте термин "мутация" относится к изменению последовательности нуклеиновой кислоты, включающему в себя точечные мутации, вставки, делеции, транслокации и инверсии.

В контексте настоящего изобретения термин "рекомбинантная молекула ДНК" относится к конструкции ДНК, полученной методом генной инженерии, предпочтительно состоящей из фрагментов ДНК разного происхождения. Рекомбинантная молекула ДНК может представлять собой линейную нуклеиновую кислоту или предпочтительно циклическую рекомбинантную ДНК-плазмиду, полученную путем введения представляющей интерес открытой рамки считывания в плазмидный вектор экспрессии. Открытая рамка считывания предпочтительно кодирует гетерологичный антиген. Гетерологичный антиген предпочтительно представляет собой раковый антиген. Раковый антиген предпочтительно представляет собой белок рецептора VEGF. В контексте настоящего изобретения термин "гетерологичный антиген" относится к антигену, полученному из видов, отличных от Salmonella typhi.

В контексте настоящего изобретения термин "кассета экспрессии" относится к элементу нуклеиновой кислоты, содержащему, по меньшей мере, один ген под контролем регуляторных последовательностей, регулирующих его экспрессию. Кассеты экспрессии, содержащиеся в ослабленном мутантном штамме Salmonella typhi, предпочтительно могут опосредовать транскрипцию содержащейся в них открытой рамки считывания в клетках-мишенях. Кассеты экспрессии обычно содержат промотор, по меньшей мере, одну открытую рамку считывания и сигнал терминации транскрипции.

В контексте настоящего изобретения термин "пептон" относится к смеси продуктов расщепления, содержащей аминокислоты и пептиды, полученные в результате гидролиза белковых материалов, например, путем частичного кислотного или ферментативного гидролиза смесей природных белков.

В контексте настоящего изобретения термин "примерно нейтральное значение рН" относится к рН в диапазоне примерно от 5 до 9, предпочтительно примерно от 6 до 8, более предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно примерно 7,0.

Среды, подходящие для применения в способе настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, стандартную среду TSB, а также среду TSB неживотного происхождения. Стандартная среда TSB, известная в данной области, содержит поджелудочный казеиновый пептон, пептон соевой муки, гидрофосфат дикалия (буфер), хлорид натрия и глюкозу (= декстрозу) в качестве источника энергии в исходной концентрации 2,5 г/л. Примером подходящей среды TSB неживотного происхождения является CASO Bouillon неживотного происхождения, содержащая неживотный пептон, гидрофосфат дикалия (буфер), хлорид натрия и глюкозу в исходной концентрации 2,5 г/л.

В контексте настоящего изобретения термин "стационарная фаза" относится к стадии роста бактерий, наступающей после экспоненциальной или логарифмической фазы, в которой плотность клеток в питательной среде остается примерно постоянной. Следовательно, термин "до достижения стационарной фазы" относится к любому моменту времени до стационарной фазы и включает в себя в лаг-фазу (т.е. первую фазу роста бактерий, в течение которой бактерии адаптируются к условиям роста) и экспоненциальную фазу. Неожиданно было обнаружено, что культивирование ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi по способу настоящего изобретения увеличивает фазу экспоненциального роста. При выращивании ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi Ty21a с использованием исходного количества глюкозы, которое расходуется во время фазы экспоненциального роста, без добавления глюкозы в процессе ферментации, стационарная фаза достигается не ранее, чем после 9 часов культивирования, предпочтительно после периода культивирования, составляющего от 9 до 20 часов, более предпочтительно после периода культивирования, составляющего от 9 до 15 часов, наиболее предпочтительно после периода культивирования, составляющего от 9 до 12 часов.

В конкретном варианте осуществления глюкозу не добавляют к среде в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы. Однако рассматриваемый способ выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi также охватывает добавление глюкозы, при условии, что количество глюкозы снижается до нуля до достижения стационарной фазы.

В контексте настоящего изобретения термин "расходование глюкозы" означает, что исходное количество глюкозы в среде потребляется (т.е. поглощается и метаболизируется) бактериями.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21a.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии. Показано, что количество гетерологичного антигена, необходимого для индукции адекватного иммунного ответа, может быть токсичным для бактерий и может привести к гибели клеток, чрезмерному ослаблению или утрате экспрессии гетерологичного антигена. Использование эукариотической кассеты экспрессии, которая не экспрессируется в бактериальном векторе, а экспрессируется только в клетке-мишени, позволяет преодолеть указанную проблему токсичности.

В контексте настоящего изобретения термин "эукариотическая кассета экспрессии" относится к кассете экспрессии, которая обеспечивает экспрессию открытой рамки считывания в эукариотической клетке. Эукариотическая кассета экспрессии содержит регуляторные последовательности, способные ругулировать экспрессию открытой рамки считывания в эукариотической клетке, предпочтительно, промотор и сигнал полиаденилирования. Промоторы и сигналы полиаденилирования, входящие в состав рекомбинантных молекул ДНК, содержащихся в штамме брюшного тифа Salmonella, предназначенном для применения в качестве вакцины настоящего изобретения, предпочтительно выбирают так, чтобы они могли функционировать в клетках субъекта, подлежащего иммунизации. Примеры промоторов, которые можно использовать в ослабленном мутантном штамме Salmonella typhi настоящего изобретения, в особенности, предназначенном для получения ДНК-вакцины человека, включают в себя, без ограничения, промоторы вируса обезьяны 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), например, промотор длинного концевого повтора ВИЧ (LTR), промотор вируса Молони, промотор цитомегаловируса (CMV), такой как предранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), а также промоторы генов человека, таких как гены человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина и человеческого металлотионеина. В конкретном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии содержит промотор CMV. В контексте настоящего изобретения термин "промотор CMV" относится к предраннему промотору цитомегаловируса.

Примеры сигналов полиаденилирования, в особенности, подходящих для получения ДНК-вакцин человека, включают в себя, без ограничения, участок полиаденилирования BGH, сигналы полиаденилирования SV40 и сигналы полиаденилирования LTR. В конкретном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии, входящая в состав рекомбинантной молекулы ДНК, содержащейся в ослабленном мутантном штамме Salmonella typhi настоящего изобретения, содержит участок полиаденилирования BGH.

