Композиции и способы для лечения во время не острых периодов после неврологического повреждения цнс

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается способа введения полипептида, содержащего подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный) домен, млекопитающему, где указанный способ включает: введение полипептида после неврологического повреждения у указанного млекопитающего и начало введения в пределах подострого окна после неврологического повреждения. Изобретение обеспечивает эффективное введение указанного фактора для ограничения повреждения головного мозга, восстановления функций и/или усиления восстановления после неврологического повреждения. 9 з.п. ф-лы, 19 пр., 4 табл., 18 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения относится к лечению неврологического повреждения центральной нервной системы. Более конкретно, изобретение относится к введению нейрегулина [например, глиального фактора роста 2 (GGF2)] субъекту во время не острого или хронического периода после травматического неврологического повреждения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Повреждения центральной нервной системы (ЦНС) представляют собой серьезную проблему здравоохранения. Эта категория повреждений включают такие события, как ишемическое повреждение, геморрагическое повреждение, проникающая травма и не проникающая травма. Повреждения ЦНС, как правило, излечивают не полностью, оставляя субъекта с некоторой степенью стойкой дисфункции в диапазоне от чрезвычайно легкой до смерти. Остаточная дисфункция может включать моторные, сенсорные, когнитивные, эмоциональные и вегетативные аномалии.

Ключевая категория неврологического повреждения ЦНС включает повреждение головного мозга. Повреждение головного мозга представляет собой разрушительное состояние, приводящее к некоторой степени стойкой нетрудоспособности, включая моторную, сенсорную и когнитивную недостаточность и эмоциональную неустойчивость, такую как посттравматическое стрессовое расстройство, синдром нарушения внимания, депрессия и эмоциональная неустойчивость. Широко распространенные причины повреждения головного мозга включают ишемический инсульт, геморрагический инсульт, субдуральную гематому, эпидуральную гематому, закрытую травму черепа (при ускорении/торможении, сотрясении и вращении), проникающее повреждение головного мозга (огнестрельные раны и повреждения другими летящими предметами).

Инсульт является третьей из главных причин смерти и главной причинной инвалидизации в западном мире. Инсульт, таким образом, представляет собой большую социально-экономическую нагрузку. Этиология инсульта может являться либо ишемической, что является причиной большинства инсультов, либо геморрагической. Ишемический инсульт может быть вызван тромбом, который формируется где-нибудь в другом участке организма и продвигается через кровоток к головному мозгу (эмболический инсульт) или сгустком крови, формирующимся внутри артерии головного мозга (тромботический инсульт). После массовой гибели клеток в зоне центра немедленного инфаркта из-за отсутствия глюкозы и кислорода, область инфаркта расширяется в течение нескольких суток, за счет вторичных механизмов, таких как глутаматная эксайтотоксичность, апоптотические механизмы и образование свободных радикалов. После неврологических повреждений (например, ишемического события) у животных и человека функции могут восстанавливаться в течение нескольких суток, недель и месяцев без каких-либо терапевтических средств. Зачастую, однако, это восстановление является только частичным, и животные и люди страдают от стойкой инвалидности, которая может включать моторную, сенсорную и когнитивную недостаточность.

Факторы риска, увеличивающие вероятность того, что у индивидуума разовьется инсульт, хорошо известны. Они включают, и не ограничены ими, факторы риска, которые нельзя изменить: пожилой возраст, наследственность, острая церебральная энцефалопатия, пол, предшествующий инсульт или инфаркт миокарда в анамнезе; и факторы риска, которые можно изменить, излечить или контролировать: высокое кровяное давление, курение сигарет, сахарный диабет, заболевание сонной или другой артерии, фибрилляция предсердий, другое заболевание сердца, серповидноклеточная анемия, высокий уровень холестерина в крови, плохое питание и отсутствие физической активности и ожирение.

До настоящего времени, не паллиативное лечение ишемического инсульта ограничено введением терапевтических средств в острой фазе после инсульта. Острая фаза лежит в диапазоне от времени начала неврологического повреждения (например, инсульта) до приблизительно шести часов после неврологического повреждения. После острой фазы следует подострая фаза, которая лежит в диапазоне от приблизительно шести часов до двух суток после неврологического повреждения. Соответственно, современные не паллиативные лекарственные средства применяют в попытке обращения окклюзии кровотока, восстановления насыщения головного мозга кислородом и ограничения степени потери структур головного мозга. Не существует лекарственных средств для лечения инсульта, отличных от tPA, для применения в острой фазе. У пациентов остается некоторый уровень дисфункции, который в лучшем случае может улучшиться каким-либо эндогенным образом в течение приблизительно 60 суток. Это восстановление можно только дополнять физиотерапией. К сожалению, у многих пациентов остается стойкая нетрудоспособность с небольшой надеждой на улучшение.

К настоящему времени, единственным лекарственным средством, одобренным Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) для лечения ишемического инсульта, является тканевой активатор плазминогена (tPA). tPA представляет собой сериновую протеазу, превращающую плазминоген в плазмин. Плазмин затем разрушает фибрин, являющийся компонентом тромбов, которые могут осуществлять окклюзию сосудов головного мозга и вызывать инсульты. Идеально вводить его в пределах трех часов от начала симптомов. Как правило, только 3%-5% индивидуумов, страдающих инсультом, попадают в больницу вовремя, чтобы для них рассматривали возможность этого лечения. В идеале, tPA вводят в пределах первых трех часов после окклюзии, но некоторые врачи-клиницисты могут вводить его настолько поздно, как через шесть часов после окклюзии. К сожалению, подавляющему большинству пациентов, пораженных инсультом, не удается достичь больницы вовремя, чтобы для них рассматривали возможность этого лечения. Тем пациентам, которые прибыли в больницу в пределах эффективного временного окна, tPA вводят в попытке обращения окклюзии кровотока, восстановления насыщения головного мозга кислородом и ограничения степени потери структур головного мозга. Однако, существуют некоторые существенные противопоказания, ограничивающие постоянное применение tPA. После начального периода приблизительно 3-6 часов, чаще всего, tPA может вызывать интрацеребральное кровотечение и геморрагический инсульт. По этим причинам, введение tPA ограничено острой фазой для достижения какой-либо терапевтической эффективности.

До настоящего времени не одобрено другой терапии для лечения инсульта. Другие экспериментальные виды терапии, такие как доставляемая в артерии про-урокиназа, исследуют в качестве потенциальных средств разрушения тромбов и восстановления кровотока. В научной литературе, однако, описано множество средств, как доказано, являющихся благоприятными для защиты вещества головного мозга и восстановления функций в экспериментальных моделях инсульта на животных. Все эти средства сфокусированы на уменьшение в острой фазе гибели клеток, воспаления и апоптоза и должны, таким образом, быть доставлены в течение нескольких часов (некоторые вплоть до 24 часов) после ишемического события. До настоящего времени является общепринятым, что лечение повреждения ЦНС, такого как инсульт, необходимо в острой фазе. (Abe et al., 2008, J Cereb Blood Flow Metab. JuI 23, электронная публикация до печатной, Sun et al., 2008, Stroke JuI 10, электронная публикация до печатной, страницы еще не известны); Dohare et al., 2008, Behav Brain Res. 193(2):289-97; Belayev et al., 2001, Stroke 32(2):553-60).

Однако не показано, что такие средства ограничивают повреждение головного мозга, восстанавливают функции или усиливают восстановление после инсульта при введении после периода задержки нескольких часов, самое большее, в некоторых экспериментальных моделях, через приблизительно одни сутки после инсульта. Единственной терапией, для которой, как известно, показана эффективность в течение нескольких суток и недель после инсульта, является паллиативная или реабилитационная, например трудотерапия или физиотерапия. Действительно, авторам настоящего изобретения неизвестно, что для каких-либо агентов или лекарственных средств показано усиление восстановления в течение нескольких суток или недель после инсульта.

После острой окклюзии, часто присутствует локализованный участок поврежденного вещества головного мозга, окруженный зоной полутени, которая может погибнуть в течение нескольких часов, если не восстановить кровообращение. Время до гибели этой зоны полутени можно продлить на несколько часов в экспериментальных моделях с помощью нейропротекторов, таких как антагонисты NMDA, блокаторы кальциевых каналов, поглотители свободных радикалов и средства-ловушки, антиапоптотические средства, ингибиторы каспазы, ингибиторы parp и т.д. Для этой цели «нейропротектор» представляет собой что-то, что может сохранять нейроны до того, как они погибнут от множества инсультов, воздействующих на них в острой фазе. Однако, после 24-48 часов, мало надежды на защиту клеток от некротической гибели и, в то время как апоптотическая гибель продолжается в течение нескольких суток (См. фигуру 1). Не доказано, что терапевтическое окно для антиапоптотических лекарственных средств намного шире, чем для протективных лекарственных средств в острой фазе [Schulz et al., 1998, Cell Death Differ. 5(10):847-57; Komjati et al., 2004, Int J Mol. Med. 13(3):373-82].

Нейрегулин обладает нейропротекторными свойствами, для которых, подобно другим средствам, описанным выше, показано преимущество для уменьшения нетрудоспособности, наблюдаемое при введении животным в пределах нескольких часов после инсульта. См. патентную заявку Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/530884, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Принимая во внимание распространение неврологических повреждений, в частности, в отношении инсульта, существует необходимость в лекарственных средствах, которые можно эффективно вводить субъектам для ограничения повреждения головного мозга, восстановления функций и/или усиления восстановления после неврологического повреждения.

Нейрегулины (NRG) и рецепторы NRG включают систему фактор роста-рецепторная тирозинкиназа для передачи сигнала от клетки к клетке, которая вовлечена в органогенез в нервной, мышечной, эпителиальной, и других тканях (Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7:247-262, 1996 и Burden et al., Neuron 18:847-855, 1997). Семейство NRG состоит из четырех генов, кодирующих многочисленные лиганды, содержащие подобные эпидермальному фактору роста (EGF), иммуноглобулинам (Ig), и другие узнаваемые домены. Многочисленные секретируемые и связанные с мембраной изоформы функционируют как лиганды в этой системе передачи сигнала. Все рецепторы для лигандов NRG являются членами семейства рецепторов EGF (EGFR) и включают EGFR (или ErbBl), ErbB2, ErbB3 и ErbB4, известные также как HER1 - HER4, соответственно, у человека (Meyer et al., Development 124:3575-3586, 1997; Orr- Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1867-71, 1993; Marchionni et al., Nature 362:312-8, 1993; Chen et al., J. Comp. Neurol. 349:389-400, 1994; Corfas et al., Neuron 14:103- 115, 1995; Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1064-1068, 1994; и Pinkas-Kramarski et al., Oncogene 15:2803-2815, 1997).

Четыре гена NRG, NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4, картированы в отдельных хромосомных локусах (Pinkas-Kramarski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9387-91, 1994; Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997; Chang et al., Nature 387:509-511, 1997; и Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9562-9567, 1997), и в совокупности кодируют разнообразное множество белков NRG. Продукты гена NRG-1, например, включают группу из приблизительно 15 отдельных структурно родственных изоформ (Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7:247-262, 1996 и Peles and Yarden, BioEssays 15:815-824, 1993). Первые идентифицированные изоформы NRG-1 включают фактор дифференцировки Neu (NDF; Peles et al., Cell 69, 205-216, 1992 и Wen et al., Cell 69, 559- 572, 1992), херегулин (HRG; Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992), фактор, индуцирующий активность рецепторов ацетилхолина (ARIA; Falls et al., Cell 72:801-815, 1993), и глиальные факторы роста GGF1, GGF2 и GGF3 (Marchionni et al. Nature 362:312-8, 1993).

