Применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека rc291c

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности, к получению и применению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине, среди которых создание биомедицинских клеточных продуктов - противоопухолевых вакцин, диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, тестирование активности различных фармацевтических препаратов.

Прогресс современной биомедицинской науки и биотехнологии в значительной степени обусловлен применением культивируемых in vitro клеток различного происхождения. Метод культур клеток является уникальным и вместе с тем широко применяется в настоящее время, как в практических, так и в научных исследованиях. Появилась возможность использования клеток животных для получения генно-инженерных препаратов, заместительной терапии, производство препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения в значительной мере зависит от стабильности и воспроизводимости свойств используемых клеток. Основой получения любого безопасного биопродукта должна быть стандартизованная и аттестованная культура клеток. В настоящее время использование подобных клеточных линий является неотъемлемым условием при проведении исследований или разработке новых технологий, а также для обеспечения стабильного и безопасного производства биотехнологических препаратов (Мензоров А.Г., Серов О.Л. Зачем нужны коллекции линий клеток // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2016. - Т. 20(6). - С. 945-948. DOI 10.18699/VJ16.215).

Рак почки занимает одно из ведущих мест по темпам прироста среди онкоурологических заболеваний. По данным статистики, в 2016 г. в России было зарегистрировано 108,9 случаев злокачественных новообразований почки на 100000 тыс. населения по сравнению с 78,5 в 2011 г. (Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. - илл. - 236 с. ISBN 978-5-85502-231-5). Течение этого заболевания таково, что у 25-50% больных на момент установления диагноза уже определяются метастазы, приблизительно у половины пациентов болезнь приобретет системный характер в разные сроки после оперативного лечения. Биологической особенностью почечноклеточного рака является способность к метастазированию в любые органы и ткани организма. Традиционные виды системного лечения, назначаемые при распространенных формах опухолей, оказываются неэффективными у больных почечноклеточным раком. Однако рак почки относится к группе новообразований, чувствительных к иммунотерапевтическому воздействию (Cho Y.H., Kim M.S., Chung H.S., Chang E.Novel immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma // Investig Clin Urol. - 2017 - Vol. 58(4). - P. 220-227. doi: 10.411 l/icu.2017.58.4.220).

Активная иммунотерапия включает в себя: 1) неспецифическую иммунотерапию (индуцирование активного воспалительного процесса, неспецифическая вакцинация, местное и системное использование БЦЖ, применение левамизола, интерферонов α и γ, фактора некроза опухолей, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов, высоких доз антиэстрогенов), 2) специфическую иммунотерапию с иммунизацией опухолевыми антигенами (вакцинотерапию), 3) генную терапию. В настоящее время ведется поиск опухолеассоциированных антигенов (ОАА), использование которых в качестве мишеней для иммунотерапии позволило бы вывести эти методы на качественно новый уровень (Schumacher T.N., Schreiber R.D. Neoantigens in cancer immunotherapy // Science. - 2015. - Vol. 348, Issue 6230. - P. 69-74. DOI: 10.1126/science. 4971). Процесс создания и отбора опухолевых клеточных линий, способных стабильно продуцировать высокий уровень ОАА, является базой для производства противоопухолевых клеточных вакцин, в том числе вакцин на основе дендритных клеток (ДК). Создание противоопухолевых вакцин с использованием ДК является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний, так как позволяет активировать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию. Опухолевые антигены, полученные из разрушенных клеток опухоли, в большей степени подходят для нагрузки ДК, так как в этом случае в клетку попадает весь набор опухолеассоциированных и опухолеспецифических антигенов (Балдуева И.А. Иммунотерапия злокачественных новообразований: взгляд в будущее. Аллергология и иммунология - 2014. - №4. - С. 266-268). В качестве носителей ОАА используют аутологичные и аллогенные цельные или лизированные опухолевые клетки, причем каждая опухолевая клеточная линия обладает специфическим уникальным набором ОАА, и расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут стать доступны для таких антигенпрезентирующих клеток? как ДК в процессе манипуляций in vitro при создании противоопухолевых вакцин, что позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет (Monjazeb A.M., Hsiao Н.Н., Sckisel G.D., Murphy W.J. The role of antigen-specific and non-specific immunotherapy in the treatment of cancer // J Immunotoxicol. - 2012. - Jul-Sep; 9(3). - P. 248-58. - doi: 10.3109/1547691X.2012.685527). ДК-вакцины успешно применяют для лечения пациентов с раком почки как в виде монотерапии, так и в составе комбинированной противоопухолевой терапии (Amin A., Dudek A.Z., Logan T.F. et al. Survival with AGS-003, an autologous dendritic cell-based immunotherapy, in combination with sunitinib in unfavorable risk patients with advanced renal cell carcinoma (RCC): Phase 2 study results // J Immunother Cancer. 2015 Apr 21; 3:14. doi: 10.1186/s40425-015-0055-3).

