Способы и системы для выявления и лечения опухолей, восприимчивых к антипрогестинам

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для подавления роста опухоли, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов. Для этого получают образец ткани пациента, которая предположительно является онкогенной или раковой. Выявляют прогестероновый рецептор-позитивных (PR-позитивных) клеток в образце ткани. Определяют степени распространения очагов прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток, имеющихся в указанном образце ткани. Вводят пациенту антипрогестин онапристон, если в указанном образце ткани присутствуют явно выраженные очаги скопления прогестеронового рецептора, которые превышают 5% от количества PR-позитивных клеток. Также предложены способы лечения пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, или у которого предположительно имеется опухоль, восприимчивая к ингибированию роста при действии онапристона, и система для отнесения опухоли к числу восприимчивых к лечению онапристоном. Группа изобретений обеспечивает лечение пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии онапристона. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 11 табл., 4 ил., 6 пр.

 

Предпосылки изобретения

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/542931, поданной 4 октября 2011, содержание которой включено в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

Прогестероновый рецептор (PR) присутствует в клетках в виде двух основных изоформ, PR-A и PR-B. В присутствии связанного прогестинового лиганда, такого как прогестерон, PR подвергается фосфорилированию по определенным сайтам, димеризуется, образует комплекс с рядом различных компонентов клеток (например, p300 и коактиватором стероидного рецептора) и связывается с определенными последовательностями ДНК, известными как прогестерон-респонсивные элементы (PRE), инициируя транскрипцию ДНК в РНК. Комплекс PR-лиганд также притягивает целый ряд других коактиваторов и корепрессоров, которые образуют клеточные компоненты, которые, в свою очередь, осуществляют транскрипцию определенных генов. Эти комплексы PR (известные также как очаги локализации) могут быть визуализированы в ядрах клеток, которые содержат прогестероновые рецепторы, в виде флуоресцирующих агрегатов с использованием иммуногистофлуоресцентных методик, а также в виде плотных ядерных агрегатов темной окраски, с использованием иммуногистохимических методик, описанных в настоящей заявке.

У женщины в предклимактерическом возрасте, во время фазы пролиферации (первой части менструального цикла), когда преобладающим гормоном является эстроген, а прогестерон секретируется в минимальных количествах, окрашивание нормальных клеток эндометрия для определения PR-A и PR-B (например, с использованием иммунофлуоресцентных методик и конфокальной микроскопии) выявляют диффузную модель окрашивания прогестеронового рецептора в ядре. В секреторной фазе (второй части менструального цикла), когда прогестерон является преобладающим гормоном, при использовании той же самой иммунофлуоресцентной методики и конфокальной микроскопии, окрашивание для выявления PR-A и PR-B показывает в ядре легко обнаружимые флуоресцентные агрегаты.

Было показано, что ингибиторы транскрипции РНК предотвращают образование очагов скопления PR, и было также показано, что ингибиторы протеасомы 26S разрушают очаги PR в ядрах. Поэтому считается, что наличие очагов скопления PR в клетках соответствует активным транскрипционным комплексам и указывает на активацию PR и следующую за ней экспрессию генов. Наоборот, диффузная модель окрашивания ядер или отсутствие очагов скопления PR указывает на присутствие PR, который является транскрипционно-неактивным. При действии нормальных тканей молочной железы и эндометрия (которые физиологически чувствительны к прогестерону) на прогестиновые лиганды можно наблюдать превращение диффузной модели окрашивания ядер в очаговые внутриядерные структуры, что указывает на активацию прогестеронового рецептора.

В то время как эстрогены оказывают митогенное действие (т.е. вызывают клеточную пролиферацию) на нормальные клетки эпителия молочной железы и эндометрия, действие прогестинов является более сложным. В эндометрии прогестины ингибируют развитие эстроген-индуцированного клеточного цикла на ранней фазе G1, тогда как в ткани молочной железы прогестины могут как стимулировать, так и ингибировать пролиферацию. Было показано, что в биопсии нормальной ткани молочной железы пролиферативная активность стимулируется прогестероном (Am J Obstet Gynecol, 1997). Эта неоднозначность привела к противоречивым экспериментальным данным при раке молочной железы. Например, прогестогены, по-видимому, оказывают непосредственное пролиферативное действие на клетки рака молочной железы in vitro, если используется среда, не содержащая фенолового красного. H.J. Kloosterboer, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 49, No 4-6, pp. 311-318, 1994. Однако, когда те же контрацептивные прогестогены, которые вызывают пролиферацию в линиях клеток рака молочной железы, исследовали в эстроген-зависимой модели рака молочной железы у крыс DMBA, они ингибировали прогрессирование опухоли. См. выше. В последнее время было показано, что многие из этих экспериментальных моделей in vitro являются неадекватными. См., например, Lange C. et al. Progesterone Receptor Action: Translating Studies in Breast Cancer Models to Clinical Insights. Chapter 7 в Innovative Endocrinology of Cancer; 94-111 (2010). Хотя в этих экспериментальных моделях была продемонстрирована вызванная прогестеронами пролиферация, большинство пролиферирующих клеток не экспрессировали PR. Таким образом, эти модели не обязательно предсказывают эффективность лечения антипрогестинами.

В злокачественных клетках также наблюдаются очаги скопления PR в ядрах, но их размер и состав отличаются от соответствующих очагов у нормальных клеток. Очаги скопления PR, наблюдаемые при раке, указывают на специфическую роль PR, которая согласуется со злокачественной природой клеток. Например, гены, активируемые под действием PR в злокачественных (раковых) клетках молочной железы, отличаются от генов, активируемых под действием PR в нормальных клетках молочной железы; в раковых клетках эндометрия очаги скопления PR, но не уровни PR, связаны с характеристиками злокачественности; очаги в раковых клетках крупнее, причиной чего могут быть изменения ремоделирования хроматина, которые часто встречаются при раке; очаги скопления PR в ядрах клеток рака молочной железы наблюдаются независимо от гормонального статуса (например, как при наличии, так и при отсутствии циркулирующего прогестерона, соответственно, у женщин в предклимактерическом и постклимактерическом возрасте). Очаги скопления PR наблюдались (например, с использованием иммунофлуоресцентных методик и конфокальной микроскопии) в опухолевых клетках примерно 50% PR-позитивных биопсий рака молочной железы человека. Образцы опухолей других пациентов демонстрировали диффузную модель PR окрашивания ядер опухолевых клеток при использовании иммунофлуоресцентных методик и конфокальной микроскопии, что указывает на не активированную или нефункциональную форму PR.

В большинстве случаев рак молочной железы поддается гормональному лечению (т.е. антиэстрогенами или ингибиторами ароматазы), которые в настоящее время являются одними из наиболее эффективных лекарственных средств, применяемых для терапии рака молочной железы. Гормональное лечение, как правило, назначают после идентификации рецепторов гормонов в раковых клетках. Онапристон (ONA) представляет собой антипрогестиновый препарат, который был первоначально разработан для применения в качестве контрацептива. Однако он продемонстрировал значительную активность при развитых формах рака молочной железы, при частоте реакции 10% в исследовании 101 пациента с раком молочной железы, имевших плохой прогноз, у которых оказалась неэффективной предшествующая гормональная терапия (например, рак молочной железы прогрессировал, несмотря на то, что пациент получал антиэстроген тамоксифен). В небольшом исследовании рака молочной железы, в котором ONA использовался в качестве гормонального лечения первой линии, ONA вызывал объективную частоту реакции 56%, т.е. обеспечивал эффективность на уровне верхней части диапазона результатов наилучших доступных средств для лечения этого заболевания. ONA связывается с PR, мешает фосфорилированию PR и не допускает димеризации PR. Комплекс PR-ONA слабо связывается или вообще не связывается с целевым сегментом ДНК и, следовательно, не активирует ремоделирование хроматина, которое необходимо для транскрипции ДНК. Было показано, что в системах in vitro ONA обращает образование агрегатов PR в ядрах за счет связывания искусственного лиганда с PR. Согласуясь с изложенным выше, исследования активации генов показали, что хотя прогестины и другие антипрогестины активируют прогестерон-респонсивные гены, ONA вызывает лишь минимальную активацию (т.е. 3 генов).

Кроме того, ONA является чистым антагонистом PR в концентрациях, которых можно достичь физиологическим путем. ONA не взаимодействует с другими стероидными рецепторами и не увеличивает секрецию эстрогенов у людей, которая является нежелательным побочным эффектом при терапии рака молочной железы, демонстрируемым другими антипрогестинами, такими как мифепристон.

Хотя онапристон был исследован ранее в качестве потенциального терапевтического агента для лечения рака молочной железы, его продвижение было остановлено по причине токсичности. Robertson et al., Onapristone, a Progesterone Receptor Antagonist, as First-line Therapy in Primary Breast Cancer European J. Of Cancer 35(2) 214-218 (1999). Важно выявить подгруппу пациентов с опухолями, которые, вероятнее всего, прореагируют на лечение, и столь же важно выявить подгруппу пациентов с опухолями, которые с наименьшей вероятностью прореагируют на лечение ONA и другими антипрогестинами. Выявление этих подгрупп даст пациентам с APF доступ к потенциально эффективному способу лечения рака, а пациентам, для которых лечение ONA или другими антипрогестинами не сможет принести пользы, избежать введения этих препаратов с нежелательной токсичностью.

В настоящее время только наличие или отсутствие эстрогеновых или прогестероновых рецепторов учитывается при принятии решения о том, применять ли эндокринное лечение в данном конкретном случае рака (например, рака молочной железы). Соответственно, стандартный анализ на PR подразделяет опухоли раковых пациентов на две категории: PR-позитивные или PR-негативные. Один из типов анализа позволяет количественно определять содержание PR от общего количества белка в клетке. Эти методы являются количественными и их можно легко автоматизировать, но они дают неудовлетворительные результаты в отношении точности, чувствительности и анализа клеточных субъядерных структур рецепторов. Второй тип анализа включает иммуногистохимические методы, в которых используются образцы тканей, зафиксированные формалином, и моноклональные антитела, меченные флуоресцентными частицами или хромофорами, нацеленные на рецепторы (либо по одному антителу для каждого из рецепторов PR-A и PR-B, или одно антитело, которое распознает оба рецептора). В случае применения иммуногистохимических методов, любая реакция окрашивания ядер, обнаружимая с помощью микроскопа в части клеток, превышающей определенный процент (как правило, ≥1%), считается PR-позитивной, согласно рекомендациям, известным в профессиональном сообществе. Как правило, в клинической практике для принятия решения о применении антигормонального лечения используется пограничное значение, составляющее ≥10% ER- или PR-позитивных клеток. При этом не принимается во внимание модель окрашивания клеток или ядер. Относительная интенсивность окрашивания (т.е. низкая, средняя или высокая) также используется как качественная мера позитивности относительно гормонального рецептора. Этот второй тип анализа является более трудоемким, и он не стандартизирован. Как правило, для IHC анализа используется микроскопическое исследование при низком увеличении для выявления наличия гормонального рецептора (либо эстрогенового рецептора (ER), либо PR). Используя традиционные методы, нельзя выполнить какой-либо анализ распределения клеток, кроме определения процентной доли опухолевых клеток, экспрессирующих идентифицированный гормональный рецептор. Исследование модели субъядерного распределения PR требует микроскопии с высокой разрешающей способностью. В противоположность этому, микроскопия с высокой разрешающей способностью не нужна для стандартного IHC определения гормональных рецепторов в ткани опухоли. Следовательно, эти стандартные методы определения гормональных рецепторов не способны дать информацию относительно субъядерного распределения PR.