Ген NRG-2 идентифицирован клонированием по гомологии (Chang et al., Nature 387:509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997; и Higashiyama et al., J. Biochem. 122:675-680, 1997) и посредством геномных подходов (Busfield et al., Mol. Cell. Biol. 17:4007-4014, 1997). кДНК NRG-2 известны также как происходящий из нервов и тимуса активатор киназы ErbB (NTAK; Инвентарный № в Genbank AB005060), ответвление нейрегулина (Don-1) и происходящий из мозжечка фактор роста (CDGF; Патентная заявка PCT WO 97/09425). Экспериментальное свидетельство показывает, что клетки, экспрессирующие ErbB4 или комбинацию ErbB2/ErbB4, по-видимому, обладают особенно сильным ответом на NRG-2 (Pinkas-Kramarski et al., Mol. Cell. Biol. 18:6090-6101, 1998). Известно также, что продукт гена NRG-3 (Zhang et al., выше) связывает и активирует рецепторы ErbB4 (Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13:1061-1067, 1998).

EGF-подобный домен присутствует в коре всех форм NRG и является необходимым для связывания и активации рецепторов ErbB. Выведенные аминокислотные последовательности EGF-подобных доменов, кодируемых тремя генами, являются приблизительно на 30-40% идентичными (попарные сравнения). Кроме того, по-видимому, существует по меньшей мере две субформы EGF-подобных доменов в NRG-1 и NRG-2, которые могут придавать различные виды биологической активности и тканеспецифической активности.

Ответы клеток на NRG опосредованы через NRG рецепторные тирозинкиназы EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4 из семейства рецептора эпидермального фактора роста. Высокоаффинное связывание всех NRG принципиально опосредовано через ErbB3 или ErbB4. Связывание лигандов NRG приводит к димеризации с другими субъединицами ErbB и трансактивации посредством фосфорилирования специфических остатков тирозина. В определенных экспериментальных условиях почти все комбинации рецепторов ErbB, по-видимому, способны формировать димеры в ответ на связывание с изоформами NRG-1. Однако, по-видимому, ErbB2 является предпочтительным партнером для димеризации, который может играть важную роль в стабилизации комплекса лиганд-рецептор. ErbB2 не связывает лиганд самостоятельно, но должен являться гетерологично спаренным с одним из других подтипов рецептора. ErbB3 не обладает тирозинкиназной активностью, но является мишенью для фосфорилирования другими рецепторами. Известно, что экспрессия NRG-1, ErbB2 и ErbB4 является необходимой для образования трабекул миокарда желудочка при развитии мыши.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому способу лечения после неврологического повреждения у млекопитающего. Способ основан на наблюдении, что терапевтических преимуществ полипептида, содержащего подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный) домен, можно достигать введением терапевтически эффективного количества полипептида млекопитающему; в конкретных вариантах осуществления лечение проводят на или через час 1, час 2, час 8, час 12, час 24, час 30, час 36, час 42, сутки 2 или позже после неврологического повреждения. В одном варианте осуществления изобретения лечение начинают после острого окна после повреждения. В одном варианте осуществления изобретения лечение начинают после подострого окна после повреждения. В одном варианте осуществления изобретения лечение начинают во время и еще продолжают после острого окна после повреждения. В одном варианте осуществления изобретения лечение начинают во время и еще продолжают после подострого окна после повреждения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к введению полипептида (или кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты), содержащего EGF-подобный домен, млекопитающему, начиная на сутки 1, 2 или 3, даже вплоть до суток 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 включительно; неделю или более чем одну неделю, две недели или более двух недель после неврологического повреждения; три недели или более трех недель после неврологического повреждения; четыре недели или более четырех недель после неврологического повреждения; один месяц или более одного месяца после неврологического повреждения; два месяца или более двух месяцев после неврологического повреждения; три месяца или более трех месяцев после неврологического повреждения; четыре месяца или более четырех месяцев после неврологического повреждения; пять месяцев или более пяти месяцев после неврологического повреждения; шесть месяцев или более шести месяцев после неврологического повреждения. В соответствии с настоящим изобретением EGF-подобный домен кодирован геном нейрегулина. Введение по изобретению включает введение пептида, содержащего EGF-подобный домен, или кодирующей его молекулы нуклеиновой кислоты, в количестве, эффективном для лечения в хронической фазе после неврологического повреждения у млекопитающего.

Другой аспект изобретения относится к способу стимуляции неврологического восстановления во время периода, лежащего за пределами острой или подострой фазы после ишемического события у млекопитающего. Лечение по изобретению можно начинать в пределах острого или подострого периода, но оно включает по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть или более шести обработок за пределами острого или подострого периода, соответственно.

Способ по изобретению включает введение полипептида, содержащего подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный) домен, указанному млекопитающему, где указанный EGF-подобный домен кодирован геном нейрегулина (NRG)-1, и указанное введение проводят по меньшей мере через двое или трое, или четверо суток после ишемического события, хотя лечение можно начинать в пределах острых или подострых временных рамок, и в терапевтически эффективном количестве, достаточном для стимуляции неврологического восстановления во время хронической фазы после ишемического события у указанного млекопитающего.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, ген нейрегулина может представлять собой ген NRG-1, ген NRG-2, ген NRG-3 или ген NRG-4. Полипептид нейрегулина по изобретению может, в свою очередь, являться кодированным одним из этих четырех генов нейрегулинов; полипептид нейрегулина по изобретению может, в свою очередь, являться кодированным вариантом или гомологом любого одного из этих четырех генов нейрегулинов. См. на фиг.6A-6D последовательности аминокислот и нуклеиновой кислоты полноразмерного GGF2 человека, изоформы NRG-1.

В аспекте изобретения, подходящие млекопитающие включают, в качестве неограничивающих примеров, мышей, крыс, кроликов, собак, обезьян или свиней. В более конкретном варианте осуществления изобретения, млекопитающее представляет собой человека.

Определения

Как используется в настоящем документе, термин «приблизительно» включает указанное значение плюс или минус 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15% от указанного значения. В одном варианте осуществления, «приблизительно» обозначает 98-102% от указанного значения. В одном варианте осуществления, «приблизительно» обозначает 95-105% от указанного значения.

После повреждения, «острая фаза» лежит в диапазоне от времени начала неврологического повреждения (например, инсульта) до приблизительно шести часов после неврологического повреждения. За острой фазой следует «подострая фаза», которая лежит в диапазоне от приблизительно шести часов до двух суток после неврологического повреждения. В одном варианте осуществления «подострая фаза» лежит в диапазоне от приблизительно шести часов до трех суток после неврологического повреждения. Период после подострой фазы обозначают как «хроническая фаза» после неврологического повреждения. Пост-острая фаза включает как подострый, так и хронический периоды после повреждения.

Под «подобным эпидермальному фактору роста доменом» или «EGF-подобным доменом» понимают полипептидный мотив, кодируемый геном NRG-1, NRG-2 или NRG-3, который связывает и активирует ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их сочетания и обладает структурным сходством со связывающим EGF рецептор доменом, как описано в Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; Патенте США № 5530109; Патенте США № 5716930; Патенте США № 7037888; Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13:1061-1067, 1998; Chang et al., Nature 387:509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387:512- 516, 1997; Higashiyama et al., J Biochem. 122:675-680, 1997; и WO 97/09425). См. на фиг.7-12 последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность, соответствующие доменам 1-6 EGFL, кодируемого геном NRG-1.

Под «экспрессирующим вектором» понимают сконструированные с помощью генной инженерии плазмиду или вирус, полученные, например, из бактериофага, аденовируса, ретровируса, поксвируса, вируса герпеса, или искусственную хромосому, которые используют для переноса последовательности, кодирующей полипептид (например, нейрегулин), функционально связанный с промотором, в клетку-хозяина, так что кодируемый пептид или полипептид экспрессируется в клетке-хозяине.

Термины «неврологическое повреждение» и «повреждение» в настоящем документе часто используют взаимозаменяемо, «неврологическая травма» представляет собой один вариант «неврологического повреждения», и ее, как правило, можно рассматривать как синоним. «Неврологическое повреждение» представляет собой повреждение, вызывающее некоторое разрушение или гибель нервной ткани. Неврологическое повреждение, как правило, имеет в качестве последствий некоторые потери, например, снижение ментальной, сенсорной или мышечной функции.

«Нейропротектор» представляет собой что-то, что может сохранять нейроны до того, как они погибнут от множества инсультов, воздействующих на них в острой или подострой фазе после повреждения. После острой окклюзии часто присутствует локализованный участок поврежденного вещества головного мозга, окруженный зоной полутени, которая может погибнуть в течение нескольких часов, если не восстановить кровообращение. Время до гибели этой зоны полутени можно продлить на несколько часов в экспериментальных моделях с помощью «нейропротекторов», таких как антагонисты NMDA, блокаторы кальциевых каналов, поглотители свободных радикалов и средства-ловушки, антиапоптотические средства, ингибиторы каспазы, ингибиторы parp и т.д. Для этой цели «нейропротектор» представляет собой что-то, что может сохранять нейроны до того, как они погибнут от множества инсультов, воздействующих на них в острой фазе.

Под «нейрегулином» или «NRG» понимают полипептид, который является кодированным геном или нуклеиновой кислотой (например, кДНК) NRG-1, NRG-2, NRG-3 или NRG-4, и связывает и активирует рецепторы EGFR, ErbB1, ErbB2, ErbB3, или ErbB4, или их комбинации.

Под «нейрегулином-1», «NRG-1», «херегулином», «GGF2» или «лигандом p185erbB2» понимают полипептид, который связывает рецептор ErbB2 и является кодированным геном лиганда p185erbB2, описанным в Патенте США № 5530109; Патенте США № 5716930; и Патенте США № 7037888, полное содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Связывание с рецептором erbB2 может являться опосредованным через гетерологичное спаривание рецептора erbB2 с erbB1, erbB3 или erbB4.

Под «подобным нейрегулину полипептидом» понимают полипептид, который обладает EGF-подобным доменом, кодируемым геном нейрегулина, и связывает и активирует EGFR, ErbB1, ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4 или их комбинацию. Связывание с рецептором erbB2 может являться опосредованным через гетерологичное спаривание рецептора erbB2 с erbBl, erbB3 или erbB4.

Как применяют в настоящем документе, термин «неврологическое восстановление» используют для обозначения процесса, посредством которого нервная система восстанавливает свое функционирование до нормального состояния после повреждения, заболевания, инфекции или другого нарушения нервной системы, головного мозга, спинного мозга или периферических нервов.

Под «функционально связанным» понимают, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид (например, кДНК), и одна или несколько регуляторных последовательностей соединены таким образом, чтобы позволять экспрессию гена, когда соответствующие молекулы (например, белки - активаторы транскрипции) связываются с регуляторными последовательностями.