Помимо регуляторных элементов, необходимых для экспрессии гетерологичного гена, например, кодирующего гетерологичный антиген, таких как промоторы и сигналы полиаденилирования, в состав рекомбинантной молекулы ДНК также могут входить другие элементы. Такие дополнительные элементы включают в себя энхансеры. Энхансер может представлять собой, например, энхансер человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина, а также вирусный энхансер, такой как энхансер CMV, RSV и EBV.

Как правило, регуляторные последовательности и кодоны являются вид-зависимыми, поэтому, чтобы максимизировать продукцию белка, предпочтительно выбирают регуляторные последовательности и кодоны, являющиеся эффективными в видах, подлежащих иммунизации. Специалист в данной области может получить рекомбинантные молекулы ДНК, способные функционировать в конкретных рассматриваемых видах.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF.

Белки рецептора VEGF представляют собой специфичные для эндотелиальных клеток рецепторные тирозинкиназы, способные связываться с лигандом - фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), который инициирует их димеризацию и активацию через трансфосфорилирование. Существует три основных подтипа VEGFR, VEGFR-1 (или FLT1), VEGFR-2 (KDR или FLK1) и VEGFR-3 (или FLT4). VEGFR-2 опосредует почти все известные клеточные ответы на VEGF. Мембраносвязанные рецепторы VEGF содержат внеклеточный фрагмент, состоящий из 7 иммуноглобулин-подобных доменов, один трансмембранный соединяющий участок и внутриклеточный фрагмент, содержащий составной тирозинкиназный домен. Транскрипты VEGFR также обуславливают появление альтернативных вариантов сплайсинга, которые кодируют растворимые белки рецептора VEGF. Семейство факторов роста VEGF охватывает 6 членов семьи, от VEGF-A до Е и PGF. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%.

В контексте настоящего изобретения термин "гомолог" человеческого VEGFR-2 относится к белку рецептора VEGF, который отличается по аминокислотной последовательности и/или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность человеческого VEGFR-2. Гомолог человеческого VEGFR-2 может иметь природное происхождение, например, он может представлять собой гомолог VEGFR-2, полученный из другого вида, или он может представлять собой рекомбинантный гомолог VEGFR-2. Известно, что использование кодонов различается среди разных видов. Следовательно, при экспрессии гетерологичного белка в клетке-мишени может быть необходимо или, по меньшей мере, полезно адаптировать нуклеотидную последовательность для использования кодонов в клетке-мишени. Способы создания и конструирования гомологов белков рецептора VEGF хорошо известны рядовому специалисту в данной области техники.

Гомолог VEGFR-2 может содержать одну или несколько мутаций, включающих в себя добавление, делецию и/или замену одной или нескольких аминокислот. В соответствии с настоящим изобретением указанные удаленные, добавленные и/или замененные аминокислоты могут представлять собой последовательные аминокислоты или могут быть разбросаны по всей длине аминокислотной последовательности функционального гомолога VEGFR-2. В соответствии с настоящим изобретением любое число аминокислот может быть добавлено, удалено и/или заменено, при условии, что гомолог и человеческий VEGFR-2 обладают гомологией, составляющей, по меньшей мере, примерно 80%. В конкретных вариантах осуществления гомолог человеческого VEGFR-2 имеет гомологию последовательности, составляющую, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 85%, по меньшей мере, примерно 90%, или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95%, и идентичность последовательности, составляющую, по меньшей мере, примерно 60%, по меньшей мере, примерно 65%, по меньшей мере, примерно 70%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75%. Методы и алгоритмы, используемые для определения идентичности и/или гомологии последовательностей, в том числе для сравнения гомологов, имеющих делеции, добавления и/или замены по сравнению с исходной последовательностью, хорошо известны практикующему специалисту в данной области техники. На уровне ДНК, нуклеотидные последовательности, кодирующие гомолог человеческого VEGFR-2, могут отличаться в большей степени вследствие вырожденности генетического кода.

В другом предпочтительном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует аминокислотную последовательность человеческого VEGFR-2, которая описана в SEQ ID NO 1.

В некоторых вариантах осуществления среда содержит буферный пептон неживотного происхождения. В предпочтительном варианте осуществления буферная среда содержит трипсиновый соевый бульон (TSB) неживотного происхождения.

В контексте настоящего изобретения термин "пептон неживотного происхождения" относится к смеси продуктов расщепления, полученной путем частичного кислотного или ферментативного гидролиза нативного белка неживотного происхождения. Предпочтительно нативный белок имеет растительное происхождение. Пептон неживотного происхождения содержит только те компоненты, которые не могут быть получены непосредственно из эукариотических животных.

В некоторых вариантах осуществления объем среды составляет, по меньшей мере, примерно 10 л.

В некоторых вариантах осуществления объем среды находится в диапазоне, составляющем, по меньшей мере, примерно от 10 л, или 30 л, или 50 л, или 100 л, максимум примерно до 10000 л, или 1000 л, или 800 л, или 500 л.

В конкретных вариантах осуществления объем среды составляет примерно от 100 л до 500 л, в частности, примерно 100 л, 150 л, 200 л, 250 л, 300 л, 400 л или примерно 500 л.

В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация глюкозы не превышает концентрацию, присутствующую в минимальной бактериальной среде.

В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация глюкозы составляет примерно от 0 г/л до 4 г/л.

В конкретных вариантах осуществления исходная концентрация глюкозы составляет примерно 0 г/л, примерно 0,5 г/л, примерно 1 г/л, примерно 1,5 г/л, примерно 2 г/л, примерно 2,5 г/л, примерно 3 г/л, примерно 3,5 г/л или примерно 4 г/л.

В некоторых вариантах осуществления исходное значение рН составляет по меньшей мере примерно от 5, 6 или 6,5 максимум примерно до 9, 8 или 7,5.

В конкретных вариантах осуществления начальное значение рН составляет примерно от 6,5 до 7,5, более предпочтительно, оно составляет примерно 7,0.