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований.

Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

Указанный технический результат достигается применением клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов.

Полученная клеточная линия RC291C обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Родословная клеточной линии RC291C представлена следующим образом.

Клеточная линия получена из метастаза опухоли в легкое больной Ц., 65 л., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении/. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования. Получение клеточной линии RC291C осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм3) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме Медимашины (DAKO, Дания) в течение 30-60 сек, помещая их на стерильные ножи медиконы. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной питательной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 22 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии RC291C характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками полигональной или округлой формы, содержащими крупные ядра с одним или двумя ядрышками. Встречаются многоядерные клетки. Ядра 78% клеток окрашиваются в ходе иммуноцитохимической реакции с моноклональными антителами против маркера пролиферации Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии RC291C следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов HLAA/B/C, раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и семейств MAGE, GAGE. Методом иммуноцитохимии определена экспрессия антигена RCC (renal cell carcinoma antigen).

Культуральные свойства клеточной линии RC291C представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% CO2, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см2 в 5 мл среды засевают 1×106 клеток. При субкультивировании клетки снимают 2 раза в неделю в соотношении 1:2 с использованием стандартного раствора 0,25% трипсина.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×106 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см2. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 92%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Иммунофлуоресцентный тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии RC291C следующая:

47,X,-X,+t(1;7)(q21;p22),+t(1:7)(q21;p22),+del(4)(q),+t(7:?)(p22;?),-8,del(9)(p22),-14,-15,+del(17)(q),+20,-21.

При этом del (4)(q) встречается в 62% клеток в виде del (4)(q23) и в 38% клеток в виде del (4)(q31). Делеция del(17)(q) встречается в 77% клеток в виде del(17)(q11.2) и в 23% клеток в виде del(17)(q22). Наиболее часто встречаемые маркеры, характеризующие культуру RC291C:

1. Нереципрокная (невзаимная) транслокация между 1 и 7 хромосомами [t(l;7)(q21;p22)]. Выявлена в 95% случаев, при этом в количестве 2 в 75% клеток, в количестве 1 - в 16% клеток, в количестве 3 - в 4 клетках из 100.

2. Дериват хромосомы 7, или транслокация 7 в локусе р22 [t(7;?)(p22;?)]. Выявлена в 56% клеток, при этом в основном в количестве 1 и только в 4%>клеток в количестве 2.

3. Изохромосома 9q выявлена в 35% клеток, в основном в количестве 1.

4. Делеция хромосомы 4 в локусе q23 встречается в 72% клеток, при этом в основном в количестве 1.

5. Делеция 4q13 встречается в 29% клеток, при этом в 6% клеток в количестве 2.

6. Делеция 7 хромосомы в локусе q11.2 встречается в 55% клеток, при этом в 12% клеток в количестве 2 и в 3% клеток в количестве 3.

7. Делеция 6 хромосомы в локусе q23 отмечена в 5% клеток.

8. Делеция 9 хромосомы в локусе р22 отмечена в 61% клеток, в основном в количестве 1.

9. Маркер в виде 10(р) отмечен в 9% клеток.

Использование клеточной линии RC291C представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии RC291C для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию RC291C культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% CO2, 100%) влажности в СО2-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в CO2-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клеток линии RC291C проводили шесть последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией RC291C в культуры незрелых дендритных клеток пациентов на 5-й день культивирования (иммунофенотип CD14-CD1a+CD83-) в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки на 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин - 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% CO2, 100% влажности в CO2-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14-/CD1a-/CD83+/CD80+/CD86+/HLADR+/CD209+/CCR7+.

Пример 2. Использование клеточной линии RC291C для создания экспериментальной системы in vitro, позволяющей оценить активность цитотоксических Т-лимфоцитов.

1. Клеточную линию RC291C культивировали, как описывается выше. После пересева клетки собирали, осуществляли подсчет их количества, оценку жизнеспособности и высевали в планшету Е-16 (ACEA Bioscience Inc., США) в количестве 10 тыс. кл/лунка.

2. Два часа инкубировали планшету с клетками RC291C в условиях 37°С, 5% CO2, 100% влажности в CO2-инкубаторе «Heracel» (TermoElectron LTD GmbH, Германия).