Как применяют в настоящем документе «пептид» содержит, в основном состоит из, или состоит из пептида приблизительно из: 625, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50 или менее 50 аминокислот.

Под «промотором» понимают минимальную последовательность, достаточную для управления транскрипцией. Изобретение относится также к тем промоторным элементам, которые являются достаточными для осуществления зависимой от промотора экспрессии гена, которую можно контролировать для типа клеток или физиологического статуса (например, состояние гипоксии против состояния нормоксии), или можно индуцировать внешними сигналами или средствами; такие элементы могут быть локализованы в 5'- или 3'-, или внутренних областях нативного гена.

Термин «терапевтически эффективное количество» предназначен для обозначения такого количества лекарственного средства или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или человека, как считает исследователь, ветеринар, лечащий врач или другой клиницист. Терапевтическое изменение представляет собой изменение поддающихся измерению биохимических характеристик в том направлении, которое, как ожидают, облегчает рассматриваемое заболевание или состояние. Более конкретно, «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для уменьшения симптомов, связанных с медицинским состоянием или инвалидностью, для нормализации функций организма при заболевании или нарушениях, приводящих к ухудшению конкретных функций организма, или для обеспечения улучшения одного или нескольких поддающихся измерению в клинических условиях параметров заболевания.

Как применяют в настоящем документе, термин «лечение» означает получение восстановления после неврологического повреждения, где в ином случае его бы не было; увеличение скорости естественного восстановления после неврологического повреждения; или стимуляцию восстановления до более высокого уровня функционирования. Без связи с теорией, не ожидают, что в хроническом окне после повреждения возможно уменьшать какую-либо дальнейшую гибель нервов, т.е., это понимают в том смысле, что нервы погибают ко времени начала хронического окна. Однако, лечение по изобретению включает во время хронического периода, например, уменьшение снижения функций или жизнеспособности ткани (например, мышцы или кости), которые в ином случае могут происходить в ткани, обслуживаемой входящим в ее состав нервом. Кроме того, лечение по изобретению включает во время хронического периода, например, уменьшение атрофии (например, мышцы или кости), которая в ином случае может происходить в ткани, обслуживаемой входящим в ее состав нервом.

Под «трансформированной клеткой» понимают клетку (или потомство клетки), в которую молекула ДНК, кодирующая нейрегулин или полипептид, обладающий EGF-подобным доменом нейрегулина, введена посредством способов рекомбинантной ДНК или известных способов генотерапии.

Если не определено иначе, все технические и научные термины применяемые в настоящем документе, обладают таким же значением, которое является общепринятым для обычного специалиста в области, к которой относится это изобретение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показана схема прогрессирующих фаз после инсульта/ишемии. На фигуре «OT» обозначает трудотерапию, и «PT» обозначает физиотерапию.

На фиг.2 показаны баллы поведения передних конечностей после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, NRG1, FGF или носителем, как указано. Для FGF и GGF2 при 100 мкг/кг показали значимое улучшение на сутки 21 теста поведения теста поведения. (¶, +, ¥, * обозначают значимые отличия от носителя для bFGF, NRG1, GGF2 при 6,5 мкг/кг и GGF2 при 100 мкг/кг по ANOVA и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.3 показаны баллы поведения задних конечностей после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, NRG1, FGF или носителем, как указано. GGF2 при 6,5 мкг/кг и NRG при 1,0 мкг/кг были значимо лучше носителя на сутки 7 и 14 тестирования поведения, но не в конечной точке исследования на сутки 21. GGF2 при 100 мкг/кг и FGF были значимо лучше носителя во всех моментах времени тестирования поведения после обработки. (¶, +, ¥, * обозначают значимые отличия от носителя для bFGF, NRG1, GGF2 при 6,5 мкг/кг и GGF2 при 100 мкг/кг кг по ANOVA и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.4 показаны баллы поведения поворота тела после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, NRG1, FGF или носителем, как указано. GGF2 при 100 мкг/кг и FGF были значимо лучше носителя на сутки 21. (¶, ⁺. ¥, * обозначают значимые отличия от носителя для bFGF, NRG1, GGF2 при 6,5 мкг/кг и GGF2 при 100 мкг/кг по ANOVA для повторных измерений и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.5A показаны баллы поведения передних конечностей после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, начиная на 1, 3 или 7 сутки после лигирования. GGF2 вводили при 0,1 мг/кг, IV ежесуточно в течение 10 суток. Баллы поведения передних конечностей были значимо лучше, чем для носителя, при всех парадигмах обработки во временной точке 21 сутки.(*, ¥, + обозначают значимые отличия от носителя для групп с началом обработки на сутки 1, 3 и 7, соответственно, по ANOVA для повторных измерений и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.5B показаны баллы поведения задних конечностей после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, начиная на 1, 3 или 7 сутки после лигирования. GGF2 вводили при 0,1 мг/кг, IV ежесуточно в течение 10 суток. Баллы поведения задних конечностей были значимо лучше, чем для носителя, когда обработку начинали на 1 или 7 сутки после лигирования, и были лучше по сравнению с носителем, когда обработку начинали на сутки 3 после лигирования, во временной точке сутки 21. (*, ¥, + обозначают значимые отличия от носителя для групп с началом обработки на сутки 1, 3 и 7, соответственно по ANOVA для повторных измерений и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.5C показаны баллы поведения поворота тела после постоянного лигирования средней мозговой артерии. Крыс обрабатывали GGF2, начиная на 1, 3 или 7 сутки после лигирования. GGF2 вводили при 0,1 мг/кг, IV ежесуточно в течение 10 суток. Баллы поворота тела были значимо лучше, чем для носителя, когда обработку начинали на 1 сутки после лигирования, и были лучше по сравнению с носителем, когда обработку начинали на сутки 3 или 7 после лигирования. (*, ¥, + обозначают значимые отличия от носителя для групп с началом обработки на сутки 1, 3 и 7, соответственно, по ANOVA для повторных измерений и апостериорному тесту Тьюки).

На фиг.6A-D показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность полноразмерного GGF2.

На фиг.7-12 показаны последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности подобных эпидермальному фактору роста (EGFL) доменов 1-6.

На фиг.13 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность подобного эпидермальному фактору роста пептида для гена NRG-1.

На фиг.14 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность подобного эпидермальному фактору роста (EGFL) бета-фрагмента из NRG-1.

На фиг.15 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность подобного эпидермальному фактору роста (EGFL) альфа-фрагмента из NRG-1.

На фиг.16 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность подобного эпидермальному фактору роста (EGFL) альфа-фрагмента из NRG-2 альфа.

На фиг.17 показаны последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность подобного эпидермальному фактору роста (EGFL) альфа-фрагмента из NRG-2 бета.

На фиг.18 показано выравнивание аминокислотных последовательностей различных EGF-подобных пептидов. EGF-подобный домен можно определить как суб-домены NRG, для которых выравнивание последовательности выявляет по меньшей мере 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 % гомологии аминокислотной последовательности по сравнению с молекулой EGF человека (последовательность P01133|971-1023, внизу выравнивания на фигуре). Гомологичные аминокислоты обладают идентичными, консервативными или полуконсервативными физико-химическими и структурными свойствами, как обозначено символами '*', ':' и '.', соответственно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано в настоящем документе, не паллиативное лечение ишемического инсульта до настоящего времени ограничено терапевтическим введением лекарственных средств в острой фазе после инсульта.

Немедленная гибель клеток обусловлена, по меньшей мере частично, недостатком кислорода, наблюдаемым на протяжении острой фазы. Более того, как показано на фиг.1, окклюзия кровотока приводит к высвобождению внутриклеточных запасов свободных радикалов, глутамата, и кальция и натрия, которые, как считают, разрушают ткани головного мозга и расширяют область повреждения.

Подострая фаза, приблизительно от шести часов до двух суток (или трех суток, по некоторым определениям) после неврологического повреждения, характеризуется продолжающимся высвобождением свободных радикалов, выбросом глутамата, высвобождением кальция и натрия, недостатком кислорода в области окклюзии и немедленной локализованной гибелью клеток. До настоящего времени не существует одобренных для применения в клинике средств для применения у человека во время подострой фазы после инсульта.

Как показано на фиг.1, ограниченное окно для фармацевтической терапии после неврологического повреждения по меньшей мере частично можно объяснить патофизиологией повреждения и его прогрессированием с течением времени. Например в пределах нескольких минут окклюзии, нейроны в центре инфаркта разрушаются. Несколько часов после окклюзии, свободные радикалы, эксайтотоксические и провоспалительные агенты высвобождаются/продуцируются, и эти молекулы продолжают разрушать ткани головного мозга и расширять область повреждения. Степень повреждения можно ограничить, как описано выше, посредством восстановления кровотока (с использованием одобренного для применения в клинике средства для разрушения тромбов, т.е., tPA) и таким образом, достижения восстановления снабжения кислородом пораженной области.

Как указано в научной литературе, различные соединения, по-видимому, обладают эффективностью в остром и подостром периодах. Однако, после отметок 24, 36 или 48 часов после неврологического повреждения ЦНС, потенциальные терапевтические средства прогрессивно теряют способность к лечению повреждения. Фактически, некоторые из терапевтических воздействий, например, tPA, которые оказывали эффект в остром периоде, начинают обладать серьезными, опасными для жизни противопоказаниями с течением времени после повреждения.

Несколько суток, недель или месяцев после ишемического события, во время хронической фазы после инсульта, способы терапии должны быть направлены на стимуляцию неврологического восстановления. Стимуляция неврологического восстановления после травматического события, такого как инсульт в центральной нервной системе, включает совершенно другие физиологические феномены и терапевтические способы, чем действовали в пре-хроническом окне. Пре-хронические способы лечения, как правило, включают средства, целью которых является восстановление кровотока и уменьшение острой гибели клеток. В отличие от этого, лекарственное средство, которое можно эффективно вводить через 48 часов или более, или через 72 часа или более после повреждения, отличается от лекарственных средств для острой фазы по его способности восстанавливать функции без изменения размера ишемического повреждения. В одном варианте осуществления, лечение по изобретению начинают после по существу полной гибели ишемического очага ЦНС после повреждения; под «по существу полной гибелью ишемического очага ЦНС после повреждения» понимают, что произошла гибель клеток ЦНС, являющаяся прямым последствием ишемического события, другая гибель клеток, вызванная возрастом или терапией (независимо от того, разработана ли терапия для нацеливания на ишемию), не входит в объем этого определения.

Как показано в настоящем документе, авторы настоящего изобретения показали, что нейрегулины являются эффективными для восстановления неврологической функции во время хронической фазы травматического неврологического повреждения. В одном варианте осуществления, травматическое неврологическое повреждение представляет собой ишемический инсульт. Как описано в настоящем описании, авторы настоящего изобретения сделали неожиданное открытие, что нейрегулин является эффективным, если дозирование начинают во время хронической фазы после ишемического события. Даже более неожиданным является открытие, что нейрегулин является эффективным, даже если дозирование начинают настолько поздно, как через 7 суток после ишемического события.