В конкретном варианте осуществления значение рН доводят в процессе культивирования до величины, составляющей примерно от 6 до 8, в частности, примерно от 6,5 до 7,5.

В конкретном варианте осуществления в процессе ферментации значение рН доводят до величины, находящейся в диапазоне, составляющем, по меньшей мере, примерно от 6 или 6,5 максимум примерно до 8 или 7,5.

В конкретном варианте осуществления в процессе ферментации значение рН доводят до величины, находящейся в диапазоне, составляющем, по меньшей мере, примерно от 6,5 до 7,5, более конкретно, примерно до 7,0.

В конкретном варианте осуществления рост определяют путем измерения оптической плотности (OD).

В контексте настоящего изобретения, термин "оптическая плотность" или "мутность" вещества относится к логарифмическому соотношению излучения, падающего на указанное вещество, к излучению, прошедшему через указанное вещество, где излучение имеет заданную длину волны. Оптическую плотность предпочтительно измеряют с помощью спектрофотометра. Предпочтительно оптическую плотность используют в качестве меры концентрации клеток бактерий, предпочтительно находящихся в виде суспензии. Видимый свет, проходящий через суспензию клеток, рассеивается. Большой разброс указывает на более высокое число клеток. Как правило, оптическую плотность измеряют при длине волны 600 нм (OD₆₀₀). Получают кривую роста в виде зависимости оптической плотности бактериальной культуры при определенной длине волны от времени культивирования, которую можно использовать для определения разных фаз роста бактерий и времени удвоения бактериальной культуры. Кривая роста является характерным признаком бактерий конкретного типа, культивируемых при заданных условиях в определенной культуральной среде. Следовательно, измерение оптической плотности суспензии клеток можно использовать для мониторинга стадии роста бактерий. Измерение оптической плотности можно использовать для определения конечной точки процедуры культивирования, т.е. стадии роста бактерий, в которой клетки нужно собирать, как правило, это середина логарифмической фазы роста.

В предпочтительном варианте осуществления рост определяют путем мониторинга оптической плотности культуры in situ или путем отбора образцов и измерения их оптической плотности. Мониторинг оптической плотности бактериальной культуры in situ с помощью устройств on-line или in situ позволяет осуществлять постоянный, непрерывный, неинвазивный контроль за клеточным ростом, сводит к минимуму риск загрязнения и устраняет необходимость громоздкой и трудоемкой экстракции образцов.

Неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi по способу настоящего изобретения дает значения оптической плотности примерно от 6,0 до 8,0 в начале стационарной фазы. Для сравнения, культивирование такого же штамма с помощью подобного способа ферментации, но с добавлением глюкозы для поддержания почти стабильного уровня глюкозы, составляющего примерно от 1 г/л до 4 г/л, дает значения оптической плотности в диапазоне примерно от 3 до 5,5. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi без добавления глюкозы в среду в процессе ферментации и с использованием исходного количества глюкозы в среде, которое расходуется до достижения стационарной фазы, дает более высокое значение оптической плотности в начале стационарной фазы, чем процесс ферментации, проводимый с добавлением глюкозы.

В другом варианте осуществления рост определяют путем измерения плотности клеток.

В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток определяют микроскопически, или путем измерения электрического сопротивления, или с помощью проточной цитометрии. Плотность клеток можно определить микроскопически вручную путем подсчета клеток с использованием счетной камеры или гемоцитометра. Измерение плотности клеток на основе электрического сопротивления предпочтительно осуществляют с использованием счетчика Coulter. Измерение плотности клеток методом проточной цитометрии проводят путем пропускания клеток в узком потоке через лазерный луч, который обнаруживает их одну за другой. Световой детектор поглощает свет, который отражается от клеток.

Неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi по способу настоящего изобретения позволяет получать значения плотности клеток в диапазоне примерно от 5×10¹⁴ до 8×10¹⁴ в начале стационарной фазы. Для сравнения, выращивание такого же штамма с помощью подобного способа ферментации, но проводимого с добавлением глюкозы для поддержания почти стабильного уровня глюкозы, составляющего примерно от 1 г/л до 4 г/л дает значения плотности клеток примерно от 5×10¹³ до 1×10¹⁴. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi без добавления глюкозы в среду в процессе ферментации и с использованием исходного количества глюкозы в среде, которое расходуется до достижения стационарной фазы, дает более высокое значение клеточной плотности в начале стационарной фазы, чем процесс ферментации, проводимый с добавлением глюкозы.

Оптическая плотность клеточной суспензии ниже примерно 0,4 прямо пропорциональна плотности клеток в суспензии. Следовательно, калибровочную кривую можно получить путем построения графика зависимости оптической плотности от плотности клеток. Такую калибровочную кривую можно использовать для определения плотности клеток в клеточной суспензии путем измерения ее оптической плотности.

В другом варианте осуществления рост определяют путем измерения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) после взятия образцов и нанесения их на чашки с агаром. С помощью данного способа подсчитывают только жизнеспособные клетки, поскольку только жизнеспособные клетки могут образовывать колонии на чашках с агаром.

Неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленных мутантных штаммов Salmonella typhi по способу настоящего изобретения позволяет получать значения КОЕ в диапазоне примерно от 6×10⁹ до 8×10⁹ в начале стационарной фазы. Для сравнения, выращивание такого же штамма с помощью подобного способа ферментации, но проводимого с добавлением глюкозы для поддержания почти стабильного уровня глюкозы, составляющего примерно от 1 г/л до 4 г/л дает значения КОЕ примерно от 2×10⁹ до 5×10⁹. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что выращивание ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi без добавления глюкозы в среду в процессе ферментации и с использованием исходного количества глюкозы в среде, которое расходуется до достижения стационарной фазы, дает не только более высокое значение клеточной плотности в начале стационарной фазы, но и более высокое число жизнеспособных клеток, чем процесс ферментации, проводимый с добавлением глюкозы.

В конкретном варианте осуществления, клетки собирают до достижения оптической плотности, равной примерно 6.

В предпочтительном варианте осуществления клетки собирают при оптической плотности, составляющей примерно от 5 до 6.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, участок начала репликации pMB1 и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2 под контролем промотера CMV.