Прогестины оказывают комплексное воздействие на ткани молочной железы и другие гормон-чувствительные ткани за счет нацеливания отдельных клеток и наличия косвенного влияния на клетки, не экспрессирующие PR. Комплексы в очагах скопления PR не являются качественно одинаковыми в нормальной ткани и раковой ткани, и они не обязательно активируют одни и те же гены, связанные с прогестероновым рецептором. Существующие клинические данные не полностью подтверждают точку зрения о том, что стандартные методики выявления клеток, позитивных в отношении гормональных рецепторов, способны предсказывать эффективность антигормональной терапии, независимо от того, направлена ли эта терапия против эстрогена или против прогестинов. В настоящее время решение о применении гормонального лечения (например, антиэстрогенов или ингибиторов ароматазы) у пациентов с раком молочной железы и с другими гормоночувствительными опухолями основывается на простом наличии гормональных рецепторов в образцах опухоли. Наличие гормональных рецепторов (ER или PR) не дает однозначной уверенности в реакции опухоли на гормональное лечение, поскольку только в 50-60% случаев опухолей, позитивных в отношении гормональных рецепторов, ожидается положительный эффект от лечения.

Существует потребность в унифицированном способе для предсказания эффективности ONA и других антипрогестинов против гетерогенных «естественных» опухолей. Кроме того, существует потребность в анализе, способном предсказывать терапевтическую эффективность ONA и других антипрогестинов против раковых заболеваний у индивидуальных пациентов.

Сущность изобретения

Важный вопрос, относящийся к лечению антипрогестинами, заключается в том, как идентифицировать активированные PR, которые являются подходящими мишенями для клинической терапии. Типовые способы по настоящему изобретению нацелены на выявление PR, находящихся в функциональном (активированном) состоянии, в тканях опухолей человека, которые можно легко получить в условиях клиники. Поскольку противодействие неактивным PR с помощью специфических антипрогестинов является терапевтически бессмысленным, способы по настоящему изобретению предоставляют новую и существенную информацию, служащую критерием для лечения пациентов антипрогестинами. Такой предсказательный диагностический тест мог бы обеспечить (1) унифицированные методы для принятия решения о лечении с применением ONA и других антипрогестинов, (2) критерии выбора индивидуальных пациентов и групп пациентов, которые, вероятнее всего, прореагируют на лечение, и (3) исключение тех индивидуальных пациентов, у которых маловероятна реакция или благоприятный результат от лечения антипрогестинами.

В одном из аспектов разработан способ выявления и лечения подгруппы прогестероновый рецептор (PR)-позитивных опухолей, наиболее восприимчивых к лечению антипрогестином, таким как онапристон (ONA). PR-позитивные опухоли, демонстрирующие плотную очаговую модель распределения PR в ядрах, которая описана в настоящей заявке, более восприимчивы к лечению антипрогестинами, такими как онапристон. Результаты, полученные для in vitro гомогенных экспериментальных моделей, не обязательно способны предсказывать свойства естественных гетерогенных опухолей.

В другом аспекте в изобретении предложен способ ингибирования роста опухоли, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов. Образец ткани, которая предположительно является онкогенной или раковой, можно отобрать из организма пациента. В образце ткани можно идентифицировать PR-позитивные клетки. Затем можно определить степень распространения очагов скопления прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток из образца ткани, и если эта степень распространения в указанном образце ткани превышает примерно 5% PR-позитивных клеток, пациенту можно вводить антипрогестин.

Эти пациенты с большей вероятностью получат пользу от лечения антипрогестинами (например, ONA), которые инактивируют очаги скопления активированного прогестерона (APF) и предупреждают дальнейшее образование APF, по сравнению с пациентами, опухоли которых не экспрессируют активированный PR. Не активированную форму PR, как правило, можно отличить по диффузному окрашиванию PR в ядрах. Инактивация APF под действием антипрогестина может осуществляться по любому из нескольких механизмов, включая разрушение очагов и ингибирование активации очагов без существенного изменения их структуры. В одном из аспектов образование APF можно ингибировать или предотвратить антипрогестином в результате действия нескольких механизмов. Например, онапристон может мешать индивидуальным прогестероновым рецепторам димеризоваться и предотвращает фосфорилирование PR по сайтам фосфорилирования лиганда. Комплекс PR-ONA может слабо связываться или вообще не связываться с целевыми сегментами ДНК (PRE) и не способен вызвать ремоделирование хроматина, которое необходимо для транскрипции ДНК. В другом примере другие антипрогестины могут давать PR возможность димеризоваться и образовывать комплексы с коактиваторами или корепрессорами, которые не вызывают транскрипцию ДНК.

В этом примере может происходить связывание ДНК по сегменту PRE, но при этом транскрипция не осуществляется. Идентификация APF может приводить к решению о лечении антипрогестином, если лекарственное средство препятствует сигнальному пути PR. В одном из аспектов идентификация APF определяет статус сигнального пути PR, т.е. активирован этот путь или нет. Например, посредством идентификации APF можно было бы определить целесообразность применения мифепристона или любого антипрогестина, который образует комплекс с PR и связывается с ДНК. Активность других агентов, включая те, которые могли бы ингибировать фосфорилирование PR и за счет этого препятствовать активации PR, можно было бы предсказать по наличию APF в тех или иных раковых клетках. Таким образом, идентификация APF могла бы использоваться для получения информации о целесообразности лечения с помощью различных классов соединений, которые действуют за счет ингибирования функции PR.

Опухоли пациентов, в которых не образуются очаги активированного PR (APF), могут включать опухоли, являющиеся PR-негативными по данным стандартного анализа, или опухоли, которые по данным стандартного анализа являются PR-позитивными. В одном из аспектов любая опухоль/раковая опухоль, в которой обнаруживаются APF, является кандидатом на лечение с применением антипрогестинов, включая рак молочной железы, рак мозга, менингиомы, рак предстательной железы, рак яичника, рак эндометрия, лейомиому матки, рак легкого и рак матки. Легочный лейомиоматоз, который ранее был формально отнесен к раковому состоянию, вероятно, также мог бы подвергаться успешному лечению, если в аномальной ткани сформировались APF. В другом аспекте доброкачественные опухоли, которые не поддаются лечению стандартными способами, но содержащие APF, можно лечить антипрогестином, поскольку наличие APF показывает, что развитие опухоли стимулируется аномальной активацией PR, т.е. сигнальным путем прогестина.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, путем получения образца ткани пациента, которая предположительно является онкогенной или раковой, и воздействия на указанную ткань антителом против рецептора прогестерона. За счет этого можно идентифицировать PR-позитивные клетки в указанном образце ткани. Можно определить степень распространения очагового связывания прогестеронового рецептора в ядрах клеток из образца ткани. Если степень распространения очагового связывания в указанном образце ткани превышает примерно 5% PR-позитивных клеток, пациенту вводят антипрогестин в дозе от примерно 10 до примерно 200 мг в день, в зависимости от эффективности, биодоступности и профиля безопасности антипрогестина.

В другом аспекте ткань представляет собой образец опухолевой ткани, выбранный из группы, состоящей из ткани молочной железы, ткани мозга, менингиом, ткани предстательной железы, ткани яичника, ткани эндометрия, лейомиомы матки, ткани легкого и ткани матки.

В другом аспекте наличие или отсутствие очагового распределения выявляется с помощью флуоресценции, колориметрической реакции (например, ферментной реакции), визуализацию которых проводят с помощью контрастно окрашивающих антител (например, хромофоров), радиоактивности и вестерн-блоттинга (например, дифференциального фосфорилирования PR).

В еще одном аспекте изобретения антипрогестин выбран из группы, состоящей из онапристона, лонапризана, мифепристона, PF-02413873, телапристона, лилопристона, ORG2058, асоприснила и улипристала.

Наличие очагового распределения активного прогестеронового рецептора выявляется по степени распространения очагов в ядрах, которая превышает примерно 5% PR-позитивных клеток. В другом аспекте опухоль может быть гетерогенной с точки зрения очагового распределения и демонстрировать активную модель связывания (A) с явно выраженными очагами скопления прогестеронового рецептора, диффузную модель связывания (D) без явно выраженных очагов скопления прогестеронового рецептора, или комбинацию модели A и модели D (AD) в различных участках опухоли.

В любом из перечисленных выше аспектов, если присутствует очаговое распределение (модели A или AD), интенсивность или плотность такого очагового распределения может быть оценена количественно. Например, антитела против прогестеронового рецептора могут нести радиоактивные метки, флуоресцентные метки, являться контрастно окрашенными антителами (хромофорами), их можно выявлять с помощью колориметрической реакции (например, ферментной реакции), или они могут нести другие метки, где можно измерить интенсивность сигнала метки и определить ее количество.

Описание чертежей

На фиг.1A и 1B показаны типовые модели иммуногистохимического окрашивания в коричневый цвет ядер клеток в образцах рака молочной железы человека, полученных из фиксированных формалином и заключенных в парафин биопсий с использованием антител, нацеленных на прогестероновый рецептор.

На фиг.2A и 2B показаны типовые модели иммуногистохимического окрашивания в зеленый цвет ядер клеток в образцах рака молочной железы человека, полученных из фиксированных формалином и заключенных в парафин биопсий с использованием антител, нацеленных на прогестероновый рецептор.

На фиг.3A и 3B показаны типовые модели иммуногистохимического окрашивания в коричневый цвет ядер клеток с контрастным окрашиванием фона HES в образцах рака молочной железы человека, полученных из фиксированных формалином и заключенных в парафин биопсий с использованием антител, нацеленных на прогестероновый рецептор; и

На фиг.4 показана процентная доля трех моделей связывания, A, AD и D для образцов рака молочной железы, позитивных в отношении PR-A и PR-B.

Подробное описание изобретения

Прежде чем описывать некоторые типовые аспекты настоящего изобретения, следует отметить, что изобретение не ограничено конкретными деталями конструкций или стадиями способов, которые изложены ниже по тексту. Описанные в заявке аспекты изобретения можно реализовать на практике или выполнить различными способами.

В настоящем описании фраза «лечение опухоли» означает ингибирование размножения опухолевых клеток, ингибирование распространения опухоли, уменьшение размера опухоли, уменьшение числа опухолевых клеток в организме, или облегчение или уменьшение симптомов заболевания, вызванного опухолью, ослабление роста опухоли (увеличение времени, которое необходимо для прогрессирования опухоли) или улучшение выживаемости пациентов, если смерть наступает от рака или от вторичных эффектов рака. Кроме того, указанный термин включает излечение рака. Опухоли включают как рак, так и опухоли, не являющиеся раком. Лечение считается терапевтическим, если достигается уменьшение смертности и/или болезненности, улучшение симптомов, связанных с опухолью, или если имеет место уменьшение нагрузки на организм от заболевания, которое может проявляться в сокращении числа опухолевых клеток в организме, уменьшении размеров опухоли или увеличении времени до прогрессирования заболевания, увеличении времени жизни без прогрессирования заболевания или увеличении времени жизни без заболевания.

В настоящем описании термин «APF-активный антипрогестин» и его эквиваленты относятся к антипрогестиновым препаратам, которые демонстрируют способность растворять или разрушать очаги скопления активированных PR (APF) в ядрах клеток или ингибировать образование APF в ядрах клеток, и это показывает, что механизм их действия включает сигнальный путь активации PR в клетке.

Термины «APF-позитивный», «позитивный в отношении очагов PR», «активированный PR», «PR в функциональном состоянии» и т.п. относятся к наличию агрегатов прогестероновых рецепторов в ядрах клеток.