Настоящие данные показывают, что полученные благоприятные исходы не происходят по таким же механизмам, которые, как обнаружено, являются эффективными при лечении немедленно после ишемии. Лечение нейрегулином во время хронической фазы после инсульта не изменяет размер ишемического очага (смотри таблицу 1). Это ясно показывает, что острая и подострая фазы патофизиологии завершены в этих фазах, и нейрегулин, вводимый во время хронической фазы, стимулирует неврологическое восстановление, а не создает реперфузию и защиту нейронов.

Таблица 1
Объем инфаркта (%)
bFGF	21,3±3,3
NRG 1,0 мкг/кг	26,8±3,0
GGF2 6,5 мкг/кг	27,1±3,7
GGF2 100 мкг/кг	26,3±3,5
Носитель	25,0±3,5

Композиции по изобретению

Как указано выше, нейрегулины представляют собой полипептиды, кодируемые генами NRG-1, NRG-2, NRG-3 или NRG-4 и обладают EGF-подобными доменами, которые позволяют им связывать и активировать рецепторы ErbB. Holmes et al. (Science 256:1205-1210, 1992) показали, что одного EGF-подобного домена достаточно для связывания и активации рецептора p185erbB2. Соответственно, любой полипептидный продукт, кодируемый геном NRG-1, NRG-2, NRG-3 или NRG-4, или любой подобный нейрегулину полипептид, например, полипептид, обладающий EGF-подобным доменом, кодируемым геном или кДНК нейрегулина (например, EGF-подобный домен, содержащий субдомены C-C/D или C-C/D' пептида NRG-1, как описано в USPN 5530109, USPN 5716930, и USPN 7037888; или EGF-подобный домен, как описано в WO 97/09425), можно применять в способах по изобретению. Композиция по изобретению может присутствовать в единичной дозированной форме. Наборы, содержащие композиции по изобретению и/или инструкции по изобретению, также входят в объем настоящего изобретения.

Композиции по изобретению можно вводить пациентам вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Общепринятые фармацевтические способы применяют для получения составов или композиций для введения таких композиций пациентам или экспериментальным животным. Хотя внутривенное введение является предпочтительным, можно применять любой подходящий способ введения, например, парентеральное, подкожное, внутримышечное, интракраниальное, интраорбитальное, внутриглазное, интравентрикулярное, интракапсулярное, интраспинальное, интрацистернальное, внутрибрюшинное, интраназальное, аэрозольное, пероральное или чрескожное (например, посредством применения пластыря, несущего состав, способный пересекать дерму и проникать в кровоток) или местное введение.

Терапевтические составы могут присутствовать в форме жидких растворов или суспензий; для перорального введения составы могут присутствовать в форме таблеток или капсул; и для интраназальных составов, в форме порошков, назальных капель или аэрозолей. Способы, хорошо известные в данной области для получения составов, обнаружены, например, в «Remington's Pharmaceutical Sciences». Составы для парентерального введения могут, например, содержать наполнители, стерильную воду или солевой раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения или гидрогенизированные нафталины. Другие потенциально применимые системы парентеральной доставки для введения молекул по изобретению включают частицы сополимера этилена-винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые системы для инфузии и липосомы. Составы для ингаляции могут содержать наполнители, например, лактозу, или могут представлять собой водные растворы, содержащие, например, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, гликохолат и дезоксихолат, или могут представлять собой масляные растворы для введения в форме назальных капель или в форме геля.

Дополнительный аспект изобретения относится к настоящим соединениям для применения в качестве фармацевтического средства, особенно для лечения или предотвращения вышеупомянутых состояний и заболеваний. Настоящая заявка относится также к применению настоящих соединений в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения одного из вышеупомянутых состояний и заболеваний.

Что касается внутривенных инъекций, уровни доз, как правило, лежат в диапазоне от одного значения из следующего списка до наибольшего значения в списке: приблизительно 0,001 мг/кг, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг и приблизительно 10 мг/кг. Периодичность дозирования, как правило, лежит в равномерных интервалах времени от приблизительно каждых 24, 48, 72 или 96 часов. В альтернативном варианте осуществления, периодичность дозирования, как правило, лежит в равномерных интервалах времени от приблизительно каждых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 суток. В альтернативном варианте осуществления, периодичность дозирования, как правило, лежит в равномерных интервалах времени от приблизительно каждых 1, 2, 3, 4 или 5 недель. После периода такого дозирования можно применять менее частое дозирование, например, ежемесячно, каждые три месяца, каждые четыре месяца или ежегодно.

Чрескожные дозы выбирают так, чтобы обеспечивать по существу идентичные, сходные или более низкие физиологические уровни (в плазме, ткани, CSF), по сравнению с теми, которые достигают с использованием инъекционных доз.

Соединения по изобретению можно вводить в качестве единственного активного средства, или их можно вводить в комбинации с другими средствами, включая другие соединения, которые, как можно обнаружить, обладают такой же или сходной терапевтической активностью, и которые, как определили, являются безопасными и эффективными для такого комбинированного введения. Другие такие соединения, рассматриваемые для применения для лечения острого или подострого неврологического повреждения, включают гематопоэтические факторы (например, G-CSF и/или GM-CSF); вещества, обладающие тромболитической активностью, например, tPA, стрептокиназа, урокиназа, и/или Анкрод; антитромбоцитарные средства, такие как ацетилсалициловая кислота (аспирин), клопидогрел (Плавикс), аспирин, комбинированный с дипиридамолом с продленным высвобождением (Аггренокс); антикоагулянты, такие как варфарин (Кумадин) или Гепарин; и/или вещества, мешающие передаче сигналов апоптоза (например, ингибиторы каспаз) или прогестерон. Понятно, однако, что вышеуказанные соединения вводят в профилактических целях до инсульта (например, в случае антитромбоцитарных средств или антикоагулянтов), или во время острой фазы после инсульта (tPA).

Для оценки моторной, сенсорной или когнитивной недостаточности, которые эффективно лечат в соответствии с настоящим изобретением, несколько способов доступно в данной области. Хорошо известные показатели для мониторирования эффективности лечения, включающие краткую шкалу оценки психического статуса (MMSE), модифицированную краткую шкалу оценки психического статуса (3MS), измерение функциональных нарушений (FIM), тест Бартеля, показатель двигательной активности Фугля-Мейера, тест моторных функций Вольфа, тест моторной функции верхней конечности Джебсена-Тейлора, Ноттингемский профиль здоровья, часть 1 и шкалу оценки моторной активности (MAS), шкалу оценки моторной активности Сординга (SMES), шкалу равновесия Берга (BBS) и шкалу повседневной активности Бартеля (ADL), и другие клинические тесты, такие как измерения аффекта, речи, глотания, когнитивности, моторной координации, силы, чувствительности и функций вегетативной нервной системы, так же как показатели выживаемости и госпитализации, можно использовать для оценки прогрессирования заболевания.

После повреждения, заболевания, инфекции или другого разрушения нервной системы, головной мозг, спинной мозг или периферические нервы не функционируют правильно из-за какого-либо сочетания обширного повреждения, апоптоза, нарушенных путей передачи сигнала и синапсов, воспаления, измененной химической среды, изменений метаболизма клеток и изменений транскрипции и трансляции в клетках. Как применяют в настоящем документе, термин «неврологическое восстановление» используют для обозначения процесса, посредством которого нервная система восстанавливает свое функционирование до нормального состояния. Этот процесс может происходить посредством коррекции, обхода, обращения или прекращения любой из упомянутых выше причин.

Более того, в настоящее время считают, что значительное неврологическое восстановление может происходить благодаря процессу, известному как «пластичность», посредством которого в нервной системе формируются новые связи для компенсации других изменений или адаптации к ним. Повреждения ЦНС вызывают нарушения связей локального и отдаленного радиуса действия, приводя к нарушениям функций и нетрудоспособности. Пластичность представляет собой событие, когда новые связи формируются между существующими нейронами. Показано, что пластичность является механизмом неврологического восстановления в системах ЦНС, включая зрительную систему (Pizzorusso et al.,) и спинной мозг (Fawcett JW (2009) Brain 132:1417-1418.). При пластичности новые синапсы формируются или существующие синапсы усиливаются, ослабляются или удаляются, чтобы позволить существующим структурам и системам компенсировать те, которые были разрушены или нарушены при повреждении. Другие формы пластичности могут включать изменение нейрохимии существующих клеток для изменения прямой синаптической передачи сигнала и паракринной передачи сигнала. Пластичность может также принимать форму изменения уровней рецепторов, чтобы сделать нейроны и другие клетки более или менее чувствительными к прямой синаптической или паракринной передаче сигнала. Эти процессы являются общепринятыми в качестве механизма обучения и памяти.

Обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий и т.п. включено в это описание единственно с целью предоставления контекста для настоящего изобретения. Не предполагают или не представляют, что любой или все из этих объектов составляют часть основания из предшествующей области техники или представляют собой общеизвестные знания в области, относящейся к настоящему изобретению, до даты приоритета каждого пункта формулы этой заявки.

В то время как изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации, и что эта заявка предназначена, чтобы включать любые варианты, применения или адаптации изобретения, в основном следующие принципам изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания, которые лежат в пределах известной или общепринятой практики в области, к которой относится изобретение, и которые можно применять к существенным признакам, указанным в настоящем документе выше, и которые следуют из объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры могут помочь специалистам в данной области лучше понять изобретение и его принципы и преимущества. Подразумевают, что эти примеры иллюстрируют изобретение и не ограничивают его объем.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Материалы и методы

Подготовка животных

Пятьдесят (50) взрослых самцов Sprague-Dawley использовали для исследования (заказали 10 дополнительных животных). Всех крыс содержали и держали в руках для оценки поведения в течение семи (7) суток до хирургической операции с целью акклиматизации. В конце периода содержания, крыс случайным образом распределяли и записывали в различные группы. Крысам присваивали уникальный идентификационный номер посредством маркировки хвоста. Десять дополнительных крыс содержали так же.

Хирургическая подготовка

Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO), модель Тамура:

Эта модель хирургического повреждения у крыс является общепринятой моделью инсульта в данной области (Tamura et al, 1981, J Cereb Blood Flow Metab. 1(1):53-60; Tamura et al, 1981, J Cereb Blood Flow Metab. 1(1):61-9). Местные инфаркты головного мозга получали постоянной окклюзией проксимального отдела правой средней мозговой артерии (MCA) с использованием модификации способа Tamura et al. Самцов крыс Sprague-Dawley (300-400 г на время хирургической операции) подвергали анестезии 2-3% галотаном в смеси N₂O:O₂ (2:1), и поддерживали 1-1,5 % галотаном в смеси N₂O:O₂ (2:1). Височную мышцу разрезали пополам и отгибали через надрез, выполненный посредине между глазом и полостью среднего уха. Проксимальный отдел MCA обнажали посредством подвисочной краниэктомии без удаления челюстной дуги и без разрезания лицевого нерва. Затем артерию подвергали окклюзии микромощной биполярной коагуляцией от отдела, непосредственно проксимального по отношению к обонятельному тракту, до нижней вены головного мозга, и рассекали. Температуру тела поддерживали при 37,5°C±0,5°C на протяжении всей процедуры. Цефазолин (40 мг/кг; Baxter, Партия 06014.1, годный до января 2009), вводили внутрибрюшинно (i.p.) за одни сутки до MCAO и сразу после MCAO для предотвращения инфекций. Бупренорфин (NDC 12496-0757-1, Партия # 700Y02, годный до: 1 января 2010) s.c. (0,05-0,1 мг/кг) вводили перед хирургической операцией MCAO в качестве аналгезии.