В предпочтительном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к ослабленному мутантному штамму Salmonella typhi, утратившему активность эпимеразы галактозы и содержащему, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, который можно получить с помощью способа выращивания штамма, включающего в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащий пептон, примерно при нейтральном исходном значении рН в масштабе ферментации, где количество глюкозы в среде в процессе ферментации регулируют таким образом, чтобы оно снизилось до нуля перед достижением стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления глюкозу не добавляют к среде в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии.

В конкретном варианте осуществления кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF.

В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет примерно 80%.

В следующем предпочтительном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует человеческий VEGFR-2, аминокислотная последовательность которого описана в SEQ ID NO 1.

В конкретном варианте осуществления ослабленный мутантный штамм представляет собой Salmonella typhi Ty21, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, участок начала репликации pMB1 и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2 под контролем промотора цитомегаловируса.

В предпочтительном варианте осуществления человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к ослабленному мутантному штамму Salmonella typhi Ty21a, содержащему, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую белок рецептора VEGF, где указанный штамм предназначается для применения в качестве вакцины.

В контексте настоящего изобретения термин "вакцина" относится к средству, способному индуцировать иммунный ответ у субъекта после введения. Предпочтительно вакцина может предотвращать, облегчать или лечить заболевание. Такая вакцина предпочтительно содержит ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi, предпочтительно S. typhi Ty21a. Предпочтительно вакцина дополнительно содержит, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, предпочтительно, кодирующую гетерологичный антиген. Такую вакцину, содержащую вектор, например, ослабленный бактериальный штамм, в качестве носителя ДНК, кодирующей гетерологичный антиген, называют ДНК-вакцина.

В конкретном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%.

В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая кассета экспрессии кодирует человеческий VEGFR-2, аминокислотная последовательность которого описана в SEQ ID NO 1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения клеточного роста ослабленного мутантного вакцинного штамма Salmonella, не имеющего активности эпимеразы галактозы, путем культивирования штамма в забуференной среде, в основном содержащей ферментативные гидролизаты казеина и соевой муки и исходное количество глюкозы, не превышающее 2,5-3,0 г/л, при исходном значении рН 6,5-7,5, причем культивирование проводят в отсутствие какой-либо дополнительной подачи глюкозы в ферментационный бульон до стационарной фазы роста клеток и, следовательно, не поддерживают исходный уровень глюкозы в бульоне, где указанное увеличение клеточного роста, которое достигается только в результате полного потребления глюкозы в процессе ферментации, измеряют по оптической плотности (OD), имеющей значение 7,5-8,0 в полученной в конечном счете стационарной фазе (предпочтительно, полученной через 18-20 ч), в отличие от OD 5,0-5,5, полученной в соответствующем способе ферментации, который проводят в тех же условиях, но с добавлением глюкозы в процессе ферментации для поддержания постоянного уровня глюкозы в ферментационном бульоне 2,0-3,0 г/л.

В конкретном варианте осуществления максимальный рост клеток получают после культивирования в течение 20 часов.

В конкретном варианте осуществления плотность клеток 5×10¹⁴-8×10¹⁴ достигается путем исключения какой-либо подачи глюкозы во время ферментации, в отличие от плотности клеток 5×10¹³-1×10¹⁴, наблюдающейся при добавлении глюкозы в процессе культивирования.

В конкретном варианте осуществления, после ферментации с исключением какой-либо подачи глюкозы во время ферментации получают число колониеобразующих единиц (КОЕ) от 6×10⁹ до 8×10⁹ на мл, по сравнению со значением, составляющим от 2×10⁹ до 5×10⁹ после подачи глюкозы в процессе ферментации.

В конкретном варианте осуществления в процессе ферментации значение рН доводят до 7,0. Отсутствие подачи глюкозы в фазе роста или даже отсутствие глюкозы в исходной среде с самого начала приводит к сдвигу рН в щелочную область (примерно от 7 до 8), хотя система среды является забуференной. Это может способствовать доведению значения рН в процессе роста клеток до первоначального исходного значения рН, составляющего примерно 7,0.

В конкретном варианте осуществления изобретения среда представляет собой трипсиновый соевый бульон (TSB) или среду, которая содержит такие же или аналогичные питательные вещества.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ослабленный мутантный вакцинный штамм Salmonella представляет собой Salmonella typhi Ty21a.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ослабленного мутантного противоракового вакцинного штамма Salmonella typhi Ty21a, где штамм несет нескольких копий плазмидной ДНК, кодирующей эукариотическую кассету экспрессии человеческого рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR-2 или FLK-1), причем способ включает в себя способ увеличения роста клеток ослабленного мутантного вакцинного штамма Salmonella настоящего изобретения.

В конкретном варианте осуществления указанная плазмидная ДНК представляет собой плазмидную ДНК размером 7580 п. о., которая содержит кДНК VEGFR-2, находящуюся под контролем промотора CMV, ген резистентности к канамицину, и участок начала репликации pMB1, где указанную плазмидную ДНК обозначают pVAX10.VR2-1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР И ТАБЛИЦ

ФИГ. 1: Аминокислотная последовательность VEGFR-2, кодируемая кДНК, клонированной в плазмиде pVAX10.VR2-1

Фиг. 2: Карта плазмиды pVAX10.VR2-1

Фиг. 3: Описание способа промышленного получения Salmonella typhi Ty2a (pVAX10.VR2-1)

Фиг. 4: Блок-схема выделения S. typhi Ty21a

Фиг. 5: Выращивание предварительных культур 1 и 2 Salmonella typhi Ty21a в присутствии/в отсутствие канамицина

Фиг. 6: Выращивание культур (предварительная культура 1) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и концентрацию глюкозы (glc) в г/л.

Фиг. 7: Выращивание культур (предварительная культура 1) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и величину сдвига рН.

Фиг. 8: Выращивание культур (предварительная культура 2) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и концентрацию глюкозы (glc) в г/л.

Фиг. 9: Выращивание культур (предварительная культура 2) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и величину сдвига рН.