Термин «очаговое распределение» относится к распределению в виде «очагов» (т.е. агрегатов прогестероновых рецепторов) в ядрах прогестерон-позитивных клеток. Пятнистая или гиперпятнистая модель распределения представляют собой термины, которые могут быть использованы в биологии в отношении очаговой модели распределения стероидных рецепторов в ядрах.

Термины «степень очагового распределения» или «степень распространения очагов» означают относительное количество очагов скопления PR в ядрах прогестерон-позитивных клеток. Степень очагового распределения можно определить количественно или качественно.

Например, для связывания с прогестероновыми рецепторами в ядрах клеток могут быть использованы колориметрические, ферментные или радиоактивные лиганды, например, антитела против прогестероновых рецепторов. Степень очагового распределения можно определить количественно, например, путем измерения интенсивности цвета, флуоресценции или уровня радиоактивного излучения, испускаемого меченым антителом. Степень очагового распределения можно определить качественно, сравнивая интенсивность связывания между контрольным образцом и меченым образцом с использованием светового микроскопа при подходящем увеличении, или с помощью методик, включая, но не ограничиваясь ими, микроматрицу ДНК, определение профиля белков, введение радиоактивных меток или другие аналогичные способы измерения APF.

Термин «диффузная модель» («диффузная структура») относится к мелкозернистой структуре, которая указывает на отсутствие очагового распределения.

Термин «прогестин» относится к природному или синтетическому прогестагенному веществу, которое имитирует некоторые или все действия прогестерона, также именуемому модулятором прогестеронового рецептора (PRM) или селективным модулятором прогестеронового рецептора (SPRM).

Термин «антипрогестин» относится к веществу, которое ингибирует образование, перенос, действие прогестагенных агентов или инактивирует их, в том числе, но не ограничиваясь ими, к онапристону, лонапризану, мифепристону, PF-02413873, телапристону, лилопристону, ORG2058, асоприснилу и улипристалу. PRM или SPRM могут обладать некоторыми антипрогестиновыми свойствами, и их можно считать антипрогестинами или прогестинами в зависимости от контекста их применения.

Термин «антитело» или «антитела» относится к белку, который способен специфично связываться с антигеном, и включает любые вещества или группы веществ, которые обладают специфичным сродством к связыванию с антигеном по сравнению со связыванием с другими веществами. Как правило, термин «антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, антитела животного или человеческого происхождения, гуманизированные антитела (например, антитела, у которых не связывающиеся фрагменты имеют человеческое происхождение, а связывающиеся фрагменты имеют животное происхождение) и их фрагменты.

Термины антитела «против PR-A» и «против PR-B» относятся к антителам, нацеленным на изоформы прогестеронового рецептора PR-A и PR-B, соответственно. Термин антитело «против PR-AB» относится к антителу, способному связываться с обоими рецепторами PR-A и PR-B. Конкретные антитела, подходящие для применения в различных аспектах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, PgR636 и PgR1294 (M.Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813)), Novacastra клон 16, клон SAN27, клон 1A6, Dako клон PgR636, Ventana, клон 1E2, Novus Biological клона антитела 1064-E2 против прогестеронового рецептора [p Ser162], Novus Biological клона антитела EP1516Y против прогестеронового рецептора [p Ser190], Novus Biological клона антитела 608 против прогестеронового рецептора [p Ser294], Abcam антитело Ref ab60954 против прогестеронового рецептора [p Ser400] и Genetex антитело Ref GTX118987 против прогестеронового рецептора [p Ser554].

Термин «вводить» относится к предоставлению лекарственного средства или средств, назначению одного или нескольких лекарственных средств или помещение одного или нескольких лекарственных средств в формуляр. Термин «предоставление» относится к дозированию лекарственного средства непосредственно в организм пациента любым подходящим путем введения (например, пероральным, инъекцией, внутривенным, внутримышечным, трансдермальным и т.д.) или предоставлению инструкций пациенту осуществить такое введение.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу ингибирования роста опухоли, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, включающему получение у пациента образца ткани, которая предположительно является онкогенной, и определения степени очагового распределения прогестеронового рецептора в ядрах клеток указанной ткани. Если степень очагового распределения превышает примерно 5%, пациенту можно вводить антипрогестин (например, онапристон, лонапризан, мифепристон, PF-02413873, телапристон, лилопристон, ORG2058, асоприснил и улипристал).

Хотя ранее проводились исследования роли PR, прогестинов и антипрогестинов при раке молочной железы и других видах рака, полученные результаты не позволили прийти к окончательным выводам, что вело к трудностям при диагностике и лечении пациентов. В ряде моделей в числе прочих факторов были продемонстрированы многочисленные и сложные взаимодействия различных частиц, штаммов, типов рака, канцерогенов и среды, окружающей опухоль. Без привязки к теории, PR может быть патологически активирован за счет изменившихся физиологических свойств, что влияет на активационный потенциал лиганда, приводя к аномальному и неуправляемому стимулированию роста и пролиферации клеток. Однако те модели, которые исследуются чаще всего, являются производными ограниченного числа исходных опухолей и, следовательно, неточно отражают физиологическую изменчивость различных типов опухолей или опухолей разных пациентов. То есть ограниченного количества моделей рака недостаточно для охвата всего многообразия раковых заболеваний, имеющихся в человеческой популяции.

Изучение образования очагов PR использовали для тестирования соединений на их способность вызывать транслокацию PR из цитоплазмы в ядро в клеточных линиях, созданных методами генной инженерии. В предназначенных для этого анализах, например, Thermo Scientific PR (Progesterone Receptor) Redistribution® Assay, используется анализ изображений и флуоресцентная микроскопия для количественного определения накопления PR в ядрах в присутствии тестируемого соединения. В противоположность этому, различные аспекты настоящего изобретения предназначены для определения очагов скопления PR в первичной опухолевой ткани, независимо от наличия лиганда PR или лекарственного средства. В одном из аспектов типовые способы, описанные в настоящей заявке, относятся к присутствию очагов скопления PR в ядрах клеток естественных опухолей, указывающему на аномалию, которая может использоваться для предсказания эффективности применения у данного пациента антипрогестинов, которые являются антагонистами PR. В другом аспекте в изобретении было обнаружено, что клиническое выявление конститутивно активированного PR указывает на опухоли и раковые заболевания, которые восприимчивы к лечению антипрогестинами, включая онапристон.

Онапристон (например, (8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(диметиламино)фенил]-17-гидрокси-17-(3-гидроксипропил)-13-метил-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-декагидроциклопента[a]фенантрен-3-он) имеет следующую химическую структуру:

Другие антипрогестины включают: прогестогенные G-лактоны 3-(6,6-этилен-17B-гидрокси-3-оксо-17A-прегна-4-ен-17A-YL)пропионовой кислоты, гамма-лактон 3-(6,6-этилен-17.бета.-гидрокси-3-оксо-17.альфа.-прегна-4-ен-17.альфа.-y-l)пропионовой кислоты следующие соединения:

Мифепристон

(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(диметиламино)фенил]-14-гидрокси-15-метил-14-(проп-1-ин-1-ил)тетрацикло[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]гептадека-1,6-диен-5-он

Лилопристон

(11-бета,17-бета,17(z))-ропенил);эстра-4,9-диен-3-он,11-(4-(диметиламино)фенил)-17-гидрокси-17-(3-гидрокси-1-p;11β-[4-(диметиламино)фенил]-17β-гидрокси-17-[(Z)-3-гидрокси-1-пропенил]эстра-4,9-диен-3-он

ORG2058

(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-этил-17-(2-гидроксиацетил)-13-метил-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-додекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-он

Лонапризан

(8S,11R,13S,14S,17S)-11(4-ацетилфенил)-17-гидрокси-13-метил-17-(1,1,2,2,2-пентафторэтил)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-декагидроциклопента[a]фенантрен-3-он

Асоприснил

(8S,11R,13S,14S,17S)-11[4-[(E)-гидроксииминометил]фенил]-17-метокси-17-(метоксиметил)-13-метил-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-декагидроциклопента[a]фенантрен-3-он

Улипристал

(8S,11R,13S,14S,17R)-17-ацетил-11-[4-(диметиламино)фенил]-17-гидрокси-13-метил-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-декагидроциклопента[a]фенантрен-3-он

PF-2413873

4-[3-циклопропил-1-(мезилметил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]окси-2,6-диметилбензонитрил

В другом аспекте настоящего изобретения очаговая модель связывания PR дает возможность провести более чувствительный и достоверный тест по сравнению с применяемым в настоящее время стандартным анализом PR. Пациенты, которые с помощью стандартных анализов PR отнесены как к числу PR-негативных, так и к числу PR-позитивных, могут оказаться позитивными при тесте на очаговую модель связывания PR в ядрах и, следовательно, могут стать кандидатами на лечение антипрогестинами, такими как онапристон. Так, например, пациента, ранее отнесенного к числу PR-негативных при использовании методов известного уровня техники, нельзя было бы считать кандидатом на лечение антипрогестинами, такими как онапристон. Наличие очагов PR у пациентов, отнесенных по результатам стандартных тестов к числу PR-негативных, могло бы объяснить кажущиеся аномалии, когда онапристон проявляет активность у некоторых из этих пациентов. Таким образом, некоторые аспекты настоящего изобретения могли бы сделать гормональное лечение потенциально доступным большему числу раковых больных, возможно, включая и тех пациентов с раком молочной железы, которые отнесены к числу «трижды негативных» (т.е. негативных в отношении эстрогенового рецептора (ER), PR и Her2).

Примеры иммуногистохимических методов, подходящих для применения в различных аспектах настоящего изобретения, описаны M.Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813) и M.Nadji (Anatomic Pathol. (2005) 123:21-27), причем указанные публикации включены в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки. В качестве примера, исходные образцы раковой ткани для исследования можно приготовить в виде парафиновых срезов или мазков, полученных после всасывания раковой ткани тонкой иглой, как известно в технике для стандартных анализов PR. При использовании парафиновых срезов на первом этапе плавят парафин, нагревая предметное стекло, и удаляют парафин ксилолом. Затем срезы повторно гидратируют, обрабатывая растворами с понижающимся содержанием этанола, и подвергают действию антитела, предпочтительно моноклонального антитела, которое специфично связывается с PR-A, PR-B или обоими рецепторами. Затем обнаруживают связывание антитела с использованием одного из методов, известных в технике для обнаружения связывания антител, примеры которых описаны ниже по тексту заявки.

Одним из примеров метода, подходящего для обнаружения связывания антитела с мишенью, является колориметрический анализ, как правило, ферментный колориметрический анализ. В одном таком методе для получения цветного окрашивания, видимого под световым микроскопом, используется пероксидаза. Перед инкубированием с антителом или антителами блокируют эндогенную пероксидазу в образце ткани, используя пероксид водорода, и, кроме того, блокируют эндогенный биотин, используя соответствующий реагент для блокирования биотина. Если исходное антитело является мышиным антителом, его впоследствии связывают с биотинилированным антимышиным иммуноглобулином. Для связывания фермента с комплексом антитело-мишень добавляют конъюгат стрептавидин-пероксидаза. Окраска появляется в результате добавления диаминобензидина и сульфата меди(II). Образец ткани можно подвергнуть контрастному окрашиванию с помощью красителя «зеленый прочный» для улучшения видимости окраски, обусловленной пероксидазой.