Получение и дозирование соединений

GGF2 и NRG-1 (NRG-EGF)

Исходные растворы получали в Acorda Therapeutics и хранили при 0-5° C. Дозы составляли, как описано ниже:

Клонирование, экспрессия и очистка NRG-1 [домен EGF NRG1b2 (156Q)]

ДНК: Домен egf NRG1b2 клонировали из кДНК головного мозга человека и клонировали в вектор pet15b (Novagen кат # 69661-3) с использованием участков рестрикции Ndel и BamHl. Полученный белок составляет 6,92 кДа + His-метка ~3 кДа (=9,35 кДа).

Последовательность ДНК клона egf NRG1b2 в pet15

Подчеркнутые последовательности представляют собой участки клонирования (Nde1 и BamH1)

Конечный белок, транслируемый с вектора pet15b, показан ниже. Домен egf подчеркнут.

Теоретические pI/Mw: 7,69 / 9349,58

Экспрессия белка

Клоном трансформировали клетки B121 для экспрессии белка с использованием Экспресс-системы с автоиндукцей в течение ночи (Novagen) в среде LB при 25°C в течение 24 часов. Экспрессия происходила главным образом в нерастворимые тельца включения.

Повторное сворачивание белка: Адаптировано из набора для повторного сворачивания белка Novagen, 70123-3.

Очистка белка: Белок наносили на анионообменную колонку с DEAE при 2,5 мл/мин. Фрагмент NRG-1 оставался в проскоке, в то время как загрязнения связывались, и их элюировали при более высокой концентрации соли. Буфер для нанесения и промывки представляет собой 50 мМ Трис pH7,9, а буфер для элюции представляет собой 50 мМ Трис pH7,9 с 1М NaCl. Проскок объединяли и концентрировали с помощью Centriprep YM-3 от Millipore.

Вестерн-блоттинг: Экспрессию белка оценивали вестерн-блоттингом. Полученная полоса проходила приблизительно на уровне 10 кДа.

Разделяющий гель 4-20% (Biorad) использовали для разделения белков с последующим переносом на нитроцеллюлозную бумагу Protran (размер пор 0,1 мкм, из Schliecher and Schull). Блот блокировали в 5% молоке в TBS-T (0,1%). Первичное антитело (Поликлональное Ab против EGF NRG1-альфа человека/аффинно очищенное на HRG1-альфа кат # AF-296-NA из R&D systems) использовали в разведении 1:1000 в 5% молоке в TBS-T в течение 1 часа при RT (работает также при 4°C в течение ночи). Вторичное антитело кролика с HRP против антител козы использовали в разведении 1:10000 в 5% молоке в TBS-T в течение 1 часа при RT. Все промывки проводили в TBS-T.

Способ очистки NRG-1

Культуры выращивали при 25°C в Экспресс-системе 1 с автоиндукцей в течение ночи из Novagen (кат# 71300-4). Присутствует очень мало растворимый NRG-1. Культуру осаждали центрифугированием, и осадки выделяли, солюбилизировали и подвергали повторному сворачиванию, чтобы убедиться перед выделением, что NRG-1 может иметь место.

Материалы для экстракции, солюбилизации и повторного сворачивания

10X буфер для промывки: 200 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100 мМ ЭДТА, 10% Тритон X-100

10X буфер для солюбилизации: 500 мМ CAPS, pH 11,0

50X буфер для диализа: 1М Трис-HCl, pH 8,5

30% N-лаурилсаркозин – добавляли в виде порошка (Sigma 61739-5G)

1М DTT

Восстановленный глутатион (Novagen 3541)

Окисленный глутатион (Novagen 3542)

A. лизис клеток и получение телец включения

Оттаивали и повторно суспендировали осадок клеток в 30 мл 1X буфера для промывки. Перемешивали, как необходимо для полного ресуспендирования.

Добавляли ингибиторы протеаз (25 мкл 10 X на 50 мл), ДНКазу (200 мкл 1 мг/мл на 50 мл) и MgCl2 (500 мкл 1М на 50 мл) в суспензию.

Лизировали клетки обработкой ультразвуком.

a. Охлаждали клетки на льду на протяжении этой стадии.

b. С использованием квадратного наконечника обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд на уровне 6, 10 раз, пока суспензия не стала менее вязкой. Позволяли суспензии охлаждаться на льду в течение 60 секунд между каждыми обработками ультразвуком. Сохраняли объем не более 40 мл в 50 мл конической пробирке при обработке ультразвуком.

По окончании, перенесли каждую суспензию в 250 мл бутыли для центрифугирования с угловым горлом для использования с ротором F-16/250.

Собирали тельца включения центрифугированием при 10000×g в течение 12 минут.

Удаляли супернатант (сохраняли образец для анализа растворимого белка) и тщательно ресуспендировали осадок в 30 мл 1X буфера для промывки.

Повторяли центрифугирование, как на стадии 4, и сохраняли осадок.

Снова тщательно ресуспендировали осадок в 30 мл 1X буфера для промывки.

Собирали тельца включения центрифугированием при 10000 x g в течение 10 минут. Декантировали супернатант и удаляли последние следы жидкости постукиванием перевернутой пробирки по бумажной салфетке.

B. Солюбилизация и повторное сворачивание

По массе во влажном состоянии телец включения, подлежащих переработке, рассчитывали количество 1X буфера для солюбилизации, необходимого для повторного суспендирования телец включения в концентрации 10-15 мг/мл. Если рассчитанный объем превышал 250 мл, использовали 250 мл.

При комнатной температуре подготавливали рассчитанный объем 1X буфера для солюбилизации, дополненного 0,3% N-лаурилсаркозином (вплоть до 2% можно использовать, если необходимо, для дальнейшей оптимизации) (300 мг/100 мл буфера) и 1 мМ DTT.

Добавляли рассчитанное количество 1X буфера для солюбилизации со стадии 2 к тельцам включения и осторожно перемешивали. Большой дебрис можно разрушать повторным пипетированием.

Инкубировали в охлаждаемом встряхивателе при 25°C, 50-100 об./мин в течение 4-5 часов.

Осветляли центрифугированием при 10000×g в течение 10 минут при комнатной температуре.

C. Способ диализа для повторного сворачивания белка

Подготавливали необходимый объем буфера для диализа солюбилизированного белка. Диализ следует проводить по меньшей мере с 2 сменами буфера, более чем в 50 раз превышающими объем образца.

Разводили 50X буфер для диализа до 1X в желаемом объеме и дополнить 0,1 мМ DTT.

Диализовали в течение по меньшей мере 4 часов при 4°C. Сменили буфер и продолжали. Диализовали в течение дополнительных 4 или более часов.

Подготовили дополнительный буфер для диализа, как определено на стадии 1, но без DTT.

Продолжали диализ в течение двух дополнительных смен (минимум 4 час каждая), с буфером для диализа без DTT.

D. Окислительно-восстановительный буфер для стимуляции формирования дисульфидных связей

Подготавливали буфер для диализа, содержащий 1 мМ восстановленный глутатион (1,2 г/4 л) и 0,2 мМ окисленный глутатион (0,48 г/4 л) в 1X буфере для диализа. Объем должен быть в 25 раз больше, чем объем солюбилизированного образца белка. Охлаждали до 4°C.

Диализовали повторно свернутый белок со стадии 1 в течение ночи при 4°C.

Очистка

Все процедуры проводили при 4°C.

Химические вещества:

Гидрохлорид Триса (Sigma T5941-500G)

5M раствор хлорида натрия (Sigma S6546-4L)

Гидроксид натрия 10н (JT Baker 5674-02)

E. Очистка на анионной колонке DEAE HiPrep 16/10–20 мл (GE Healthcare)

Буфер A: 50 мМ Трис-HCL pH8,0

Буфер B: 50 мМ Трис-HCL с 1М NaCl pH 8,0

Уравновешивание колонки: Буфер A - 5CV, Буфер B - 5CV, Буфер A- 10CV

Наносили 50 мл образца на прогон на 20 мл колонку при 2,0 мл/мин (NRG-1 присутствует в проскоке).

Промывали 20 мл колонку 5CV буфера A

Промывали 20 мл колонку 5CV градиента до 100% B. Это элюирует примеси.

Очищали 10CV 100% буфера B.

Уравновешивали 15CV буфера A

Анализировали фракции в SDS-page с окрашиванием серебром

Объединяли фракции с NRG-1 (1OкДа)

F. Концентрация NRG-1

Концентрировали с помощью 15 мл концентратора Millipore Centriprep 3000 MWCO (Ultracel YM-3, 4320)

Использовали модифицированный анализ белка по Лоури для определения концентрации.

G. Удаление His-метки

Удаление His-метки выполняли с помощью набора для связывания после расщепления тромбином из Novagen (Кат# 69022-3). На основании предварительного тестирования, наилучшими условиями являются комнатная температура в течение 4 часов с тромбином при 0,005 ед. фермента на мкл для каждых 10 мкг белка NRG-1. Через четыре часа инкубации, добавляли 16 мкл суспензии стрептавидин-агарозы на единицу фермента тромбина. Поворачивали образец в течение 30 мин при комнатной температуре. Выделяли NRG-1 посредством фильтрации с центрифугированием или стерильной фильтрацией (в зависимости от объема). Полное расщепление определяли с помощью вестерн-блоттинга против EGF и с помощью анти-His.

H. Хранение в конечном буфере

Хранили в 1 X PBS с 0,2% BSA при 4°C.

Экспрессия и очистка GGF2

Клонирование и основную информацию для GGF2 смотри в USPN 5530109. Линия клеток описана в USPN 6051401. Полное содержание каждого из USPN 5530109 и USPN 6051401 приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Линия клеток CHO-(Alρha2HSG)-GGF: Эта линия клеток сконструирована для продукции достаточных количеств фетуина (Alρha2HSG человека), чтобы поддерживать высокие уровни продукции rhGGF2 в бессывороточных условиях.

Клетки Cho (dhfr^-) трансфицировали экспрессирующим вектором, показанным ниже (pSV-AHSG). Стабильные клетки выращивали под давлением ампициллина. Линию клеток обозначили (dhfr^-/α2HSGP). Затем клетки dhfr^-/α2HSGP трансфицировали вектором pCMGGF2, показанным ниже, содержащим кодирующую последовательность GGF2 человека, с использованием катионного липидного реагента DMRIE-C (Life Technologies #10459-014).

Линии клеток со стабильной и высокой экспрессией получали общепринятыми способами с использованием метотрексата (100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 1 мкМ) с интервалами 4-6 недель. Клетки постепенно адаптировали к не содержащей сыворотку среде. Клоны выделяли общепринятым способом лимитирующих разведений. Подробности требований к среде можно найти в вышеупомянутых публикациях.

Для усиления транскрипции кодирующую последовательность GGF2 помещали после интрона EBV BMLF-1 (MIS). См. фигуры ниже.