Фиг. 10: Выращивание культур (предварительная культура 3, содержащие глюкозу инокуляты предварительной культуры 1) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и концентрацию глюкозы (glc) в г/л.

Фиг. 11: Выращивание культур (предварительная культура 3, содержащие глюкозу инокуляты предварительной культуры 1) Salmonella typhi Ty21a (пустой штамм) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD, и величину сдвига рН.

Фиг. 12: Выращивание штамма дикого типа (предварительная культура 1) Salmonella typhi Ty21a по сравнению с рекомбинантным штаммом, продуцирующим противораковую вакцину (Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD.

Фиг. 13: Выращивание штамма дикого типа (предварительная культура 2) Salmonella typhi Ty21a по сравнению с рекомбинантным штаммом, продуцирующим противораковую вакцину (Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01) с периодическим добавлением глюкозы (чтобы достичь конечную концентрацию глюкозы 2,5 г/л) и без добавления глюкозы. Рост клеток определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Стрелки обозначают добавление глюкозы (периодическое). На оси X откладывают время культивирования в часах (ч); на оси Y откладывают плотность клеток, измеренную в единицах OD.

Таблица 1: Способ промышленного получения

Таблица 2: Способ промышленного получения

Таблица 3: Результаты измерения OD600 во время процесса ферментации

Таблица 4: Концентрация глюкозы во время процесса ферментации

Таблица 5: Сдвиг значения рН во время процесса ферментации

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Выделение штамма Salmonella typhi Ty21a для получения исследовательский посевной серии (RSL)

Первая стадия способа получения RSL включает в себя выделение ослабленного штамма Salmonella typhi Ty21a из капсул Typhoral L® с последующей трансформацией ослабленных бактерий плазмидной ДНК (pVAX10.VR2-1).

Коммерчески доступные капсулы Typhoral L®, содержащие ослабленный штамм серовара Salmonella enterica typhi Ty21a, используют для получения штамма S. typhi, предназначенного для применения в рекомбинантных исследованиях, описанных ниже. Способ включает в себя инокуляцию части содержимого капсул в жидкую культуральную среду и последующее нанесение жидкой культуры на агаровую среду с целью выделения отдельных колоний бактерий. Отдельные колонии выделяют и выращивают в жидкой культуральной среде. Затем две культуры, а именно VAX.Ty21-1 и VAX.Ty21-2, обрабатывают глицерином, берут аликвоты (1 мл) и хранят при -75°C±5°С до использования. Дополнительно подтверждают идентичность каждой из двух культур.

Пример 2: Конструирование плазмиды

Принцип синтеза плазмиды основан на синтезе двухцепочечного гена in vitro, включающий в себя следующие стадии:

- Целую последовательность плазмиды pVAX10-VR2.1 размером 7,58 т.о. подразделяют (путем компьютерного анализа) на 5 фрагментов размером ~1,5 т.о. Каждый фрагмент подразделяют на олигонуклеотиды размером 40-50 п. о., каждый из которых содержит участки перекрывания с олигонуклеотидами обеих цепей

- Затем синтезированные in vitro олигонуклеотиды фосфорилируют путем инкубации с полинуклеотидкиназой T4

- После отжига перекрывающихся олигонуклеотидов в соответствующих условиях фермент ДНК-лигаза Taq соединяет выровненные олигонуклеотиды

- После завершения стадии лигирования проводят ПЦР с использованием праймеров, гибридизующихся по внешним положениям, чтобы увеличить выход лигированных фрагментов плазмиды (~1,5 т.о.)

- Продукты ПЦР выделяют методом препаративного электрофореза в агарозном геле

- Выделенные продукты ПЦР клонируют в векторах ТОРО (Invitrogen K#4575-40) и используют для трансформации клеток E.coli ТОР10 с последующим размножением

- После выделения плазмиды ТОРО проводят проверку последовательности и участков рестрикции

- Выделенные выровненные фрагменты собирают методом ПЦР с перекрыванием. Данный процесс сопровождается линейной сборкой плазмиды pVAX10.VR2-1

- После рестрикционного расщепления под действием XhoI (в плазмиде pVAX10.VR2-1 присутствует один участок рестрикции, см. фигуру 2.1.S.1.2.2-1) и ковалентного связывания посредством лигазы Т4 E.coli трансформируют циклической плазмидой с последующим размножением

- После окончательной проверки плазмидной последовательности плазмидой pVAX10.VR2-1 трансформируют бактериальный штамм S. typhi Ty21a.

Таким образом, плазмида pVAX10.VR2-1 успешно синтезирована (отклонения от стандартной последовательности отсутствуют). В дальнейшем полученную плазмиду используют для трансформации изолятов бактериального штамма S. typhi Ty21a (Vax.Ty21-1 и Vax.Ty21-2).

Пример 3: Способы промышленного получения

В нижеследующей таблице 2 приведены способы промышленного получения в присутствии/в отсутствие подачи глюкозы в процессе ферментации.