В качестве альтернативы, для обнаружения связывания антитела с PR-A, PR-B или обоими рецепторами можно использовать флуоресцентный метод. В этом случае первичное антитело с флуоресцентной меткой может быть связано с PR-мишенью и обнаружено непосредственно под флуоресцентным микроскопом. Однако неспецифическую флуоресценцию можно уменьшить с помощью метода, в котором происходит связывание немеченого первичного антитела с PR, а затем связывание флуоресцентно меченного вторичного антитела (например, антимышиного иммуноглобулина) с первичным антителом. В данном аспекте настоящего изобретения может использоваться любая флуоресцентная метка, известная для использования в иммуногистохимических анализах, например FITC (флуоресцеина изотиоцианат); флуоресцеин FITC 520 нм зеленый, Alexa 488 515 нм зеленый, фикоэритрин PE 565 нм желтый; фикоэритрин-Texas красный ECD 620 нм красный; фикоэритрин-цианин5 PC5 665 нм темно-красный; перидинин хлорофилл PerCP 670 нм темно-красный; фикоэритрин-цианин 5.5 PC5.5 703 нм дальний красный; фикоэритрин-цианин 7 PC7 755 дальний красный; E аллофикоцианин APC 660 нм темно-красный; аллофикоцианин-цианин 7 APC-CY7.

В описанных аспектах настоящего изобретения можно использовать как моноклональные, так и поликлональные антитела. Неполный перечень подходящих моноклональных антител описан M.Press, et al., см. выше, и в него входят два антитела, которые устойчивы к фиксации формалином и заключению в парафин (PgR636 и PgR1294). Конкретные антитела, подходящие для использования в описываемых аспектах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, PgR636 и PgR1294 (M.Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813)), Novacastra клон 16, клон SAN27, клон 1A6, Dako клон PgR636, Ventana, клон 1E2, Novus Biological клона антитела 1064-E2 против прогестеронового рецептора [p Ser162]; Novus Biological клона антитела EP1516Y против прогестеронового рецептора [p Ser190], Novus Biological клона антитела 608 против прогестеронового рецептора [p Ser294], Abcam антитело Ref ab60954 против прогестеронового рецептора [p Ser400] и Genetex антитело Ref GTX118987 против прогестеронового рецептора [p Ser554].

В одном из аспектов связывание антитела с PR определяют наблюдением окрашенного препарата под соответствующим световым микроскопом или флуоресцентным микроскопом. Для определения, например, процентной доли клеток, позитивных с точки зрения связывания с антителом, обычно используют увеличение примерно 200× или 400×. Однако для улучшения чувствительности обнаружения APF может быть желательным рассматривать препараты при увеличении 800×-1000×, для облегчения изучения субъядерных структур.

Образцы, которые кажутся PR-негативными при микроскопическом исследовании, можно изучить с помощью проточной цитометрии для выявления позитивных образцов, находящихся ниже предела обнаружения световой или флуоресцентной микроскопии. Если проточная цитометрия показывает наличие небольшого числа позитивных клеток, для изучения субъядерных структур и выявления очагов скопления активированных прогестероновых рецепторов (APF) можно использовать микроскопию с высоким увеличением 800×-1000×. Однако, если позитивные клетки, обнаруженные способом проточной цитометрии, слишком малочисленны, чтобы их можно было надежно выявлять микроскопией для анализа APF, можно использовать сортировщик флуоресцентно-активированных клеток (FACS) с целью отделения позитивных клеток в суспензии от остальных, на основе их флуоресценции (например, Sony Cell Sorter SH800, Siemens Immulite 2000). Поскольку в процессе разделения позитивные клетки концентрируются, но не повреждаются, надежность и вероятность успешной визуализации APF при последующей микроскопической оценке существенно повышается.

Наличие или отсутствие APF в ядре индивидуальной опухолевой клетки можно обнаружить визуально с помощью светового или флуоресцентного микроскопа, или с применением любых других подходящих средств, например, флуоресцентных или колориметрических измерений. В одном из аспектов для обнаружения могут использоваться визуальные средства. Результаты окрашивания могут быть определены количественно путем регистрации наличия или отсутствия APF, или путем подсчета количества или процентной доли позитивных клеток. В качестве альтернативы, можно количественно определить конкретные характеристики окрашивания. Например, детектирование может включать регистрацию того, сопровождается ли очаговое связывание в форме APF диффузным окрашиванием ядер, определением количества или процентной доли позитивных клеток, и/или количественным определением интенсивности или количества/плотности APF. Плотность APF можно количественно выразить в виде среднего количества очагов/число клеток или с использованием произвольной шкалы (например, «немного», «среднее количество» или «много») Аналогично, интенсивность можно определить с использованием произвольной шкалы, например, низкая/средняя/высокая, или числовой шкалы, например, 1-5. В другом аспекте результаты анализа опухолевой ткани пациента можно сравнить с позитивными и/или негативными контрольными образцами.

В одном из аспектов образец опухолевой ткани расценивают как APF-позитивный, если 1-100%, 5-100%, 25-100% или 50-100% ядер прогестерон-позитивных клеток в образце демонстрируют наличие APF. В еще одном аспекте терапевтическая эффективность APF-активного антипрогестина может также находиться в корреляции с интенсивностью окрашивания APF или с количеством или плотностью APF, и эти параметры также могут использоваться для определения восприимчивости опухоли к лечению APF-активным антипрогестином. Как правило, и без привязки к теории, восприимчивость опухоли к лечению APF-активным антипрогестином будет увеличиваться с увеличением количества или процентной доли позитивных клеток, увеличением интенсивности APF и/или увеличением числа APF в клетках образца опухолевой ткани.

В следующем аспекте способы определения восприимчивости опухоли к APF-активным антипрогестинам могут быть либо ручными (например, визуальное обнаружение с использованием флуоресцентного микроскопа), либо автоматическими или полуавтоматическими, в которых используются методы для быстрого сканирования, детектирования и количественного измерения колориметрически- или флуоресцентно-меченных образцов ткани. Например, в некоторых аспектах может быть разработана и применена система полностью автоматизированного сканирования и анализа. Хотя в одном из аспектов может быть использован ручной выбор конкретных областей опухоли, которые необходимо исследовать (например, иммуногистохимическая система InScape® (Quest Diagnostics 3 Giralda Farms Madison, NJ 07940)), с целью обеспечения автоматического сканирования всего образца и анализа образца, окрашенного с помощью антиген-специфичных иммуногистохимических методов может использоваться автоматизированная система для сканирования и анализа APF в ядрах клеток. В другом аспекте может быть использовано распознавание образцов для создания цифрового изображения всего среза окрашенной ткани. Антиген-специфичный компьютерный алгоритм может быть использован для анализа результатов, исходя из полученного цифрового изображения, представляющего весь образец. В еще одном аспекте можно настроить программное обеспечение для отделения очагов PR от диффузного фонового окрашивания в ядрах и измерения интенсивности флуоресценции и размера очагов, переходя от клетки к клетке или от кластера к кластеру, повторяя этот процесс для каждой клетки или кластера по всей площади образца. Эти автоматизированные методы, при более низкой стоимости, в некоторых аспектах позволят получить повышенную точность и реализацию функций, которые невозможно осуществить вручную. Полная автоматизация может также сделать тест доступным для реализации в неспециализированных медицинских центрах.

В одном из аспектов решение о лечении пациента по результатам диагностического анализа основывается на количестве/процентной доле, интенсивности и/или плотности APF, в случае их присутствия. Без привязки к теории, предполагается, что эффективность лечения APF-активным антипрогестином будет повышаться с увеличением количества или процентной доли позитивных клеток, увеличением интенсивности APF и/или увеличением количества APF в клетках образца опухолевой ткани. Исходя из этих параметров, практикующий медик может также определить дозировку, расписание введения и продолжительность лечения. Соответственно, другой аспект изобретения относится к применению APF-активного антипрогестина для лечения APF-позитивной опухоли.

Опухоли, которые следует выявлять или лечить описанными выше способами, включают любые раковые или не раковые опухоли, в которых присутствуют APF, и в которых можно определить наличие APF. Такие опухоли или раковые опухоли включают рак молочной железы, рак легкого, рак матки, лейомиому матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак мозга и ангиомы. Доброкачественные опухоли, которые можно идентифицировать или лечить согласно различным аспектам настоящего изобретения, включают менингиомы, 70% которых экспрессируют PR по данным стандартного анализа.

APF-активный антипрогестин, применяемый в описанных выше способах, может представлять собой любой антипрогестиновый препарат, обладающий способностью инактивировать APF (например, путем растворения или разрушения агрегатов, или предотвращения образования APF, или образования неактивных APF). Такие препараты включают онапристон (ONA), но другие соединения с аналогичным механизмом действия также подходят для применения в различных аспектах изобретения, описанных в тексте заявки.

Другой аспект изобретения относится к способам идентификации опухолей, восприимчивых к ингибированию роста под действием антипрогестинов, включающим отбор у пациента ткани, которая предположительно является онкогенной или раковой, и воздействие на указанную ткань антителом против прогестеронового рецептора. В образце ткани могут быть выявлены прогестерон-позитивные клетки. Можно определить степень очагового распределения прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток образца ткани, и антипрогестин можно вводить пациенту, если эта степень очагового распределения в указанном образце ткани превышает примерно 5% PR-позитивных клеток.

В еще одном аспекте представлен способ лечения пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов. Этот способ включает получение у пациента образца ткани, которая предположительно является онкогенной, и воздействие на указанную ткань антителом против прогестеронового рецептора. В указанном образце ткани могут быть выявлены PR-позитивные клетки, и может быть зафиксировано очаговое распределение связывания прогестеронового рецептора в ядрах клеток. Если очаговое распределение связывания в виде моделей A или AD превышает 5% от PR-позитивных клеток в образце ткани, антипрогестин вводят пациенту в дозе от примерно 10 до примерно 200 мг в день, в зависимости от эффективности, биодоступности и профиля безопасности антипрогестина.

В другом аспекте степень очагового распределения можно определить подходящим способом, рассмотренным в настоящей заявке, включая иммуногистохимические способы, иммунофлуоресцентные способы, микроматрицу ДНК, определение профиля белков, введение радиоактивных меток или другие аналогичные для измерения APF способы.

В следующем аспекте опухолевую ткань выбирают из группы, состоящей из ткани молочной железы, тканей менингиом, ткани предстательной железы, ткани яичника, ткани эндометрия, ткани лейомиомы матки, ткани легкого и ткани матки.

В еще одном аспекте антипрогестин выбирают из группы, состоящей из онапристона, лонапризана, мифепристона, PF-02413873, телапристона, лилопристона, ORG2058, асоприснила и улипристала.

В другом аспекте степень очагового распределения определяют путем выявления модели связывания прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток тканей. Гетерогенные опухоли включают клетки, которые могут содержать очаги активных прогестероновых рецепторов и очаги неактивных прогестероновых рецепторов. Поэтому могут иметься клеточные области, содержащие активные очаги, на которые указывают явно видимые сгущения в клеточных ядрах, и клеточные области, в которых наблюдается более диффузная структура.

Например, на фиг.1 изображены две типовые модели связывания, зафиксированные при окрашивании ядер в коричневый цвет с использованием антител против рецептора прогестерона в образцах тканей рака молочной железы человека, фиксированных формалином и заключенных в парафин, полученных из биопсий рака молочной железы пациентов. На фиг.1A показана диффузная зернистая модель (D), указывающая на клетки, которые вряд ли восприимчивы к лечению антипрогестинами. В противоположность этому, на фиг.1B показана пятнистая (крапчатая) модель связывания (A), указывающая на клетки, которые, вероятно, восприимчивы к лечению антипрогестинами. В смешанной модели, которая именуется моделью AD, сочетаются обе модели A и D.