Последовательность MIS

Кодирующая последовательность GGF2

Последовательность белка GGF2 –

Продукция GGF2: Одну ампулу GGF2 с 2,2×10⁶ клеток/мл оттаивали в 100 мл среды Acorda 1 (смотри таблицу 2) и размножали до достижения достаточного числа для посева в сосуды для продукции. Клетки инокулировали в среду для продукции Acorda 2 (смотри таблицу 3) при 1,0×10⁵ клеток/мл в двухлитровых вентилируемых вращающихся флаконах. Вращающиеся флаконы поддерживали при 37°C в течение 5 суток и затем уменьшали температуру до 27°C на 26 суток. Во вращающихся флаконах мониторировали число клеток и общий внешний вид, но их не подпитывали. При жизнеспособности ниже 10% клетки осаждали центрифугированием и кондиционированную среду собирали и стерильно фильтровали.

Таблица 2
Среда 1
Компонент	Поставщик	Каталожный номер	Конечная концентрация
CD-CHO	Invitrogen	10743-029	удалить 50 мл, затем добавить компоненты ниже
FeSO4·ЭДТА	Sigma	F-0518	1× (10 мл/л)
L-глутамин	Cellgro	25-005-CI	4 мМ (20 мл/л)
Рекомбинантный человеческий инсулин	Sigma	I-9278	290 ед./л (1 мл/л)
Заменимые аминокислоты	Cellgro	25-025-CI	1× (10 мл/л)
Пептон типа 4 Соевые бобы - HySoy	Sigma	P0521	Порошок – Приготовить 20× в CD-CHO (50 мл/л)
Гентамицин	Invitrogen	15750-078	100 мкг (2 мл/л)

Таблица 3
Среда 2
Компонент	Поставщик	Каталожный номер	Конечная концентрация
CD-CHO	Invitrogen	10743-029	50% (сначала -50 мл)
HyQ SFX-CHO	HyClone	SH30187.02	50% (сначала -50 мл)
FeSO4·ЭДТА	Sigma	F-0518	1× (10 мл/л)
L-глутамин	Cellgro	25-005-CI	4 мМ (20 мл/л)
Рекомбинантный человеческий инсулин	Sigma	I-9278	290 ед./л (1 мл/л)
Заменимые аминокислоты	Cellgro	25-025-CI	1× (10 мл/л)
Пептон типа 4 Соевые бобы - HySoy	Sigma	P0521	Порошок – Приготовить 20× в CD-CHO (50 мл/л)
Гентамицин	Invitrogen	15750-078	100 мкг (2 мл/л)

Способ очистки GGF2

Все процедуры проводили при 4°C.

Химические реактивы:

Ацетат натрия

Ледяная уксусная кислота (для доведения pH)

10н NaOH (для доведения pH)

NaCl

Сульфат натрия

L-Аргинин (JT Baker кат #: 2066-06)

Маннит (JT Baker кат #: 2553-01)

Исходный материал: Супернатант кондиционированной среды. Доводили pH до 6,5.

Стадия 1

Связывание - Катионообменная хроматография

HiPrep SP 16/10 (Amersham Biosciences)

Уравновешивание колонки: Буфер A - 5CV, буфер B - 5CV, буфер 15%B - 5CV

Буфер A: 20 мМ ацетат Na, pH 6,0

Буфер B: 20 мМ ацетат Na, pH 6,0, 1М NaCl

Наносили образец при 2 мл/мин с непрерывной загрузкой в течение ночи, если возможно. Связывание лучше при непрерывной загрузке.

Максимальная емкость для исходного образца: 5 мг GGF2/мл среды

Скорость потока: 3 мл/мин

Первая промывка: 15%B, 10CV

Вторая промывка: 35% B, 10CV

Элюция GGF2: 60%B, 8CV

Промывка колонки: 100%B, 8CV

Буферы:	Состав	Проводимость	Применение
15%B	20 мМ ацетат Na, pH 6,0, 150 мМ NaCl		Предварительное уравновешивание
			Первая промывка
35%B	20 мМ ацетат Na, pH 6,0, 350 мМ NaCl		Вторая промывка
60%B	20 мМ ацетат Na, pH 6,0, 600 мМ NaCl		Элюция GGF2
100%B	20 мМ ацетат Na, pH 6,0, 1000 мМ NaCl	88 мСм/см	Промывка колонки

Стадия 2

Более тонкая очистка - Гельфильтрационная хроматография

Сефакрил S200 26/60

Буфер для элюции: 20 мМ ацетат Na, 100 мм Сульфат натрия, 1% маннит, 10 мМ L-аргинин, pH 6,5

Проводимость буфера.

Образец: Пул элюции SP GGF2, концентрированный вплоть до ~ AU280 1,0

Скорость потока: 1,3 мл/мин

Пик элюции: при ~ 0,36CV от начала инъекции

Стадия 3 Удаление ДНК и эндотоксинов – фильтрация через мембрану Intercept Q.

Буфер для предварительного уравновешивания: 20 мМ ацетат Na, 100 мМ сульфат натрия, 1% Маннит, 10 мМ L-Аргинин, pH 6,5 Собрать супернатант

Стадия 4 Конечный состав и подготовка образца

Добавляли дополнительный 90 мМ L-аргинин к образцу

Концентрировали

Стерильно фильтровали

Носитель/контрольное изделие, применяемое в настоящей заявке, представляет собой 0,2% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1M фосфат натрия, pH 7,6 или 0,1M фосфат натрия, pH 7,6, как указано.

Основной FGF

bFGF (PeproTech Inc., 100-18B, Партия 1206CY08 G2407) разводили, как указано в PeproTech, до исходного раствора 0,1 мг/мл и хранили при -20°C до использования. На сутки инъекции получали раствор 100 мкг/мл BSA (Roche Diagnostics, партия 12403328 годен до 31 марта 2008) в качестве разбавителя, для получения конечной концентрации bFGF 20 мкг/мл (1 мкг/50 мкл). Этот материал использовали только в исследовании 1.

Случайное распределение и сокрытие информации

Оперировали по пять животных в сутки. Исследователю, выполняющему хирургическую операцию и оценки поведения, не была известна регистрация для обработки каждого животного (за исключением группы с обработкой bFGF) до сбора всех данных.

Тесты поведения

Сенсомоторную функциональную активность оценивали с использованием тестов поведения расположения передних конечностей и задних конечностей, и поворота тела. Эти тесты проводили за одни (1) сутки до хирургической операции, через одни (1) сутки после хирургической операции и на третьи (3), седьмые (7), четырнадцатые (14) и двадцать первые (21) сутки после MCAO.

1. Расположение конечностей

Тесты расположения конечностей разделяли на тесты для передних конечностей и задних конечностей. Для теста расположения передних конечностей, исследователь держал крысу близко к поверхности стола и оценивал способность крысы помещать передние конечности на поверхность стола в ответ на стимуляцию вибрисс, визуальную, тактильную или проприоцептивную стимуляцию. Сходным образом, для теста расположения задних конечностей, исследователь оценивал способность крысы помещать задние конечности на поверхность стола в ответ на тактильную и проприоцептивную стимуляцию. Отдельные вспомогательные баллы получали для каждого способа сенсорного входа (возможны определения до половин баллов), и суммировали для получения общих баллов (для теста расположения передних конечностей: 0 = нормальное, 12 = максимально нарушенное; для теста расположения задних конечностей: 0 = нормальное; 6 = максимально нарушенное).

2. Тест поворота тела

Крысу держали приблизительно в одном дюйме (2,54 см) от основания хвоста. Затем ее поднимали на один дюйм (2,54 см) выше поверхности стола. Крысу держали по вертикальной оси, определенной как не более 10° к правой или левой стороне. Регистрировали поворот во всех случаях, когда крыса двигала головой от вертикальной оси в какую-либо сторону. Крыса должна была вернуться в вертикальное положение для учета следующего поворота. Всего учитывали тридцать (30) поворотов. Нормальная крыса, как правило, имеет равное число поворотов на каждую сторону. После фокальной ишемии крыса проявляет тенденцию поворачиваться на контралатеральную (левую) сторону.

На все сутки тестов поведения, животных тестировали до введения лекарственного средства. Временные точки обозначали с помощью суток хирургической операции (Сутки 0) в качестве точки отсчета.

Умерщвление и объем инфаркта

После оценок поведения на двадцать первые (21) сутки после MCAO крыс подвергали глубокой анестезии смесью Кетамина (50-100 мг/кг) и Ксилазина (5-10 мг/кг), внутрибрюшинно. Животным проводили транскардиальную перфузию нормальным солевым раствором (с гепарином, 2 единицы/мл), затем 10% формалином. Затем удаляли головной мозг и сохраняли в 10% формалине. Затем фиксированный головной мозг погружали в парафин, и получали коронарные срезы по 5 микрон с использованием микротома. Затем срезы окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Семь срезов (+4,7, +2,7, +0,7, -1,3, -3,3, -5,3 и -7,3, по сравнению с брегмой, соответственно) для каждого головного мозга фотографировали цифровой камерой, и площадь инфаркта на каждом срезе определяли посредством NIH Image (Image J) с использованием «непрямого способа» (площадь интактного контралатерального [левого] полушария – площадь интактных областей ипсилатерального [правого] полушария) для поправки на отек мозга. Затем площади инфаркта суммировали для срезов и умножали на толщину среза для получения общего объема инфаркта, который выражали как процент от объема интактного контралатерального полушария.

Пример 2: Эффект GGF2 (NRG-1) для усиления неврологического восстановления в модели постоянной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у крыс – Обработка, начатая во время острой фазы и продолженная после

Эффекты GGF2 и NRG-1: Функциональное восстановление после окклюзии MCA (MCAO) у крыс

Исследование 1 Экспериментальные группы (n=10)

NRG-1, 1,0 мкг/кг, 1 мл/кг внутривенно; через 1 час и один раз в сутки (q24) в течение 10 суток после MCAO

GGF2, 6,5 мкг/кг, 1 мл/кг внутривенно; через 1 час и q24 в течение 10 суток после MCAO

GGF2, 100 мкг/кг, 1 мл/кг внутривенно; через 1 час и q24 в течение 10 суток после MCAO

bFGF, интрацистернально, 1 мкг/50 мкл; Сутки 1 и Сутки 3 (положительный контроль) после MCAO

Носитель, 1 мл/кг внутривенно; через 1 час и q24 в течение 10 суток после MCAO (Носитель = 0,2% BSA/0,1 M фосфат натрия pH 7,6)

Все данные выражали как среднее ± S.E.M. Данные поведения и массы тела анализировали по ANOVA для повторных измерений (обработка на время X), если не указано иначе. Положительные F-значения для всех ANOVA, включая все группы, позволяли попарные ANOVA между группами. Данные объема инфаркта анализировали односторонним ANOVA.

Результаты

Тест расположения передних конечностей

Восстановление в группе GGF2, 100 мкг/кг, превосходило восстановление в группе носителя (p<0,001). Восстановление в группе bFGF превосходило восстановление в группе носителя (p<0,05). Не присутствовало значимых различий в восстановлении в группах GGF2, 6,5 мкг/кг или NRG, 1,0 мкг/кг, по сравнению с группой носителя. См. фиг.2.