Стадия способа получения	Вариант способа A: с подачей глюкозы	Вариант способа A: без подачи глюкозы
Предварительная культура Чистая комната класса D и A в D	Клетки (содержащие/не содержащие плазмиду pVAX10.VR2-1) ↓ 350 мл TSB + канамицин (1 мл) ↓ 5×550 мл TSB + канамицин (50 мл) (OD600≥0,5)	Клетки (содержащие/не содержащие плазмиду pVAX10.VR2-1) ↓ 2×500 мл TSB + канамицин (500 мл) (OD600>0,3) ↓ 10×1000 мл TSB + канамицин (75 мл) (OD600≥0,5);
Ферментация Чистая комната класса D	Объем ферментации 30 л TSB + 0,001% галактозы - 30° - поток воздуха 2 л/мин (0,07 vvm) - давление 1 бар - pH 7,0, регулируемое с помощью NaOH - pO2≥40%, регулируемое мешалкой - подача глюкозы Σ5-8 г/л - конечное OD600нм~2,7 (желательный диапазон 6-10) - охлаждение до 15°С перед сбором	Объем ферментации 100 л TSB + 0,001% галактозы - 30°С - поток воздуха 100 л/мин (1 vvm) - давление не регулируется - pH 7,0, регулируемое с помощью NaOH - регуляция пенообразования (Corning) - pO2≥40%, регулируемое мешалкой - скорость перемешивания минимум 200 об/мин; - отсутствие подачи глюкозы - конечное OD600нм (конец экспоненциальной фазы роста) - охлаждение, по меньшей мере, до 25°С перед сбором
Сбор/концентрирование/промывание Чистая комната класса D	Фильтрование в перекрестном потоке - 10-кратное концентрирование - замена буфера после 10-кратного концентрирования на раствор, содержащий 15% сахарозы, методом диафильтрации с последующим дополнительным концентрированием до объема, составляющего 1/20 от объема исходного сбора - получение композиции путем добавления аскорбата до конечной концентрации 0,45% Хранение при 2-8°С до заполнения в течение примерно 24 часов	Фильтрование в перекрестном потоке - 10-кратное концентрирование - замена буфера после 10-кратного концентрирования на раствор, содержащий 15% сахарозы, 0,45% аскорбата, pH 7,2, методом диафильтрации с последующим дополнительным концентрированием до объема, составляющего 1/20 от объема исходного сбора Хранение при 2-8°С до заполнения в течение примерно 24 часов
Разбавление/заполнение флаконов Чистая комната класса A в B	Ручное заполнение 150 флаконов использованием 5 разведений - Корректировка КОЕ - 300 мл суспензии → заполнение 150 флаконов - Разведение 30 мл суспензии 270 мл раствора для получения композиции, заполнение 150 стеклянных флаконов 2R - Четыре разведения и заполнение 150 флаконов до 1:10000 - Закрытие флаконов резиновыми крышками и алюминиевыми колпачками - Хранение при -75°С±10°С	Ручное заполнение 150 флаконов использованием 5 разведений - Корректировка КОЕ - 300 мл суспензии → заполнение 150 флаконов - Разведение 30 мл суспензии 270 мл раствора для получения композиции, заполнение 150 стеклянных флаконов 2R - Четыре разведения и заполнение 150 флаконов до 1:10000 - Закрытие флаконов резиновыми крышками и алюминиевыми колпачками - Хранение при ≤70°С

Выращивание бактерий проводят в 2×350 мл среды TSB, дополнительно содержащей 25 мкг/мл канамицина. В каждую из двух колб Эрленмейера объемом 2 л, снабженных перегородками, инокулируют аликвоты (1 мл) Salmonella typhi Ty21a и Ty21 (pVAX10.VR2-1). Культуры инкубируют при 30°С±2°C при встряхивании (140 об/мин) до достижения оптической плотности OD_600нм >0,1. Собранные бактерии (50 мл) первой культуры используют для инокуляции второй культуры (предварительная культура 2), 6×550 мл среды TSB, содержащей канамицин (25 мкг/мл), в колбах Фернбаха объемом 3 л, снабженных перегородками. Культуры инкубируют при 30°С±2°C при встряхивании (180 об/мин) до достижения OD бактериальной культуры при 600 нм значения ≥0,3. По окончании времени инкубации основную культуру (среда TSB, содержащая 0,001% галактозы), полученную в контролируемом ферментере из нержавеющей стали с рабочим объемом 27 л, инокулируют предварительной культурой 2 (объединяют 5 колб с бактериальной культурой) и инкубируют при 30°C, используя следующие параметры: поток воздуха со скоростью 2 л/мин, давление 1 бар, рН 7,0, pO₂≥40%.

В половину образцов культуры добавляют глюкозу в количестве, которое позволяет получить конечную концентрацию в исходной культуральной среде от 2,0 г/л до 3,0 г/л. Добавление глюкозы проводят через 3-5 ч после начала ферментации и повторяют несколько раз каждые 3-5 ч.

Другую половину образцов культуры обрабатывают идентичным образом, но без подачи глюкозы в процессе культивирования клеток Salmonella. В качестве контроля используют культуральную среду, которая не содержит глюкозу с самого начала (среда TSB, не содержащая глюкозу).

Бактериальную культуру концентрируют методом фильтрации в перекрестном потоке (CFF)/диафильтрации против 15% раствора сахарозы. Проводят пять разведений конечного бактериального концентрата. Затем аликвоты (1 мл) конечного бактериального продукта помещают во флаконы 2R, закрывают, прикрепляют этикетки, запечатывают и хранят при -75°С±5°C.

Контроль в процессе проведения первой и второй стадий предварительного культивирования, по завершению инкубационного периода, включает в себя анализ бактериального роста путем измерения OD_600нм, рН и КОЕ/мл, а также определение стабильности плазмиды (PST) и бактериологический анализ. Последний основан на анализе кровяного агара с целью определения гемолитической реакции требовательных патогенных микроорганизмов. Значение КОЕ оценивают до и после фильтрования в перекрестном потоке (CFF). При получении конечного бактериального концентрата КОЕ и показатель преломления измеряют в композиции с самой низкой концентрацией бактерий.

Пример 4: Выращивание Salmonella typhi Ty21a (pVAX10.VR2-1) в присутствии и в отсутствие канамицина

Получение живой вакцины противораковой бактериальной вакцины основано на ферментации серовара штамма Salmonella enterica typhi Ty21a (содержащего плазмиду pVAX10.VR2-1). После выращивания клеточную суспензию подвергают концентрированию методом фильтрации в перекрестном потоке и промыванию путем диафильтрации. Пять разных разведений промытой клеточной суспензии вносят в стеклянные флаконы 2R.

Цели указанных анализов роста в колбах включают в себя:

- подтверждение темпов роста предварительных культур 1 и 2 для составления таблицы времени производственного цикла

- исследование влияния подачи глюкозы на достижение высокой концентрации клеток (значения OD₆₀₀)

Эксперименты проводят, начиная с базовых банков клеток Salmonella enterica typhi Ty21a и Salmonella enterica typhi Ty21a (pVAX10.VR2-1) (= штамм VMX01). Инокулят для ферментации получают путем двухстадийного предварительного культивирования (VK): предварительную культуру 1 инокулируют непосредственно из МСВ; предварительную культуру 2 инокулируют на большем объеме из предварительной культуры 1. Тестирование роста проводят, чтобы оценить период времени культивирования предварительной культуры в колбах Эрленмейера объемом 2 л (предварительная культура 1) и в колбах Фернбаха Corning объемом 3 л (предварительная культура 2). Предварительное культивирование проводят в присутствии и в отсутствие канамицина, чтобы получить информацию о росте/экспоненциальной фазе роста в обоих условиях.