В следующем аспекте антитело против рецептора прогестерона выбирают из группы, состоящей из анти-PR-A-антитела и анти-PR-B-антитела, смеси анти-PR-A и анти-PR-B антител и биспецифичных анти-PR AB антител.

В другом аспекте антипрогестин вводят в количестве от 10 до примерно 200 мг в день, в зависимости от эффективности, биодоступности и профиля безопасности антипрогестина. Без привязки к теории, полагают, что в результате выявления пациентов с опухолями, которые восприимчивы к лечению антипрогестинами, можно использовать более низкую дозу антипрогестина, что приводит к понижению риска токсических побочных эффектов. Так, например, более низкий диапазон доз может быть использован для пациентов, демонстрирующих степень очагового распределения прогестеронового рецептора более 5%. В одном из аспектов отнесение модели распределения к категориям A или AD могло бы привести к назначению различных доз, тогда как модель D могла бы показать, что лечение антипрогестином не оправдано.

В еще одном аспекте представлены способы скрининга противоопухолевых препаратов с точки зрения их способности инактивировать APF. Эти способы применимы, например, для выявления дополнительных антипрогестинов, которые могут быть кандидатами для применения в лечении APF-позитивных опухолей согласно способам, описанным в настоящей заявке. В одном из аспектов представлен способ скрининга лекарственного средства-кандидата по его способности уменьшать очаговое распределение прогестеронового рецептора в ядрах PR-позитивных клеток опухоли. Можно получить по меньшей мере два образца опухолевой ткани из одной и той же опухоли. Один из образцов опухоли можно подвергнуть воздействию лекарственного средства-кандидата. Затем образцы опухолевой ткани можно обработать антителами против прогестеронового рецептора и определить степень очагового распределения прогестероновых рецепторов в ядрах PR-позитивных клеток из образцов опухолевой ткани. Если очаговое распределение прогестеронового рецептора в образце опухолевой ткани, обработанном лекарственным средством-кандидатом, понижается по сравнению с образцом опухолевой ткани, который не обрабатывали лекарственным средством-кандидатом, то это лекарственное средство способно ослаблять очаговое распределение прогестеронового рецептора в PR-позитивных клетках опухоли.

Другой аспект настоящего изобретения относится к системе для отнесения опухоли к числу восприимчивых к лечению антипрогестином, включающей образец ткани и по меньшей мере одно антитело или связывающий фрагмент антитела, способные обнаружить прогестероновый рецептор. Антитело или связывающий фрагмент антитела могут быть использованы для определения степени очагового распределения прогестеронового рецептора в ядрах PR-позитивных клеток из образца опухолевой ткани. В другом аспекте опухоль восприимчива к лечению антипрогестином, если степень очагового распределения в ядрах PR-позитивных клеток превышает примерно 5%.

В следующем аспекте обнаружение ослабления наблюдаемого окрашивания APF служит признаком способности противоопухолевого средства дезактивировать APF. Обнаружение отсутствия значимого ослабления наблюдаемого окрашивания APF служит признаком отсутствия у противоопухолевого средства способности дезактивировать APF.

В другом аспекте APF-активный антипрогестин может быть использован в комбинации с дополнительным гормональным лечением, которое не действует через механизм инактивации APF (например, антиэстрогенами), для достижения улучшенной терапевтической эффективности по сравнению с любым из агентов при индивидуальном применении. В качестве альтернативы, APF-активный антипрогестин может быть использован в комбинации с одним или несколькими известными химиотерапевтическими агентами, которые не обладают APF-активностью по данным скрининга, для достижения улучшенной терапевтической эффективности по сравнению с любым из агентов при индивидуальном применении (например, в комбинации с такими средствами, как эверолимус, трастузумаб, TM1-D, анти-HER2 препараты, бевацизумаб, или химиотерапевтическим лечением такими агентами, как паклитаксел, доцетаксел, таксаны, доксорубицин, липосомальный доксорубицин, пегилированный липосомальный доксорубицин, антрациклины, антрацендионы, карбоплатин, цисплатин, 5-FU, гемцитабин и циклофосфамид). Например, эверолимус представляет собой ингибитор mTor, который показан в комбинации с ингибитором ароматазы и, в будущем, может быть показан в комбинации с антипрогестином.

В еще одном аспекте выявление наличия очагового распределения антитела против прогестероновых рецепторов в ядрах может служить признаком того, что опухоль пациента ранее лечили противоопухолевым препаратом, и она приобрела устойчивость к этому препарату, но по-прежнему восприимчива к APF-активному антипрогестину, такому как онапристон. В одном из аспектов этот способ может быть адаптирован для определения того, можно ли преодолеть невосприимчивость опухоли к химиотерапии, возникшую из-за предыдущего курса химиотерапии, путем лечения APF-активным антипрогестином. Преодоление такой устойчивости к химиотерапии, может быть основано на различных механизмах действия предыдущей химиотерапии и APF-активного антипрогестина.

Другой аспект относится к системе для определения опухоли как восприимчивой к лечению антипрогестином. Эта система включает образец ткани и по меньшей мере одно антитело или связывающий фрагмент антитела, способные обнаружить прогестероновый рецептор, где указанное антитело или связывающий фрагмент антитела используют для определения степени очагового распределения прогестеронового рецептора в ядрах клеток из образца опухолевой ткани, и где опухоль считается восприимчивой к лечению антипрогестином, если указанная степень очагового распределения превышает примерно 5%.

Пример 1

Образцы опухолей пациентов с раком молочной железы (инвазивная карцинома протоков) и раком эндометрия выбирали из архивов отделения патологической анатомии Oscar Lambert Cancer Center (Lille, France). Предварительно получали разрешение пациентов на использование их тканей для исследовательских целей. Получали образцы опухолевых тканей молочной железы и эндометрия, которые были зафиксированы в 4% формалиновом фиксаторе и заключены в парафин.

Иммуногистохимию (IHC) проводили на 3-4 мкм срезах архивных тканей опухолей молочной железы или эндометрия. Из образцов удаляли парафин, гидратировали и промывали рабочим буфером (0,05 моль/л Tris/HCl, 0,15 моль/л NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,6, Dako, Denmark код S3006). Демаскирование антигена проводили с помощью раствора Dako Target Retrieval Solution (модифицированный цитратный буфер, pH 6,1, Dako, Denmark, код S1699) на водяной бане при 98°C в течение 20 мин. Затем срезы покрывали блокирующим раствором Dako Peroxydase Block solution для блокирования эндогенных пероксидаз при комнатной температуре (КТ) в течение 5 мин (набор Dako EnVision® +/HRP Mouse (DAB+), Dako, Denmark, код K4007), промывали и инкубировали с первичными антителами в соответствующих оптимальных разбавлениях при КТ в течение 60 мин во влажной камере (таблица 1). После 5-мин промывания рабочим буфером использовали меченый полимер Dako Labelled Polymer (набор Dako EnVision® +/HRP Mouse (DAB+), Dako, Denmark, код K4007) для детектирования связывания первичного антитела при КТ в течение 30 мин. Затем для окрашивания субстрата использовали хромоген (DAB) в течение 5-10 мин при комнатной температуре, после чего осуществляли легкое контрастное окрашивание среза гематоксилином Джилла.

Образцы для отрицательного контроля получали заменой первичного антитела изотипом контрольного мышиного IgG1 (таблица 1) или чистым разбавителем для антител (отрицательный контроль с промывочным буфером) при иммуногистохимическом окрашивании.

Таблица 1
Антитела, применяемые для иммуногистохимии
Антитело против Клон Разбавления Хозяин/изотип Поставщик Код
PR форма A 16 1:100 (3,6 мкг/мл) Мышиный IgG1 Novocastra PGR-312-L-CE
1:200 (1,8 мкг/мл)
PR форма B SAN27 1:100 (0,4 мкг/мл) Мышиный IgG1 κ Novocastra PGR-B-CE
1:200 (0,2 мкг/мл)
PR формы A/B 1A6 1:40 (1,2 мкг/мл) Мышиный IgG1 Novocastra PGR-L-CE
1:80 (0,6 мкг/мл)
PR формы A/B 16SAN27 1:100 (2 мкг/мл) Мышиный IgG1 Novocastra PGR-AB-L-CE
1:200 (1 мкг/мл)
Отрицательный контроль DAK-GO1 1:25 (4 мкг/мл) Мышиный IgG1 Dako XO931
1:100 (1 мкг/мл)
1:200 (0,5 мкг/мл)

Иммуногистохимический анализ проводили с использованием микроскопа Zeiss Axioscope, снабженного цифровой камерой Imaging Model ROHS. Иммунореактивные сигналы выявляли по явно видимому коричневому окрашиванию ядер опухолевых клеток. Интенсивность окрашивания определяли, как 0 для отсутствия окраски, + для слабой окраски, ++ для умеренной окраски и +++ для сильной окраски.

Пример 2

Анализировали 12 образцов рака молочной железы с использованием 3 различных антител и 4 методов IHC. 6 образцов можно было обработать для последующего проведения иммуногистофлуоресцентного (IHF) анализа.

Иммуногистофлуоресцентное исследование проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss, оборудованного CCD камерой с программой Smart Capture, специально предназначенной для регистрации флуоресцентных изображений. IHF осуществляли для срезов 3-4 мкм архивных образцов тканей опухолей молочной железы. Срезы депарафинировали, гидратировали и промывали в рабочем буфере (0,05 моль/л Tris/HCl, 0,15 моль/л NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,6, Dako, Denmark код S3006). Демаскирование антигена проводили с помощью раствора Dako Target Retrieval Solution (модифицированный цитратный буфер, pH 6,1, Dako, Denmark, код S1699) на водяной бане при 98°C в течение 20 мин. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в подходящих оптимальных разбавлениях при КТ в течение 60 мин в темной влажной камере (таблица 2). После 5-минутного промывания рабочим буфером использовали подходящее вторичное антитело, конъюгированные с Alexa Fluor 488, для детектирования связывания первичного антитела при КТ в течение 30 мин (F(ab’)2 против мышиного IgG (H+L), Cell Signaling, USA, код 4408S, разбавление 1:1000; F(ab’)2 против кроличьего IgG (H+L), Cell Signaling, USA, код 4412S, разбавление 1:1000). Затем все образцы промывали и накрывали покровными стеклами, используя среду Vectashield® HardSet Mounting Medium (Vector Labs, USA, код H-1400) и хранили в темноте в охлажденном состоянии до исследования, чтобы сохранить способность образцов к флуоресценции. Образцы для отрицательного контроля получали путем замены при иммунофлуоресцентном окрашивании первичных антител изотипом контрольного мышиного IgG1 или кроличьей сывороткой (см. таблицу IHC), или чистым разбавителем для антител (отрицательный контроль с промывочным буфером).

Все образцы опухолей были PR-позитивными для трех различных антител. Однако исследование моделей распределения в ядрах не привело к окончательным выводам для 6 из 11 PR-позитивных образцов с биспецифичными A и B антителами (только 1 образец с этими антителами был PR-негативным). Шесть образцов подвергали IHF анализу со всеми антителами. В двух случаях методику IHF не удалось реализовать со всеми антителами, поскольку не осталось достаточного количества доступной опухолевой ткани. Четыре образца не удалось исследовать с PR B антителом. IHF исследование с другими антителами (PR-A и PR A+B) в одном случае не привело к определенным выводам при определении модели распределения в ядрах. Распределение PR в ядрах по данным IHF и наблюдаемые модели связывания согласовывались с данными IHC.