Тест расположения задних конечностей

Восстановление в группе bFGF и GGF2, 100 мкг/кг, являлось значимо лучшим, чем в группе носителя (p<0,001), на все сутки тестирования поведения. Восстановление в группе GGF2, 6,5 мкг/кг, и NRG, 1,0 мкг/кг, являлось значимо улучшенным по сравнению с носителем на сутки 7 и 14 тестирования поведения, но этот эффект не сохранялся в конечной точке 21 сутки. См. фиг.3.

Тест поворота тела

Восстановление в группе bFGF и GGF2, 100 мкг/кг, являлось значимо улучшенным, по сравнению с носителем (p<0,05) в конечной точке тестирования поведения 21 сутки. Не присутствовало значимых различий в восстановлении в группе NRG, 1,0 мкг/кг, или GGF2, 6,5 мкг/кг, по сравнению с группой носителя. См. фиг.4.

Изменения массы

Не присутствовало значимых различий между группами.

Объем инфаркта: Не присутствовало значимых различий между группами. См. таблицу 1 выше.

Обобщение

Эти результаты показывают, что GGF2 действует зависимым от дозы образом и стимулирует функциональное восстановление в этой модели стойкого инсульта. Данные для задних конечностей с использованием более низкой дозы нейрегулина показывают, что продолжающееся лечение может приводить к продолжающимся улучшениям.

Пример 3: Эффект распределения введения по времени (задержка после повреждения) при дозировании GGF2 на усиление неврологического восстановления при постоянной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у крыс, включая дозирование в хроническом периоде

Эффекты GGF2 на функциональное восстановление после MCAO у крыс

Экспериментальные группы (n=10)

GGF2, 0,1 мг/кг, (1 мл/кг) внутривенно; 10 ежесуточных инъекций, начиная на Сутки 1 после MCAO

GGF2, 0,1 мг/кг, (1 мл/кг) внутривенно; 10 ежесуточных инъекций, начиная на Сутки 3 после MCAO

GGF2, 0,1 мг/кг, (1 мл/кг) внутривенно; 10 ежесуточных инъекций, начиная на Сутки 7 после MCAO

Носитель, 1 мл/кг внутривенно; 10 ежесуточных инъекций, начиная на Сутки 1 после MCAO

(Носитель = 0,1M фосфат натрия pH 7,6)

Животным начинали вводить GGF2 или носитель внутривенно на Сутки 1, Сутки 3 или Сутки 7 в течение 10 суток после MCAO. Все свежие растворы готовили каждые сутки.

Результаты

Расположение передних конечностей

Восстановление в группе с началом обработки GGF2 на Сутки 1 являлось значимо улучшенным по сравнению с группой носителя во всех временных точках тестирования после обработки (на Сутки 3 (p<0,0001), на Сутки 7 (p<0,005), на Сутки 14 (p<0,0001) и на Сутки 21 (p<0,0001)). Для группы с началом обработки GGF2 на Сутки 3 показали значимые улучшения по сравнению с носителем на сутки 7 (p<0,05) и сутки 21 (p<0,05) Для группы с началом обработки GGF2 на Сутки 7 показали явное отклонение от угла наклона кривой восстановления по сравнению с носителем от Суток 7 (начало обработки) до Суток 14, где это различие становилось значимым на Сутки 21 (p<0,05). Эти данные показывают, что обработка настолько поздно, как через три и даже 7 суток после повреждения может вызывать значительные улучшения неврологической функции. Более продолжительная обработка может являться преимущественной и приводить к большим и более длительным эффектам. См. фиг.5A.

Расположение задних конечностей

Восстановление в группе с началом обработки GGF2 на Сутки 1 являлось значимо улучшенным по сравнению с группой носителя во всех временных точках тестирования после обработки (на Сутки 3 (p<0,05) и на Сутки 7, 14 и 21 (p<0,0001)). Для группы с началом обработки GGF2 на Сутки 3 показали улучшения, которые являлись значимо лучшими, чем для носителя на сутки тестирования 7 (p<0,001) и Сутки 14 (p<0,05, через сутки после окончания обработки), и проявляли тенденцию к значимости на Сутки 21 (p<0,065). Группа с началом обработки GGF2 на Сутки 7 являлась значимо улучшенной по сравнению с носителем в конечной точке исследования на Сутки тестирования 21 (p<0,05). Фигура 5B.

Поворот тела: Восстановление в группе с началом обработки GGF2 на Сутки 1 было значимо лучшим, чем в группе носителя (p<0,001). Существовала тенденция к восстановлению в группе с началом обработки GGF2 на Сутки 3 и в группе с началом обработки GGF2 на Сутки 7, по сравнению с группой носителя. Фигура 5C.

Не присутствовало значимых различий по массе тела между группами.

Объем инфаркта: Не присутствовало значимых различий между всеми группами, как показано в таблице 4.

Таблица 4
Группа	% объема инфаркта
Носитель с началом обработки на Сутки 1	32,89±2,63
GGF2 с началом обработки на Сутки 1	27,62±2,48
GGF2 с началом обработки на Сутки 3	33,31±3,84
GGF2 с началом обработки на Сутки 7	27,30±2,87

Обобщение

В конечной точке исследования на Сутки 21 обнаружили, что обработка, начатая на Сутки 1, Сутки 3 или Сутки 7 после MCAO приводила к значимым улучшениям функции передних конечностей по сравнению с животными, обрабатываемыми носителем. Обработка, начатая на Сутки 1, Сутки 3 или Сутки 7 после MCAO приводила к значимым улучшениям функции задних конечностей по сравнению с обработкой носителем во время конкретных точек тестирования поведения, что коррелировало со временем обработки, указывая на то, что продолжительная обработка может приводить к преимущественному функциональному восстановлению, где воздействия, оказанные в эти поздние временные точки после повреждения, исключают возможность того, что эффект вызван нейропротекцией в острой фазе. Действительно, эти данные в сочетании с отсутствием значимого изменения объема инфаркта показывают, что улучшения обусловлены стимуляцией неврологического восстановления с помощью обработки GGF2. Это показывает, что существует длительное временное окно (пост-острое и пост-полуострое), и на протяжении этого времени можно вводить GGF2 в качестве эффективного терапевтического средства для хронической фазы инсульта.

Примечательно, что значимые (по статистике ANOVA) улучшения, наблюдаемые после введения GGF2 на 3 и 7 сутки после MCAO, представляют существенное расширение терапевтического окна, предлагаемого доступными ранее способами лечения острой фазы инсульта. Впервые в данной области, данные, представленные в настоящем документе, показали, что введение GGF2 является эффективным даже на протяжении хронической фазы инсульта. Кроме того, данные, представленные в настоящем документе, позволяют предполагать, что GGF2 вносит вклад в неврологическое восстановление после неврологического повреждения.

Пример 4: Лечение ишемического инсульта

Пациент поступил в медицинское учреждение с признаками и симптомами ишемического инсульта. Пациенту проводили реваскуляризацию с помощью tPA или другой терапии для восстановления кровотока. Хотя кровоток был восстановлен, возник некоторый уровень повреждения головного мозга. Через трое суток после повреждения проводили неврологическую оценку и показали, что он обладает поддающейся измерению сенсорной и/или моторной недостаточностью. Начиная с четвертых суток, после вторых суток и после суток 3, этого пациента лечили нейрегулином в дозе между 0,01 и 1,0 мг/кг на дозу, внутривенно на протяжении от 10 суток до 3 месяцев. У пациента успешно восстановлены сенсорная и моторная функция без сопутствующего использования трудотерапии или физиотерапии. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без терапии нейрегулином. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без использования трудотерапии или физиотерапии.

Пример 5: Лечение инсульта и возникшего в результате паралича правой руки

Пациент поступил в отделение неотложной помощи с параличом правой руки. После оценки и получения изображений определили, что пациент страдает ишемическим инсультом. Пациенту вводили tPA согласно одобренным способам, и кровоток посредством тромблизиса восстановился. Однако, спустя неделю после лечения tPA, у пациента присутствовал остаточный паралич правой руки, как измерено посредством общепринятых неврологических измерений моторной активности руки. Этого пациента лечили нейрегулином (0,01-1,0 мг/кг, IV) раз в неделю в течение 4 недель. Улучшение функций руки периодически измерял невролог или другой врач с помощью общепринятого неврологического тестирования, включая тестирование динамометром и другое тестирование силы. У пациента успешно восстановилась сенсорная и моторная функция правой руки без сопутствующего использования трудотерапии или физиотерапии. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без терапии нейрегулином. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без использования трудотерапии или физиотерапии.

Пример 6: Лечение ишемического инсульта

Пациент поступил в медицинское учреждение с признаками и симптомами ишемического инсульта. Обнаружили, что он страдает левосторонним параличом. Пациент вовремя не получал терапии для реваскуляризации. При клинической оценке обнаружили, что возникло некоторое повреждение головного мозга. Через трое суток после повреждения проводили неврологическую оценку пациента и показали, что он обладает поддающейся измерению сенсорной и моторной недостаточностью. Этого пациента лечили нейрегулином в дозе между 0,01 и 1,0 мг/кг на дозу, внутривенно каждые сутки в течение четырех недель. Он получал также физиотерапию. Улучшение заметили настолько рано, как на второй неделе лечения; восстановление продолжается на протяжении периода терапии нейрегулином. У пациента успешно восстановлены сенсорная и моторная функция левой стороны. Это восстановление рассматривают как отличное; и оно является намного лучшим, чем можно было клинически предсказать без нейрегулина с использованием одной физиотерапии.

Пример 7: Лечение ишемического инсульта

Пациент поступил в отделение неотложной помощи с параличом левой руки. Пациент сообщил, что проблема с его рукой началась «более недели назад». После оценки и получения изображений определили, что пациент страдает ишемическим инсультом. Пациенту не вводили tPA. После неврологического обследования обнаружили, что у пациента присутствует остаточный паралич левой руки, как измерено посредством общепринятых неврологических измерений моторной активности руки; пациент также страдал сенсорной недостаточностью. Пациент отказался подвергаться физиотерапии или трудотерапии. Этого пациента лечили нейрегулином (0,01-1,0 мг/кг, IV) один раз в неделю в течение 12 недель. Улучшение функций руки периодически измерял невролог или другой врач с помощью общепринятого неврологического тестирования, включая тестирование динамометром и другое тестирование силы. Улучшение заметили настолько рано, как на второй неделе лечения; восстановление продолжалось на протяжении периода терапии нейрегулином. У пациента успешно восстановлены сенсорная и моторная функция левой руки без сопутствующего использования трудотерапии или физиотерапии. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без терапии нейрегулином. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без использования трудотерапии или физиотерапии.

Пример 8: Травматическое повреждение головного мозга

Пациент поступил в медицинское учреждение после травматического события с признаками и симптомами повреждения головы и, как результат, повреждения головного мозга. Возникло некоторое повреждение головного мозга, как оценили посредством получения изображений и неврологического тестирования, включая шкалу комы Глазго и более детальное тестирование. Через пять суток после повреждения проводили неврологическую оценку пациента и показали, что он обладает поддающейся измерению сенсорной и моторной недостаточностью. Этого пациента лечили нейрегулином в дозе между 0,01 и 1,0 мг/кг на дозу, внутривенно в течение 3 месяцев. Первоначально пациент не желал подвергаться физиотерапии. Улучшение функций головного мозга заметили настолько рано, как на первой неделе лечения; восстановление продолжалось на протяжении периода терапии нейрегулином. Это восстановление является лучшим, чем можно было клинически предсказать без терапии нейрегулином. Начиная с трех месяцев пациенту начали вводить нейрегулин один раз в неделю, и его также начали подвергать физиотерапии. Совместная терапия продолжалось вплоть до одного года от суток первоначального повреждения. Через год после повреждения пациента его восстановление является экстраординарным. Клинически оно является намного лучшим, чем можно было предсказать в отсутствие какой-либо терапии, и оно также является лучшим, чем можно было ожидать при использовании физиотерапии.