Рост в указанных пяти колбах сравнивают на фиг. 5:

- VK1a: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 3 л + 0,5 мл MCB, 30°C, 120 об/мин

- VK1b: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 3 л + 0,5 мл MCB, 30°C, 120 об/мин

- VK2: 1000 мл среды TSB в колбе Corning объемом 3 л + 75 мл VK1b (OD 1,6), 30°C, 120 об/мин

- VK1a k: 500 мл среды TSB + 25 мг/л сульфата канамицина в колбе Corning объемом 2 л + 0,5 мл MCB, 30°C, 120 об/мин

- VK1b k: 500 мл среды TSB + 25 мг/л сульфата канамицина в колбе Corning объемом 3 л + 0,5 мл MCB, 30°C, 120 об/мин

- VK2a k: 1000 мл среды TSB + 25 мг/л сульфата канамицина в колбе Corning объемом 3 л + 75 мл Vk1a k (OD 1,8), 30°C, 120 об/мин

- VK2b k: 1000 мл среды TSB + 25 мг/л сульфата канамицина в колбе Corning объемом 3 л + 75 мл Vk1a k (OD 1,8), 30°C, 120 об/мин

Результаты, приведенные на фиг. 5, показывают, что нет никаких существенных различий между ростом в присутствии и в отсутствие канамицина, а также в росте в колбах Corning объемом 2 л или 3 л, соответственно. Время культивирования предварительной культуры 1 при 30°С должно составлять примерно от 15 до 23 часов (OD₆₀₀ ~1-4), чтобы инокулировать предварительную культуру 2 клетками в экспоненциальной фазе. Минимальное значение OD₆₀₀ для предварительной культуры 2 (>0,5) достигают через 2-3 часа; фаза экспоненциального роста характеризуется значениями OD₆₀₀ от 0,5 до 3,0.

Пример 5: Выращивание Salmonella typhi Ty21a (пустой) в присутствии и в отсутствие подачи глюкозы

Анализ роста трех предварительных культур (1, 2, 3) проводят в колбах Эрленмейера объемом 2 л, и двустадийное культивирование проводят с использованием продуцирующего штамма.

Предварительную культуру 1 инокулируют непосредственно из RCB; предварительную культуру 2 инокулируют на большем объеме предварительной культуры 1. Вследствие отсутствия плазмиды, кодирующей устойчивость к канамицину, селективный антибиотик не вводят в состав культуральной среды. Чтобы определить влияние стадии предварительного культивирования (номер поколения), проводят периодическое добавление глюкозы в предварительную культуру 1, а также в предварительную культуру 2, в сравнении с культурами, не получающими "периодического добавления". Кроме того, предварительную культуру 1, периодически получающую глюкозу, используют в качестве инокулята для предварительной культуры 2, чтобы отслеживать обратимость метаболических изменений, опосредованных концентрацией глюкозы. Предварительная культура 3 представляет собой предварительную культуру 1, выращенную с подачей глюкозы (периодической), инокулированную в свежую среду TSB (в присутствии или в отсутствие глюкозы).

На фиг. 6-11 используют следующие обозначения образцов:

- VK1a: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 0,5 мл RCB, 30°C, 120 об/мин

- VK1b: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 0,5 мл RCB, 30°C, 120 об/мин + добавление глюкозы

- VK2a: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 38 мл VK1a (OD 5,4), 30°C, 120 об/мин

- VK2b: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 38 мл VK1a (OD 5,4), 30°C, 120 об/мин + добавление глюкозы

- VK3a: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 38 мл VK1a (OD 5,1; 5 часов после первого добавления глюкозы) 30°C, 120 об/мин

- VK3b: 500 мл среды TSB в колбе Corning объемом 2 л + 38 мл VK1a (OD 5,1; 5 часов после первого добавления глюкозы) 30°C, 120 об/мин + добавление глюкозы.

Результаты данных экспериментов показывают, что добавление глюкозы не приводит к увеличению значений OD/выхода клеточной массы штамма дикого типа, несмотря на потребление глюкозы. И наоборот, в колбах, в которые не добавляют глюкозу, наблюдаются более высокие значения OD (6 для предварительной культуры 1, 8 для предварительной культуры 2). В течение примерно 1 ч после добавления глюкозы OD остается неизменным (или даже несколько снижается) по сравнению с ростом в отсутствие добавления глюкозы. При периодическом добавлении глюкозы потребление снижается и дополнительное/аддитивное влияние на рост не наблюдается.

В отсутствие добавления глюкозы наблюдается сдвиг рН в щелочную область после потребления глюкозы, тогда как при периодическом добавлении глюкозы значение рН уменьшается (сравните фиг. 8, на которой изображена предварительная культура 1, и фиг. 9, на которой изображена предварительная культура 2). Данное явление наблюдается в обоих предварительных культурах (VK1, VK2), что указывает на отсутствие влияния номера поколения.

Если предварительную культуру, выращенную с периодическим добавлением глюкозы, вносят в свежую среду (разведение 1:14; VK3; фиг. 10, фиг. 11), наблюдаются те же характеристики роста (повышенные значения OD/сдвиг рН в щелочную область в отсутствие добавления глюкозы).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что концентрации глюкозы, превышающие сравнительно низкий предел (примерно 2,5 г/л), вызывают обратимое изменение метаболизма (глюкозы). Предположительно вещество, еще не идентифицированное, секретируется в среду, которая ингибирует дальнейший рост, даже если уровень глюкозы снова снижается ниже порогового уровня. После инокуляции в новую среду (VK3) это вещество разбавляется до концентрации ниже эффективного уровня.