Затем исследовали большее количество образцов по методике IHC с использованием анти-PR-A антитела, анти-PR-B антитела или смеси обоих антител (далее именуемой A+B).

Подготавливали для исследования 75 образцов рака молочной железы и 25 образцов рака эндометрия. Для каждого меченого образца опухолей позитивное очаговое распределение определяли как процентную долю меченых опухолевых клеток от общего количества клеток в опухолевой ткани, исключая омертвевшие области.

Две основные модели распределения, обнаруженные в образцах, представлены на фиг.1. Приведенные изображения демонстрируют окрашивание образов тканей антителами против PR с использованием IHC. На фиг.1A показана коричневая, мелкозернистая и диффузная модель D. На фиг.1B показана пятнистая агрегированная структура, представляющая позитивную модель очагового связывания A. На фиг.2 показаны те же образцы обработанные с помощью IHF. На фиг.2A показана диффузная модель D, аналогичная полученной с помощью IHC на фиг.1A. На фиг.2B показана пятнистая агрегированная модель связывания, аналогичная фиг.1B. Диффузные модели D на фиг.1A и 2A аналогичны результатам для генно-инженерных клеток, которые экспрессируют флуоресцентный рецептор в отсутствии прогестерона или агониста прогестерона (Arnett-Manfield et al, 2004 1C Control, 1D и 1E), и для нормальной ткани эндометрия человека и ткани рака эндометрия (Arnett-Manfield et al, 2004 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F).

Активная модель A, наблюдаемая в фиксированных в формалине, заключенных в парафин опухолевых тканях, может отличаться от изображений, полученных для свежих клеток. Такой результат ожидается из-за того, что фиксация формалином и парафинирование ткани должны привести к изменению содержимого клеток, которое приводит к отличию модели распределения PR. Другое различие по сравнению с опубликованными исследованиями, в которых применялась IHF, относится к методу. В данном методе исследования конфокальный микроскоп (т.е. использующий два лазерных луча) позволяет получать высокое разрешение и 3D изображение; при этом используются тонкие срезы образцов тканей (например, толщиной 2 микрона). IHC модель проявляется в результате химической реакции, которая модифицирует содержимое клеток. В отличие от этого, в методе IHC используется традиционный широкопольный микроскоп для наблюдения срезов опухолей стандартной толщины (например, 4 микрона). Описанная методика IHC приводит к некоторой потере разрешения.

Методика IHF оказывает менее агрессивное химическое воздействие на опухолевые ткани в том отношении, что она не меняет микроскопическую структуру клеток. Для IHF требуется специализированное оборудование, патоморфолог, имеющий опыт работы с данной методикой, и, кроме того, исследование занимает существенно больше времени. IHF плохо сочетается с другими патоморфологическими исследованиями, такими как стандартная гистология, для которой требуются ткани, фиксированные формалином и залитые парафином. Таким образом, в одном из аспектов изобретения IHC можно использовать в качестве стандартной патоморфологической лабораторной методики. В методике IHC, разработанной в настоящем изобретении, для всех анализов использовали срезы тканей толщиной 4 мкм (толщина, обычно используемая для стандартных клинических анализов).

Фиг.3A и 3B эквивалентны фиг.1A и 1B с окрашиванием фона. Диффузную модель, наблюдаемую на фиг.5A или при иммунофлуоресценции, затемняют контрастным окрашиванием. Аналогично, фиг.5B демонстрирует крупные аномалии ядер. Однако однородная, диффузная модель на фиг.5A по-прежнему позволяет сделать вывод о наличии гомогенных ядер, тогда как ядра образца 1B подвергаются существенным искажениям на фиг.5B.

Таким образом, были обнаружены две основных модели: диффузное окрашивание PR в ядрах, указывающее на отсутствие активированных PR, и/или гетерогенное окрашивание, где в ядрах клеток можно обнаружить агрегаты, именуемые очагами скопления PR. Очаги скопления PR крупнее, чем элементы диффузной модели, которые, в свою очередь, значительно меньше (см. фигуры).

Пример 3

Для использования в различных аспектах настоящего изобретения было выявлено три категории фенотипов, которые наблюдались при высоких увеличениях (800×). В противоположность этому, для стандартного определения PR-статуса с помощью IHC использовалось стандартное увеличение (400×).

Выявленные категории (наблюдались при высоком увеличении)

D: диффузное окрашивание, очаги скопления PR отсутствуют (например, фиг.1A).

AD: области, в которых сочетаются A и D клетки, или наблюдается гетерогенное распределение очагов скопления PR, имеющих меньший размер, чем для модели A.

A: крупные очаги скопления PR, распределенные гетерогенным образом (например, фиг.1B).

Эту классификацию (D, AD и A) оценивали на примере 100 дополнительных образцов (75 образцов ткани рака молочной железы и 25 образцов ткани рака эндометрия). В некоторых случаях образцы были позитивными по одному из изотипов PR, но не по другому (например, позитивными по PR-A, но не по PR-B).

Образцы рака молочной железы (61 образец анализировали на экспрессию PR стандартными способами, 12 образцов были PR-негативными для всех антител, для 2 образцов имелись недостаточные данные).

Таблица 2
Опухолевые клетки рака молочной железы, позитивные по указанному антителу
Данные указаны в процентах Число образцов Среднее Минимальное Максимальное
Анти-PR A+B 54 34% 5% 90%
только анти-PR A 51 31% 5% 90%
только анти-PR B 52 32% 5% 85%
либо A, либо B* 58 36% 5% 95%
* По каждому антителу получены примерно одинаковые статистические данные с одинаковой средней процентной долей PR-позитивных клеток (31-36%), и изменением процентной доли в одном и том же диапазоне (5-95%).
* Данные получены в результате расчета, для которого выбрана наибольшая процентная доля PR-A или PR-B по результатам для использованных антител, причем доля PR-позитивных клеток не была одинаковой для обоих антител в одной биопсии.

Таблица 3
Опухолевые клетки рака эндометрия, позитивные по указанному антителу
25 образцов (3 негативных образца для всех антител против PR)
Данные указаны в процентах Число образцов Среднее Минимальное Максимальное
Анти-PR A+B 19 31% 2% 100%
только анти-PR A 18 21% 5% 90%
только анти-PR B 18 23% 5% 85%
либо A, либо B* 20 27% 5% 90%

C. Очаговое распределение

В данном разделе описана частота появления моделей A, AD, D и N (негативная, PR окрашивание отсутствует). Все образцы исследовали при высоком увеличении (800×). Два образца рака молочной железы не годились для исследования. Данные таблицы 4 демонстрируют, что отнесение образцов менялось в зависимости от использованного антитела (PR-A или PR-B), причем наибольшая зависимость от вида антитела наблюдалась для образцов с AD моделью. Это, вероятнее всего, отражает присущее раковой ткани нарушение регулирования двух прогестероновых рецепторов (PR-A и PR-B). В некоторых аспектах изобретения антитела, нацеленные на каждую из изоформ PR, могут быть использованы с целью получения дополнительной информации для интерпретации результатов анализа. Например, образец может иметь модель “D” при обработке антителом против PR-A и модель “AD” при обработке вторым антителом против PR-B. Исходя из последнего отнесения к модели “AD”, лечение антипрогестином могло бы потенциально подходить для данного случая. Аналогично, образец может соответствовать модели “A” с антителом против PR-A и модели “AD” с антителом против PR-B, что могло бы потенциально потребовать других (более высоких) доз антипрогестина из-за более высокой степени роста злокачественных клеток, на которую указывает нарушенная активность PR. Стандартные IHC методы определения PR не способны предоставить такую информацию, поскольку они указывают только на наличие или отсутствие гормональных рецепторов (т.е. ER и PR). О одном из аспектов, характер распределения активированных очагов PR, установленный на основе анализа с использованием одного или нескольких отдельных антител, мог бы предоставить дополнительную информацию для анализа модели активированных очагов PR.

Таблица 4
Очаговое распределение PR для клеток рака груди
Данные для количества случаев Количество образцов A AD D Нег.
анти-PR A+B 71 4 21 29 17
только анти-PR A 67 3 19 29 16
только анти-PR B 69 1 24 17 27
Данные в процентах % A AD D Нег.
анти-PR A+B 101% 6% 30% 41% 24%
только анти-PR A 99% 4% 28% 43% 24%
только анти-PR B 100% 1% 35% 25% 39%

Пример 4

В серии данных, приведенных в таблицах ниже по тексту, тот или иной образце опухоли мог бы быть APF-негативным для одного антитела и APF-позитивным для другого, т.е. демонстрировать различные модели APF для одного антитела против другого антитела. Однако результаты для антител против PR-A и PR-B в целом соответствуют друг другу. Количество совпадающих случаев показано в диагональных ячейках приведенных ниже комбинированных таблиц. Соответствие для двух наборов условий выделено затенением соответствующих ячеек таблицы. Эти результаты показывают, что в некоторых аспектах изобретения использование более чем одного антитела могло бы предоставить дополнительную информацию для выявления модели распределения APF в ядрах.

В приведенной ниже таблице 5 приведено сравнение моделей APF, полученных с использованием антитела против PR-A и смеси антител PR A+B, в образцах рака молочной железы. A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-A, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антител против PR-A + PR-B. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

Таблица 6: Образцы рака молочной железы. В комбинированной таблице приведены результаты, полученные с использованием антитела против PR-B (PR-B) и смеси антител против PR-A и PR-B (PR A+B). A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-B, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антител против PR-A + PR-B. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

Таблица 7: Образцы рака молочной железы. В комбинированной таблице приведены результаты, полученные с использованием антитела против PR-B (PR-B) и антитела против PR-A (PR-A). A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-B, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антител против PR-A. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

Рак эндометрия

Аналогичные модели распределения PR в ядрах наблюдались в образцах рака эндометрия. Важно отметить, что в образцах биопсий были обнаружены нормальные фибробласты, и было зафиксировано, что они являются PR-позитивными. Эти нормальные фибробласты имели D фенотип распределения PR в ядрах, указывающий на то, что PR в этих нормальных клетках не активирован, вероятнее всего, потому, что пациенты находились в постклимактерическом возрасте и их организмы не вырабатывали физиологических уровней прогестерона. Поэтому указанные фибробласты не подвергались действию эндогенного прогестерона. В противоположность этому, раковые ткани демонстрировали активированную форму PR (APF) даже в отсутствие физиологического прогестерона, на что указывала модель распределения в фибробластах.

Таблица 8: Образцы рака эндометрия. В комбинированной таблице приведены результаты, полученные с использованием антитела против PR-A (PR-A) и смеси антител против PR-A и PR-B (PR A+B). A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-A, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антител против PR-A и PR-B. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

Таблица 9: Образцы рака эндометрия. В комбинированной таблице приведены результаты, полученные с использованием антитела против PR-B (PR-B) и смеси антител против PR-A и PR-B (PR A+B). A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-B, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антител против PR-A и PR-B. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

Таблица 10: Образцы рака эндометрия. В комбинированной таблице приведены результаты, полученные с использованием антитела против PR-B (PR-B) и антитела против PR-A (PR A). A: агрегированная модель с крупными очагами, AD: смесь A клеток и D клеток, или гетерогенные очаги среднего размера. D: диффузная модель или отсутствие очагов активированного PR. В столбцах показано отнесение образцов по модели связывания, выявленной с помощью только антител против PR-B, тогда как в строках показано отнесение образцов с использованием антитела против PR-A. Диагональные ячейки, выделенные серым фоном, показывают число совпадающих случаев, т.е. образцов, в которых выявлена одна и та же модель связывания с использованием обоих способов. В других ячейках показаны несовпадающие результаты, т.е. образцы с различными моделями связывания для каждого способа.