3. Вносили в каждую лунку планшеты специфически активированные CD3+CD8+ лимфоциты больного раком почки в соотношении 1 оп. кл. /5 лимфоцитов, 1/10 и 1/50, соответственно.

4. Инкубировали в условиях CO2-инкубатора 30 минут, после чего устанавливали планшету в автоматический клеточный анализатор xCELLigence (ACEA Bioscience Inc., США). Программировали систему регистрации параметров жизнеспособности и пролиферации прикрепившихся культивируемых опухолевых клеток RC291C на 48 ч.

5. Оценили изменения жизнеспособности и скорости роста культуры RC291C по изменению значений электрического импеданса, которые автоматически контролировались системой xCELLigence и были выражены в виде клеточного индекса (CI).

6. Наблюдали прогрессивное уменьшение CI культуры RC291C при кокультивировании в течение 48 ч. с активированными CD3+CD8+ лимфоцитами: 1,049 в контроле и 0,0027 при соотношении опухолевая клетка/лимфоцит 1/50.

Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, способствуе тповышению эффективности лечения и увеличению продолжительность жизни пациентов при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия RC291C может использоваться для создания противоопухолевых вакцин, диагностических наборов, тест-систем с целью разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, для тестирования эффективности различных фармацевтических препаратов.

Применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу непрерывного культивирования линии клеток яичника китайского хомячка CHO, являющейся продуцентом антител, и применению указанного способа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам введения клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, что может быть использовано в медицине.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации работы указанного устройства (варианты).

Изобретение относится к области биохимии. Предложен контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих.

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложен выделенный пептид-эпитоп, полученный из ассоциированной с кинетохором молекулы 2 (KNTC2) и обладающий способностью к индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) в присутствии антигенпрезентирующей клетки (APC), несущей HLA-A*0201.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мыши для экспрессии гуманизированного белка SIRPα, содержащей замещение экзонов 2, 3 и 4 гена SIRPα мыши в эндогенном локусе SIRPα мыши на экзоны 2, 3 и 4 гена SIRPα человека с образованием гуманизированного гена SIRPα, а также к клетке и ткани вышеуказанной мыши.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу получения хромогранин A(CHGA)-отрицательных клеток. Способ включает обеспечение контакта клеток человеческой дефинитивной эндодермальной линии (исключая клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных итсключительно способом, требующим разрушения эмбриона) in vitro с по меньшей мере 50 нг/мл члена суперсемейства TGFβ и по меньшей мере 25 нг/мл члена семейства Wnt.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения неистощенных незрелых дендритных клеток (ДК), происходящих из двух различных аллогенных доноров, с их последующей активацией и получением провоспалительных ДК.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, способам дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к композиции среды для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбриона, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью и способу получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека Н7, клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека Н9, клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека SA002 или клетки линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека BG01v, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Способ включает обработку указанных плюрипотентных клеток средой, содержащей GDF-8, и 6-[(2-{[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)пиримидин-2-ил]амино}этил)амино]пиридин-3-кабонитрилом, или средой, содержащей GDF-8, и циклическим анилин-пиридинотриазином, выбранным из группы, состоящей из 5-хлор-1,8,10,12,16,22,26,32-октаазапентацикло[24.2.2.1~3,7~.1~9,13~.1~14,18~]тритриаконта-3(33),4,6,9(32),10,12,14(31),15,17-нонаен-23-она, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]-гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она и 14-метил-3,5,7,14,18,24,28-гептаазатетрацикло[20.3.1.1~2,6~.1~8,12~]октакоза-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-нонаен-17-она, или GDF-8 и циклическим анилин-пиридинотриазином, выбранным из группы, состоящей из 5-хлор-1,8,10,12,16,22,26,32-октаазапентацикло[24.2.2.1~3,7~.1~9,13~.1~14,18~]тритриаконта-3(33),4,6,9(32),10,12,14(31),15,17-нонаен-23-она, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она и 14-метил-3,5,7,14,18,24,28-гептаазатетрацикло[20.3.1.1~2,6~.1~8,12~]октакоза-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-нонаен-17-она. Изобретение позволяет улучшить процесс дифференцировки. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 126 ил., 19 табл., 24 пр.

Изобретение относится к области клеточной биологии, а именно к дифференцировке популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы. Способ включает культивирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток человека Н1, Н7, Н9 или SA002 или из неэмбриональных клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, HTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81, в средах DMEM или MCDB-131, содержащих высокую концентрацию глюкозы, дополненной ингибитором CYP26A. Изобретение позволяет повысить эффективность дифференцирования клеток заднего сегмента передней кишки в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы. 22 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. 1 пр.

Наверх