Пример 6: Выращивание рекомбинантного, продуцирующего противораковую вакцину, штамма Salmonella typhi Ty21a (pVAX10.VR2-1) (= VXM01) в присутствии и в отсутствие подачи глюкозы.

Эксперимент, описанный в примере 5, проводят с использованием штамма VXM01, продуцирующего противораковую вакцину. Единственное отличие от способа, описанного в примере 5, заключается в том, что штамм трансформируют плазмидой pVAX10.VR2-1. Данные исследования проводят, чтобы подтвердить гипотезу, что характеристики роста продуцирующего штамма S. typhi Ty21a:pVAX10-VR2.1 (р), связанные с метаболизмом глюкозы, не зависят от плазмиды, и совпадают с характеристиками пустого штамма. Рост и периодическое добавление глюкозы для обоих штаммов сравниваются на фиг. 11 и фиг. 12.

Результаты показывают, что характеристики роста обоих штаммов (пустого S. typhi Ty21a и рекомбинантного продуцирующего штамма) сопоставимы. Данные, свидетельствующие о влиянии плазмиды, отсутствуют. Кроме того, хотя клетки, выращенные в отсутствии глюкозы, имеют морфологию, отличную от морфологии клеток, выращенных в присутствии глюкозы, для них не характерен более высокий клеточный лизис и более низкая стабильность плазмиды (в случае рекомбинантных клеток), чем у клеток, выращенных в присутствии глюкозы.

Таблица 3
Результаты измерения OD600 во время процесса ферментации
Время культиви-рования	Значения OD600
[h]	VK1a	VK1b	VK2	VK1a k	VK1b k	VK2a k	VK2b k
0	0,001	0,003	0,1	0,0	0,0	0,2	0,2
1			0,3			0,3	0,3
2,0			0,5			0,7	0,6
3,0	0,003		1,0			1,2	1,2
4,0			1,6			1,7	1,6
5,0	0,005		2,4			2,5	2,3
6,0			3,4			3,1	3,1
7,0			3,8			3,7	3,7
7,5	0,010					3,7	4,5
8,0			4,5
9,0	0,026
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0		1,6		1,8	2,1
16,0		2,2		2,6	2,8
17,0		2,8		2,8	3
18,0		3,2			3,1
19,0		3,7			3,0
20,0
21,0		5,1		4,2	3
22,0
23,0		6,1		5,3	3,1
24,0	5,9		7,3			3,8	8
25,0	6,3
26,0	6,9
27,0	7,3
28,0	7,6
30,0	7,5
39,0		7,0		7,6	3,2

Таблица 4
Концентрация глюкозы во время процесса ферментации
Время культивирования	Концентрация глюкозы (г/л)
[h]	VK1a k	VK1b k	VK2a k	VK2b k
0	2,4	2,4	2,5	2,6
1			2,5
2,0			2,4
3,0			2,3
4,0			1,7
5,0			4,8	1,0
6,0			3,9	0,1
7,0			3,1
7,5
8,0			2,2
9,0
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0	1,4	1,1
16,0	0,4	0,1
17,0		3,8
18,0		3,2
19,0		2,5
20,0
21,0		1,6
22,0
23,0		0,8
24,0			0
25,0
26,0
27,0
28,0
30,0
39,0		0,0

Таблица 5
Сдвиг значений рН во время процесса ферментации
Время инкубации	Значения pH
[h]	VK1a k pH	VK1b k pH	VK2a k pH	VK2b k pH
0	6,8	6,8	6,5	6,5
1			6,4	6,4
2,0			6,4	6,4
3,0			6,5	6,5
4,0			6,0	6,0
5,0			6,2	6,2
6,0			5,8	5,91
7,0
7,5
8,0			5,4	5,9
9,0
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0	5,7	5,6
16,0	5,6	5,6
17,0	5,7	5,4
18,0	5,8	4,4
19,0	5,7	5,3
20,0
21,0	6,1	5,2
22,0
23,0	6,6	5,1
24,0			5,7	8,28
25,0
26,0
27,0
28,0
30,0
39,0	8,0	5,1

1. Способ выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, несущего мутацию в гене galE, приводящую к потере функции, и содержащего по меньшей мере одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей эукариотическую кассету экспрессии, где способ включает в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном исходном значении рН в масштабе ферментации, в котором глюкозу не добавляют в среду в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы, где исходное значение рН составляет от 5 до менее чем 9, и где объем среды составляет по меньшей мере примерно 10 л.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ту21а.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что эукариотическая кассета экспрессии кодирует рецепторный белок VEGF, предпочтительно белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет примерно 80%, в особенности, где человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1.

4. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что буферная среда содержит пептон неживотного происхождения, где буферная среда предпочтительно представляет собой трипсиновый соевый бульон (TSB) неживотного происхождения.

5. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что объем среды составляет примерно от 10 до 10000 л, предпочтительно примерно от 30 до 1000 л, наиболее предпочтительно примерно от 100 до 500 л.

6. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что исходная концентрация глюкозы соответствует концентрации глюкозы в минимальной среде для культивирования бактерий или является более низкой, предпочтительно исходная концентрация глюкозы составляет примерно от 0 до 4 г/л.

7. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что исходное значение рН составляет примерно от 6 до 8, более предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5.

8. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что значение рН в течение указанного периода культивирования доводят до величины, составляющей примерно от 6 до 8, предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5.

9. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что ход роста определяют путем (i) измерения оптической плотности (OD), предпочтительно путем (ia) мониторинга оптической плотности культуры in situ, или путем (ib) отбора образцов и измерения их оптической плотности, либо путем (ii) измерения плотности клеток, предпочтительно (iia) микроскопически, или (iib) путем измерения электрического сопротивления, или (iic) с помощью проточной цитометрии, или (iii) путем измерения колониеобразующих единиц (значения КОЕ) в результате отбора проб и нанесения их на чашки с агаром.

10. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что клетки собирают до достижения оптической плотности примерно 6, предпочтительно при оптической плотности примерно от 5 до 6.

11. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ту21a, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, участок начала репликации рМВ1 и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2, под контролем промотора CMV, в особенности, где человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.