В одном из аспектов изобретения использование антител против PR-A и PR-B или биспецифичных антител против PR-A и PR-B может осуществляться совместно для идентификации AD-модели распределения PR в ядрах, если использование единственного антитела (например, PR-A или PR-B) в некоторых случаях может не выявить AD-модель.

В другом аспекте изобретения способы, раскрытые в тексте заявки, описывают модель распределения PR в ядрах в биопсиях раковых опухолей, выявленную, например, с помощью IHC и подтвержденную с использованием свежего образца ткани и IHF. Диффузная модель обнаруживается в нормальных клетках/тканях, которые не подвергались действию прогестинов в экспериментальных и физиологических условиях. Диффузная модель распределения в ядрах указывает на то, что PR в опухолевых клетках не активированы, и, следовательно, лечение опухоли антипрогестином вряд ли будет эффективным. Напротив, наличие модели AD или A, аналогично той картине, которая наблюдается, если экспериментальные модели или нормальные клетки подвергают действию прогестинов. Эти модели показывают, что PR активированы и транскрипционно активированы в некоторых клетках, и что лечение антипрогестинами в этих случаях, вероятно, окажется эффективным.

Проявление этих моделей (например, A и AD) в опухолях носит гетерогенный характер, и их доля в разных образцах различается, что является характерным для рака. Напротив, фенотип D является гомогенным, т.е. моделью, согласующейся с недостаточной биологической функцией PR. Экспрессия PR и проявление соответствующего фенотипа, как было сказано выше, различается в соответствии с изотипом экспрессируемого PR (A или B) и используемого антитела (например, биспецифичного AB, только A, только B и смеси A+B). Эта изменчивость модели распределения PR в ядрах не является неожиданной для естественных раковых опухолей человека, которые по своей природе являются гетерогенными.

Пример 5

Диаграмма, приведенная на фиг.4, показывает процентную долю образцов рака молочной железы, позитивных по PR-A и PR-B для трех моделей связывания, A, D и AD. Результаты подтверждают вывод о том, что позитивный статус по рецептору прогестерона, определенный стандартными способами, не коррелирует с присутствием PRF распределения, которое описано в настоящей заявке.

Пример 6

В таблице 11 показаны процентные доли клеток с моделью связывания “A” для образцов тканей, демонстрирующих клетки с обеими моделями связывания “A” и “D”. В столбце, озаглавленном “APR”, указаны все модели связывания, наблюдаемые в образце ткани, тогда как в столбце “A%” показаны процентные доли клеток в образце, которые демонстрируют модель связывания “A”. В каждой из строк таблицы показаны результаты для одного образца при использовании обоих видов антител анти-PR-A и анти-PR-B, или каждого из этих антител индивидуально.

Таблица 11
Процентные доли клеток, в которых выявлена модель APF с использованием различных антител
PR-A+B PR-A PR-B
APR % клеток с APF APR % клеток с APF APR % клеток с APF
AD 30% AD AD
A AD 5% AD
D D AD 5%
AD AD 0% AD 20%
D AD 0% AD 10%
AD 10% D AD
A AD 15% A
A AD 40% AD 20%
A A AD 10%
A AD 20% AD 20%
AD 50% D D
AD 5% AD D
AD 5% D D
AD 70% A AD 40%
AD 5% D AD
AD 10% Нег. AD 40%
AD 60% D AD 10%
AD 30% AD D
A AD 20% D
AD AD 20% AD
AD 50% AD 30% AD 20%
A AD 20% AD 20%
A A AD 5%

Хотя изобретение было описано в тексте заявки со ссылкой на конкретные варианты осуществления, следует понимать, что эти варианты осуществления являются лишь иллюстрацией основных идей и применений настоящего изобретения. Специалисту в данной области должно быть ясно, что в способы и системы, описанные в заявке, могут быть внесены различные модификации и изменения, без отступления от сущности и объема изобретения. Таким образом, имеется в виду, что настоящее изобретение включает различные модификации и варианты, которые входят в объем приложенной формулы изобретения, и их эквиваленты.

1. Способ подавления роста опухоли, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, включающий:

a) получение образца ткани пациента, которая предположительно является онкогенной или раковой;

b) выявление прогестероновых рецептор-позитивных (PR-позитивных) клеток в указанном образце ткани;

c) определение степени распространения очагов прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток, имеющихся в указанном образце ткани; и

d) введение пациенту антипрогестина онапристона, если в указанном образце ткани присутствуют очаги скопления прогестеронового рецептора, которые превышают 5% от количества PR-позитивных клеток.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий определение степени распространения очагов PR в ядрах клеток ткани путем действия на ткань антителом против прогестероновых рецепторов.

3. Способ по п.1, где опухоль выбрана из группы, состоящей из опухоли молочной железы, опухоли мозга, менингиомы, опухоли предстательной железы, опухоли яичника, опухоли эндометрия, лейомиомы матки, опухоли легкого и опухоли матки.

4. Способ по п.1, где степень распространения очагов PR определяют путем идентификации модели связывания прогестеронового рецептора в прогестерон-позитивных клетках ткани.

5. Способ по п.4, где модель связывания выбрана из группы, состоящей из диффузной (D), активной (A) и активной/диффузной (AD).

6. Способ по п.2, где для определения степени распространения очагов PR используют по меньшей мере два антитела.

7. Способ по п.2, где антитела выбраны из группы, состоящей из антитела против PR-A, антитела против PR-B, смеси антител против PR-A и PR-B и биспецифичных антител против PR-A и PR-B.

8. Способ по п.2, где степень распространения очагов прогестеронового рецептора определяют способом детектирования, выбранным из группы, состоящей из иммуногистохимии, иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга.

9. Способ по п.1, где антипрогестин вводят пациенту в количестве от 10 до 200 мг в день.

10. Способ лечения пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, включающий:

a) получение образца ткани пациента, которая предположительно является онкогенной;

b) воздействие на указанный образец ткани антителом против прогестеронового рецептора;

c) выявление PR-позитивных клеток в указанном образце ткани;

d) выявление очагового распределения связывания прогестеронового рецептора в ядрах клеток ткани, где, если в указанном образце ткани присутствуют очаги скопления прогестеронового рецептора, которые превышают 5% от количества PR-позитивных клеток, пациенту вводят онапристон в дозе от 10 до 200 мг в день.

11. Способ по п.10, где опухоль выбрана из группы, состоящей из опухоли молочной железы, опухоли мозга, менингиомы, опухоли предстательной железы, опухоли яичника, опухоли эндометрия, лейомиомы матки, опухоли легкого и опухоли матки.

12. Способ по п.10, где степень распространения очагов PR определяют путем выявления модели связывания прогестеронового рецептора в клетках ткани.

13. Способ по п.12, где модель связывания выбрана из группы, состоящей из диффузной (D), активной (A) и активной/диффузной (AD).

14. Способ по п.10, где антитело выбрано из группы, состоящей из антитела против PR-A, антитела против PR-B, биспецифичного антитела против PR-A и PR-B и смеси антител против PR-A и PR-B.

15. Способ лечения пациента, у которого предположительно имеется опухоль, восприимчивая к ингибированию роста при действии онапристона, включающий:

a) выявление пациента, у которого очаги скопления прогестеронового рецептора в образце ткани превышают 5% от количества PR-позитивных клеток в биопсии опухолевой ткани; и

b) введение онапристона этому пациенту в количестве от 10 до 200 мг в день.

16. Способ по п.15, дополнительно включающий введение пациенту противоопухолевого соединения, выбранного из группы, состоящей из эверолимуса, трастузумаба, TM1-D, анти-HER2 препаратов, бевацизумаба, паклитаксела, доцетаксела, таксанов, доксорубицина, липосомального доксорубицина, пегилированного липосомального доксорубицина, антрациклинов, антрацендионов, карбоплатина, цисплатина, 5-FU, гемцитабина и циклофосфамида.

17. Система для отнесения опухоли к числу восприимчивых к лечению онапристоном, включающая образец опухоли и по меньшей мере одно антитело или связывающий фрагмент антитела, способные детектировать прогестероновый рецептор, где указанное антитело или связывающий фрагмент антитела применяют для определения степени распространения очагов прогестеронового рецептора в PR-позитивных ядрах клеток образца опухоли, и где опухоль считается восприимчивой к лечению онапристоном, если в указанном образце ткани присутствуют очаги скопления прогестеронового рецептора, которые превышают 5% от количества PR-позитивных клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где D представляет собой -C(Rd1)(Rd2)- или -N(Rd4)-; R1 выбран из группы, включающей Н, С1-3алкил, С1-3алкилоксил, бензилоксил и , в котором R101 выбран из группы, включающей Н, метил, этил, н-пропил или изопропил; R3 выбран из группы, включающей Н, F, Cl, Br; R2 удовлетворяет любому из следующих требований (1)-(10): (1) R2 выбран из Н или CN; (2) R2 представляет собой -CH2N(R201)(R202), в котором R201 и R202 отдельно и независимо выбраны из группы, включающей Н, С1-3алкил, С1-3алкилацил или С3-6циклоалкилацил; (3) R2 представлен гетероциклическими структурами, обозначенными группами (3а) и (3b); (4) R2 представлен структурой (4а); (5) R2 представлен структурой 5a; (6) R2 представлен структурой, включающей (6a) или (6b); (7) R2 представлен структурой (7a); (8) R2 представлен структурой (8a); (9) R2 представлен структурой (9a); (10) R2 представлен структурой (10a), в котором Т22 выбран из группы, включающей N или C(R224); Rd1 и Rd2 отдельно и независимо выбраны из группы, включающей Н, F, Cl, Br, I, ОН; Rd4 выбран из группы, включающей Н и R03; R03 представляет собой С1-10алкил; R03 необязательно замещен R001; R001 выбран из группы, включающей F, Cl, Br, I, ОН, N(CH3)2, NH(CH3), NH2, и CH3O; и количество R001 выбрано из 0, 1, 2 и 3.

Группа изобретений относится к способам и композициям для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с избыточной клеточной пролиферацией, таких как рак.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения рака головного мозга. Для этого применяют аморфную твердую дисперсию, содержащую N4-(4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-7-илокси)-3-метилфенил)-N6-(4,4-диметил-4,5-дигидрооксазол-2-ил)хиназолин-4,6-диамин, в лечении локального или метастатического рака головного мозга, который вызван избыточной экспрессией или амплификацией ErbB2, при этом указанный N4-(4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-7-илокси)-3-метилфенил)-N6-(4,4-диметил-4,5-дигидрооксазол-2-ил)хиназолин-4,6-диамин вводят в виде таблетки в дозе 600 мг два раза в сутки в комбинации с трастузумабом, капецитабином, бевацизумабом, паклитакселом или доцетакселом.

Изобретение относится к новой кристаллической форме (S)-1-(3-(4-амино-3-((3,5-диметоксифенил)этинил)-1H-пиразоло[3,4-d]-пиримидин-1-ил)-1-пирролидинил)-2-пропен-1-она, который обладает противоопухолевым действием.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к кристаллу гидрата 5-гидрокси-1H-имидазол-4-карбоксамида, где кристалл имеет дифракционные пики при углах дифракции 8,1, 12,6, 17,1, 19,3, 20,3 и 21,6°, представленных как 2θ на картине порошковой рентгеновской дифракции.

