Устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации его работы (варианты)



Устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации его работы (варианты)
Устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации его работы (варианты)

Владельцы патента RU 2671476:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России) (RU)

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации работы указанного устройства (варианты). Устройство включает проточную вертикальную камеру с тремя резервуарами, систему индикации готовности графтов или аварийных ситуаций, трубки подвода и отвода среды, компоненты для вертикального и горизонтального закрепления графтов в верхнем и нижнем резервуарах. Верхний и нижний резервуары имеют по всем сторонам кроме основания порты для трубок подачи и отвода среды и для контрольно-измерительной аппаратуры, а промежуточный резервуар имеет один порт в крышке и до пяти портов в основании. Способ включает перемешивание жидкости в резервуарах, где устройство или съемное основание нижнего резервуара соединяют проволокой с орбитальным шейкером, либо устройство устанавливают на магнитную мешалку с якорем в нижнем резервуаре, либо магнитную мешалку устанавливают перпендикулярно устройству и используют для вертикальной и горизонтальной ротации закрепленного графта, либо трубку подвода устройства соединяют с выступом вала головки перистальтического насоса для контролируемой ротации графта. Изобретения обеспечивают высокую производительность процедуры тщательной отмывки сосудистых графтов от клеток. 5 н.п. ф-лы, 1 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности тканевой инженерии. Оно направлено на способ изготовления биоинженерных сосудистых графтов за счет детергентно-ферментативного удаления их клеток в устройстве с вертикальной и горизонтальной перфузией по одному или нескольким каналам. Указанные биоинженерные графты биологически совместимы и способны к биоремоделированию, а также могут использоваться, как в клинических целях, так и на лабораторных животных. Получение бесклеточной (децеллюляризованной) структуры, свободной от чужеродных донорских клеток, способных приводить к нежелательным иммунологическим реакциям - отторжению и подготовленной для ревитализации клетками реципиента крайне актуально для клинической практики трансплантационных служб, как в случаях плановых, так и экстренных хирургических вмешательств, когда оперативное замещение сосудов может сохранить пациенту конечность и даже жизнь. Однако известные устройства (проточные камеры) и способы по удалению клеточного материала с их помощью имеют ряд недостатков.

Большинство современных устройств двухканальной детергентно-ферментативной децеллюляризации сосудов в условиях биореакторов состоят из горизонтальных трубчатых камер, конструкция которых не позволяет достаточно эффективно использовать рабочее пространство биореакторов, а схемы крепления сосудов имеют ограничения по минимальному и максимальному их диаметру. Так компания EBERS Medical (Испания) использует устройство из двух резервуаров и статичной трубчатой горизонтальной камеры, состоящей из двух частей (Van Putte et al., 2002, Ann. Thorac. Surg., 74(3):893-8; den Butter et al., 1995, Transpl. Int., 8:466-71; Firth et al., 1989, Clin. Sci. (bond.) 77(6):657-61; Mazzetti et al., 2004, Brain Res., 999(1):81-90; Wagner et al., 2003, J. Artif. Organs, 6(3):183-91. (RU 2463081) Недостатками подобных устройств для их осуществления являются: невозможность искусственного увеличения или изменения в динамике тока жидкости в камере; невозможность ротации закрепленного сосудистого графта внутри камеры; стандартизация под человеческие сосуды ограниченного внутреннего диаметра, а именно невозможность использования сосудов с диаметром менее 3 мм и более 11 мм; наличие риска повреждения силиконового кольца уплотнителя, а также общая хрупкость всей системы, так как камеры сделаны из стекла; использование двухканальной схемы приводит к использованию большего количества головок насоса, трубок, коннекторов и занимает в два раза больше рабочего пространства биореактора; невозможность размещения двух и более сосудистых графтов в одной камере; крепление сосуда предполагает использованием жестких хомутов или шовного материала, что приводит к потере биоматериала на выходе (по 1 см с каждой стороны), а также усложняет процедуру крепления сосуда; отсутствие контрольно-измерительной аппаратуры.