Пример 9: Лечение церебральной геморрагии

Пациент поступил в медицинское учреждение с признаками и симптомами, соответствующими ишемическому инсульту или церебральной геморрагии. Пациент являлся стабильным. При неврологической оценке обнаружили, что возникло некоторое повреждение головного мозга. Через неделю после повреждения снова проводили неврологическую оценку пациента и показали, что он обладает поддающейся измерению сенсорной и/или моторной недостаточностью. Этого пациента лечили нейрегулином в дозе между 0,01 и 1,0 мг/кг ежесуточно, внутривенно в течение 10 суток, с последующим введением этой дозы один раз в неделю в течение 2 месяцев, и в этой точке все лечение прекратили. Улучшение функций головного мозга заметили настолько рано, как на первой неделе лечения; восстановление продолжалось на протяжении периода терапии нейрегулином. После отмены терапии нейрегулином восстановление пациента считают отличным с клинической точки зрения. Пациент возвращался для обследования через шесть месяцев, и затем через 12 месяцев после даты первоначального повреждения; при каждой оценке восстановление пациента считали отличным с клинической точки зрения.

Пример 10: Лечение повреждения NRG, включая лечение в подостром и хроническом периодах

Для обширного исследования критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, с клиническим доказательством неврологического повреждения.

Исследуемые показания

Ишемический инсульт с лечением тромболитическими средствами;

Ишемический инсульт без лечения тромболитическими средствами;

Геморрагический инсульт;

Закрытое травматическое повреждение головного мозга;

Проникающее травматическое повреждение головного мозга.

Исследованные диапазоны дозирования

0,001 мг/кг-10,0 мг/кг на дозу

Исследованная частота дозирования

Ежесуточно;

Через сутки;

Каждые четвертые сутки;

Раз в неделю;

Раз в две недели;

Раз в месяц;

Режимы со смешанной периодичностью

Ежесуточно в течение одной или двух недель и затем раз в неделю, раз в две недели, или раз в месяц в течение оставшегося времени исследования;

Через сутки в течение одной или двух недель и затем раз в неделю, раз в две недели, или раз в месяц.

Исследованное начало лечения

Как можно раньше после повреждения;

В пределах 6, 12, 24 и 48 часов после повреждения;

Через 72 часа после повреждения;

Через 7, 14, 30, 60, 90, 120 суток после повреждения.

Исследованная продолжительность лечения

Лечение в течение 1, 2, 4, 10, 30 недель;

Лечение в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев.

Исследованные функции

Моторная функция руки;

Моторная функция лица;

Речь;

Когнитивная функция;

Выживаемость;

Время до возвращения к работе;

Восстановление измеряли посредством общепринятых неврологических измерений.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение ментальной, сенсорной или мышечной функции, как измеряли посредством способов, известных в данной области, по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

В альтернативных вариантах осуществления исследовали сочетания менее, чем всех из вышеуказанных параметров.

Пример 11: Лечение NRG ишемического инсульта с односторонней слабостью и/или параличом руки (без тромболизиса)

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство инсульта основано на потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличе лицевого нерва или конечностей. Ишемический инсульт подтверждали получением радиографических изображений.

Пациентов выбирали из страдающих односторонней слабостью и/или параличом руки, которые не являлись кандидатами для лечения tPA (или другим тромболитическим средством) или которым ранее не вводили tPA по какой-либо причине. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо, начиная, как можно раньше после того, как они поступали в медицинское учреждение, включая больницу или кабинет врача, и для них ставили диагноз и получали изображения.

Для этого исследования лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения.

Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Восстановление измеряли посредством общепринятых неврологических измерений моторной активности руки, раз в две недели в течение продолжительности исследования.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение функций руки, как измеряли посредством способов, известных в данной области, по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 12: Лечение NRG одностороннего паралича лицевого нерва в отсутствие тромболитических средств

Пациентов выбирали из страдающих односторонним параличом лицевого нерва, которым не вводили или не могли вводить тромболитические средства. Функции оценивали посредством способов, известных в данной области, раз в две недели в течение периода дозирования 3 месяца. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение движения лицевой мускулатуры по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 13: Лечение NRG афазии или дизартрии в отсутствие тромболитических средств

Пациентов выбирали из страдающих афазией или дизартрией, которым не вводили или не могли вводить тромболитические средства. Функции оценивали посредством способов, известных в данной области, раз в две недели в течение периода дозирования 3 месяца. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение речевых способностей по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 14: Лечение NRG ишемического инсульта (с тромболизисом)

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство инсульта основано на потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличе лицевого нерва или конечностей. Ишемический инсульт подтверждали получением радиографических изображений.

Пациентов выбирали из страдающих односторонней слабостью и/или параличом руки и успешно прошедших лечение tPA или другими тромболитическими средствами. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо, начиная, как можно раньше после того, как они поступали в медицинское учреждение, после завершения постановки диагноза и получения изображений.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Восстановление измеряли посредством общепринятых неврологических измерений моторной активности руки, раз в две недели в течение продолжительности исследования.

Неблагоприятные события в основном являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение функций руки, как измеряли посредством способов, известных в данной области, по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 15: Лечение NRG пациентов с односторонним параличом лицевого нерва (с тромболитическими средствами)

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство инсульта основано на потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличе лицевого нерва или конечностей. Ишемический инсульт подтверждали получением радиографических изображений. Пациентов выбирали из страдающих афазией или дизартрией, которым вводили тромболитические средства.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Функции оценивали посредством способов, известных в данной области, раз в две недели в течение периода дозирования 3 месяца.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение речевых способностей по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 16: Лечение NRG пациентов с травматическим повреждением головного мозга

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство травматического повреждения головного мозга по потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличу лицевого нерва или конечностей с доказательством травмы или травмой в анамнезе. Пациентов с доказательством проникающего повреждения исключали. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо, начиная, как можно раньше после того, как они поступали в медицинское учреждение, включая больницу или кабинет врача, после постановки диагноза, получения изображений и получения согласия.

Для этого исследования лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения.

Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Функциональное восстановление оценивали посредством способов, известных в данной области.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 17: Лечение NRG пациентов с проникающим повреждением головного мозга

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство травматического повреждения головного мозга по потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличу лицевого нерва или конечностей с доказательством травмы или травмой в анамнезе. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов стабилизировали хирургически или посредством других мер. Ставили диагноз и получали изображения.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо, начиная, как можно раньше после того, как они поступали в медицинское учреждение, включая больницу или кабинет врача.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Функциональное восстановление оценивали посредством способов, известных в данной области.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение речевых способностей по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 18: Лечение NRG пациентов с геморрагическим инсультом

Критерии включения включали: взрослые, мужчины и женщины, доказательство инсульта основано на потере сознания, дезориентации, затрудненности речи, параличе лицевого нерва или конечностей. Геморрагический инсульт подтверждали получением радиографических изображений. Согласие получали от пациентов и/или кого-либо с правом подписи за пациентов.

Пациентов выбирали из страдающих односторонней слабостью руки.

Пациентов регистрировали и случайным образом распределяли для введения нейрегулина или плацебо, начиная, как можно раньше после того, как они поступали в медицинское учреждение, включая больницу или кабинет врача, после постановки диагноза, получения изображений и получении согласия.

Лечение начинали между 1 часом и 7 сутками после повреждения. Лечение продолжали в течение 3 месяцев с дозированием через сутки в течение 1 недели и затем раз в неделю в течение оставшегося периода лечения. Пациентам вводили дозы 0,0001-1,0 мг на кг, IV, IM или SC.

Восстановление измеряли посредством общепринятых неврологических измерений моторной активности руки, раз в две недели в течение продолжительности исследования.

Неблагоприятные события являлись мягкими и хорошо переносимыми.

Результаты: Для пациентов после лечения нейрегулином показали статистически большее улучшение функций руки, как измеряли посредством способов, известных в данной области, по сравнению с пациентами после лечения плацебо.

Пример 19: Наборы

Наборы представляют собой иллюстративный вариант осуществления изобретения. Набор может содержать внешнюю тару или контейнер, сформированную, чтобы вмещать один или несколько видов внутренней тары/контейнеров, инструментов и/или инструкций. Инструмент может включать предмет(ы) для введения лекарственного средства, такой как пластырь, аппарат для ингаляции, шприц или игла. Композиция по изобретению может содержаться внутри тары по изобретению. Тара по изобретению может содержать достаточное количество композиции по изобретению, чтобы использовать для множественного дозирования, или может представлять собой форму для единичного или однократного дозирования. Наборы по изобретению, как правило, содержат инструкции для введения в соответствии с настоящим изобретением. Любой способ введения, указанный или обоснованный в настоящем документе, может составлять некоторую часть инструкций. В одном варианте осуществления в инструкциях указано, что композиция по изобретению предназначена для введения один раз или более одного раза на протяжении подострого периода после повреждения. В одном варианте осуществления в инструкциях указано, что композиция по изобретению предназначена для введения один раз или более одного раза на протяжении хронического периода после повреждения. Инструкции можно прикреплять к любому контейнеру/таре по изобретению. Альтернативно, инструкции можно напечатать или проштамповать на таре или сформировать в виде компонента тары по изобретению.

На несколько публикаций и патентных документов ссылаются в этой заявке для более полного описания уровня техники в области, к которой относится это изобретение. Содержание всех публикаций и патентных заявок, упомянутых в этом описании, приведено в настоящем документе в качестве ссылки в такой степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что содержание каждой независимой публикации или патентной заявки приведено в качестве ссылки.

1. Способ введения полипептида, содержащего подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный) домен, млекопитающему, где указанный способ включает:

введение полипептида, содержащего подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный) домен, после неврологического повреждения у указанного млекопитающего; и

начало введения в пределах подострого окна после неврологического повреждения.

2. Способ по п.1, где указанную начальную стадию начинают по меньшей мере через трое суток после неврологического повреждения.

3. Способ по п.1, где указанную начальную стадию начинают по меньшей мере через семь суток после неврологического повреждения.

4. Способ по п.1, где EGF-подобный домен кодирован геном нейрегулина (NRG)-1, геном (NRG)-2, геном (NRG)-3, геном (NRG)-4.

5. Способ по п.1, где указанный полипептид представляет собой GGF2.

6. Способ по п.1, где указанное млекопитающее представляет собой человека.

7. Способ по п.1, где указанную начальную стадию начинают по меньшей мере через одни сутки после неврологического повреждения.

8. Способ по п.1, где введение продолжают после подострого окна после неврологического повреждения.

9. Способ по п.1, где неврологическое повреждение представляет собой ишемический инсульт или геморрагический инсульт.

10. Способ по п.1, где полипептид вводят в дозе 0,01-1 мг/кг массы тела.