Изобретение относится к фармацевтической комбинации, включающей ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) соединение формулы (I), как определено в данном описании, или его фармацевтически приемлемую соль и паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль, для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака головы и шеи; фармацевтической композиции, включающей указанную комбинацию; использованию указанной комбинации для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака головы и шеи; способу лечения или предотвращения рака головы и шеи, включающему введение совместно терапевтически эффективного количества комбинации нуждающемуся в этом субъекту.

Изобретение относится к соединению формулы I: или его фармацевтически приемлемым энантиомеру или соли. В формуле I: каждый из X1 и X2 независимо представляет собой Н или галоген, R1, R2 и R3 независимо представляют собой Н, Q представляет собой Н, А1 и А2 вместе образуют 5-членную конденсированную кольцевую структуру, содержащую SO2NR5CR9'R9, где в указанной структуре R9' представляет собой Н, или каждый из R9' и R9 представляет собой метил, причем когда R9' представляет собой Н, R9 представляет собой атом водорода, циклопропил или C1-С6алкил, возможно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из галогена, С1-С4алкила, ОН, оксо, NH2, NHCH3, N(CH3)2, NHCOOCH3, NHCOCH3 и N(CH3)COCH3; либо группу -CH2NHSO2CH3 или -С(O)ОСН3.

Настоящее изобретение относится к новой безводной кристаллической форме, называемой формой H, Кабазитаксела формулы (I) Безводная кристаллическая форма имеет одно или несколько из следующего: рентгенограмму X-RPD, полученную с применением длин λ1 и λ2 волн спектра меди, равных 1,54056 Å и 1,54439 Å, соответственно, содержащую отличительные отражения, выраженные в виде значений угла рассеяния 2-тета градусов при 5,8, 6,5, 8,1, 9,5, 10,9, 11,5, 12,2, 13,0, 14,1, 14,8, 16,8, 17,2, 19,0, 19,4, 20,1, 21,9 и 24,0±0,2; рентгенограмму X-RPD, полученную с применением длин λ1 и λ2 волн спектра меди, равных 1,54056 Å и 1,54439 Å, соответственно, по существу, как показано на Фиг.

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции наночастиц, предназначенной для иммунотерапии. Композиция включает (a) носитель для доставки, выбранный из группы, состоящей из нанолипогеля, содержащего полимерное ядро и липидную оболочку, и биодеградируемой полимерной наночастицы; и (b) IL-2 и лозартан, загруженные в носитель для доставки, прикрепленные к его поверхности и/или заключенные в носитель для доставки.

Изобретение относится к соединению формулы I, в которой A1 выбирают из N или CR1, A2 выбирают из N или CR2 при условии, что только один из A1 или A2 может представлять собой N; R1 и R2 каждый независимо выбирают из водорода, фтора, хлора; R4 выбирают из фтора, хлора, брома, йода, CF3, циано, (1-4C)алкила, или группы формулы: W-X-Y-Z, где W представляет собой (1-3C)алкилен; X представляет собой -O-; Y отсутствует; Z представляет собой водород; Q выбирают из группы формулы II, где A4a и A4b каждый независимо выбирают из N или CR9, где каждый присутствующий R9 независимо выбирают из водорода, галогена, (1-3C)алкила или (1-3C)алкокси; A4c представляет собой N или CR10; R10 выбирают из галогена, гидрокси или группы W1-X1-Y1-X4-Z1, где W1 отсутствует; X1 отсутствует или представляет собой -N(Rj)-, где Rj представляет собой водород; Y1 отсутствует или представляет собой связывающую группу формулы -[CRkRl]q-, в которой q представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3 или 4, и Rk и Rl каждый независимо выбирают из водорода или (1-2C)алкила; X4 отсутствует или представляет собой -O-, -N(Rj)-, где Rj представляет собой водород; и Z1 представляет собой (1-6C)алкил, фенил, 5- или 6-членный гетероарил или 4-7-членный гетероциклил, содержащие 1, 2 или 3 гетероатома, выбранных из азота или серы; и где Z1 необязательно дополнительно замещен с помощью одной или более замещающих групп, независимо выбранных из галогена и (1-4C)алкила, пирролидинила, морфолинила; и где любая алкильная или гетероциклильная группа, присутствующая в замещающей группе на Z1, необязательно дополнительно замещена NRoRp или (1-2C)алкилом; где Ro и Rp выбирают из (1-2C)алкила; при условии, что R10 представляет собой только водород, галоген или т-бутил, когда, по меньшей мере, один из A4a и A4b представляет собой N или CR9, в котором R9 представляет собой определенный выше заместитель, но не являющийся водородом; или Q представляет собой группу формулы III, где A5 выбирают из N или CR5, где R5 выбирают из водорода; кольцо А представляет собой: конденсированное фенильное кольцо; конденсированное 5- или 6-членное карбоциклическое кольцо; конденсированное 5- или 6-членное гетероарильное кольцо, включающее один или два гетероатома, независимо выбранных из N, S или O; или конденсированное 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо, включающее один или два гетероатома, независимо выбранных из N, S или O; A6 выбирают из N, O, S, CR6, C(R6)2, NR60, где R6 выбирают из водорода и R60 представляет собой водород, O- или (1-6C)алкил; A7 выбирают из N, CR7, S, S(O)2 или C(R7)2; m представляет собой 0, 1 или 2; R7 и R11 каждый независимо представляет собой галоген, циано, оксо или группу W2-X2-Y2-X3-Z2, где W2 отсутствует или представляет собой связывающую группу формулы -[CRxRy]r-, в которой r представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3 или 4, и Rx и Ry каждый независимо выбирают из водорода или (1-2C)алкила; X2 отсутствует, представляет собой -O-, -N(Rz)- или -N(Rz)-C(O)O, где Rz выбирают из водорода или метила; Y2 отсутствует или представляет собой связывающую группу формулы -[CRaaRbb]s-, в которой s представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3 или 4, и Raa и Rbb каждый независимо выбирают из водорода или (1-2C)алкила; X3 отсутствует, представляет собой -O-, -C(O)O-, -N(Rcc)- или -N(Rcc)-C(O)O-, где Rcc выбирают из водорода или метила; и Z2 представляет собой водород, (1-6C)алкил, (2-6C)алкенил, 4-7-членный гетероциклил, содержащий 1, 2 или 3 гетероатома, выбранных из азота, кислорода или серы; и где Z2 необязательно дополнительно замещен с помощью одной или более замещающих групп, независимо выбранных из галогена, (1-4C)-алкокси, (1-4C)алкила, (3-8C)циклоалкила, при условии, что когда R7 представляет собой водород (то есть, когда W2, X2, Y2 и X3 отсутствуют и Z2 представляет собой водород), то тогда кольцо А представляет собой неконденсированное диоксановое кольцо, или к его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и дерматологии, и касается фармацевтической композиции для лечения от умеренно тяжелого до тяжелого атопического дерматита (АД) у пациента с устойчивостью, отсутствием ответа или неадекватным ответом на топические кортикостероиды (ТКС) или ингибиторы кальциневрина.

Изобретение относится к соединению формулы (I-g) или его фармацевтически приемлемой соли, где R1 выбирают из (C1-C4 алкил)-O, спирооксирана, циано, =O, нитро, (C1-C4 алкил)C(O) и HO(C1-C4 алкил)C(O); R2 является H; R3 является H; Rb означает метил; R8 является H; - - - означает необязательную дополнительную C-C связь, дающую C=C связь между C16-C17, при условии, что, если присутствует, R1 не является =O или спирооксираном.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения рака у субъекта. Для этого субъекту осуществляют интратуморальное введение фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое средство, при этом терапевтическое средство представляет собой соединение платины и/или алкалоид барвинка, и средство, усиливающее внутриклеточное проникновение.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции левокабастина или его соли и флутиказона фуроата для лечения воспалительного и/или аллергического состояния, в особенности ринита; к устройству для интраназальной доставки фармацевтической композиции; к способу лечения аллергического ринита; применению фармацевтической композиции для лечения пациентов с воспалительным и/или аллергическим состоянием, а также к способу лечения человека с воспалительным и/или аллергическим состоянием.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для наружной терапии среднетяжелой формы эритематозно-папулезной розацеа. Способ включает нанесение на пораженные пять зон: лоб, щеки, нос и подбородок, избегая попадания в глаза, красную кайму губ и слизистые, тонкого слоя крема ивермектина 1% (Солантра®) 1 раз в день.
Изобретение описывает 2 варианта фармацевтической композиции сухого порошка для ингаляций. Композиция по 1 варианту содержит малеата индакатерол в количестве 20-1200 мкг в сочетании с фуроатом флутиказона в количестве 0,5-800 мкг или циклезонидом в количестве 20-800 мкг, лактозу и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Изобретение относится к N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-иламину структурной формулы ,обладающему цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток человека.

Изобретение относится к новой комбинации а) соединения формулы Ia или его фармацевтически приемлемой соли и b) абиратерона или его фармацевтически приемлемой соли, взятых в терапевтически активном количестве.
Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии. При поступлении пациента в операционную начинают в/в введение дексмедетомидина в дозе 0,6-0,8 мкг/кг/ч.

Изобретение относится к области фармацевтики, в частности к пероральным противозачаточным средствам, и раскрывает способ приготовления твердой пероральной дозированной формы.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой лиофилизированную композицию, обладающую ингибиторной активностью в отношении PI3 киназы и mTOR, полученную путем сублимационной сушки фармацевтической композиции в виде водного раствора, содержащей 1-(4-{[4-(диметиламино)пиперидин-1-ил]карбонил}фенил)-3-[4-(4,6-диморфолин-4-ил-1,3,5-триазин-2-ил)фенил]мочевину или ее лактат в концентрации раствора менее 6 мг/мл, молочную кислоту в количестве, достаточном для обеспечения прозрачного раствора, и воду; или 1-(4-{[4-(диметиламино)пиперидин-1-ил]карбонил}фенил)-3-[4-(4,6-диморфолин-4-ил-1,3,5-триазин-2-ил)фенил]мочевину или ее фосфат в концентрации раствора менее 4 мг/мл, ортофосфорную кислоту в количестве, достаточном для обеспечения прозрачного раствора, и воду. Изобретения также представлены фармацевтическими композициями в виде водных растворов, полученных в виде прозрачных растворов путем восстановления или растворения лиофилизированной композиции, описанной выше. Изобретения включают способ лечения рака у млекопитающего посредством данных композиций. Лиофилизированная композиция обладает химической стабильностью при хранении в сочетании с возможностью ее восстановления с получением прозрачного раствора, пригодного для внутривенного введения. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для подавления роста опухоли, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов. Для этого получают образец ткани пациента, которая предположительно является онкогенной или раковой. Выявляют прогестероновый рецептор-позитивных клеток в образце ткани. Определяют степени распространения очагов прогестеронового рецептора в ядрах прогестерон-позитивных клеток, имеющихся в указанном образце ткани. Вводят пациенту антипрогестин онапристон, если в указанном образце ткани присутствуют явно выраженные очаги скопления прогестеронового рецептора, которые превышают 5 от количества PR-позитивных клеток. Также предложены способы лечения пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии антипрогестинов, или у которого предположительно имеется опухоль, восприимчивая к ингибированию роста при действии онапристона, и система для отнесения опухоли к числу восприимчивых к лечению онапристоном. Группа изобретений обеспечивает лечение пациента с опухолью, восприимчивой к ингибированию роста при действии онапристона. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 11 табл., 4 ил., 6 пр.

Наверх