Известно также устройство из проточных разборных камер, частичное совпадающее по конструктивным решениям и предназначенное для щадящей отмывки биочипов с клетками. Эти камеры имеют приводящую и отводящую трубки и корпус, в котором находится капилляр (см. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человекам, журнал «Биологические мембраны». - 2008. - 4 - С. 267-276), с выдвижным креплением для биочипа. (Авторы модели 88674. Шишкин Александр Валентинович (RU) Классы МПК7: C12Q 1/68). Недостатком данного устройства является его ограниченная применимость для более крупных образцов биоматериала - сосудов, в частности иные размеры, невозможность крепления.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому устройству является устройство в виде горизонтальной прозрачной камеры в форме полого цилиндра из пиакрила для одноканальной двусторонней децеллюляризации биоматериала - ксеногенных сердечных клапанов. Суть устройства заключается в том, что полученный донорский биоматериал - сердечный клапан подвергается комбинированной обработки желчной кислотой и спиртом с последующим этапом промывки в изолированной горизонтальной камере с механическим воздействием текущей пульсирующей среды на тканевый матрикс и удаляемые клетки в продольном направлении. Описанная камера разъемно подключается к мембранному насосу, расположенному за ней, по одноканальной схеме, образуя кольцевую линию. Эта линия включает входной и выходной клапаны для подачи и отвода соответствующей среды для обработки, которые подключаются к камере через тефлоновые адаптеры на ее торцевых частях. Часть сердечного клапана, подлежащую обработке, фиксируют в камере путем пришивания к адаптерам, с предварительным натяжением вдоль направления пульсирующего потока. Помимо этого, возможно использование дополнительной уравновешивающей камеры. ("Способ удаления клеток с чужеродного материала для получения биопротезов и аппарат для его осуществления" / патент №RU 2281120 С2). Недостатками данного способа являются: акцент на использование только с одним типом биоматериала - сердечным клапаном, а, следовательно, крепление образца с жесткой фиксацией по краям и отсутствие технических решений для работы с иными сосудистыми графтами; односторонний характер отмывки биоматериала - поток жидкости может быть направлен внутрь клапана или циркулировать по его стенкам, невозможность искусственного увеличения или изменения в динамике тока жидкости в камере; неоптимальный характер отмывки ввиду горизонтальной конструкции камеры без возможности его изменения; невозможность ротации закрепленного сосудистого графта внутри камеры; невозможность размещения двух и более сосудистых графтов в одной камере; невозможность или крайнее неудобство в использовании контрольно-измерительного оборудования для контроля качества и оптимизации рабочего процесса, а также аварийного выключения системы.

Техническим результатом способа является более тщательная процедура отмывки от клеток (децеллюляризации) биоматериала человеческого или животного происхождения, в частности сосудистых графтов, с возможностью оптимизации временных затрат и обеспечивающая более высокую производительность - в частности, позволяя обрабатывать более 10-ти сосудистых графтов (в виде артерий и вен с широким диапазоном внутренних диаметров) в одном устройстве, менять их расположение, крепление, задавать ротацию в вертикальной или горизонтальной плоскости и следить за их состоянием в автоматическом режиме, а также модифицировать саму схему отмывки от клеток.

Сущность устройства поясняется фиг.1, где приведена принципиальная схема его циркуляционного контура и его общий вид (в разрезе).

Указанный технический результат достигается тем, что устройство включает в себя: проточную камеру вертикальной конструкции из трех резервуаров с портами на каждой стороне и герметично закрывающимися крышками с возможностью регулировки внутреннего диаметра; набор компонентов для горизонтального и вертикального крепления сосудистых графтов в устройстве; система индикации готовности графтов или аварийных ситуаций с использованием интегрируемой контрольно-измерительной аппаратуры; технические решения для динамического распределения жидкости по резервуарам устройства с его установкой в биореактор / инкубатор, при этом устройство, состоящее из вертикально расположенных резервуаров, может быть более компактно установлено в рабочем пространстве любого биореактора / инкубатора и подключаться к насосу по одноканальной или многоканальной схемам, а также поддерживает технические решения (описанные отдельно) для безопасного перемешивания объема жидкости и отмывки графта. Вертикальное размещение резервуаров позволяет разъединять верхний резервуар с установленными графтами без осушения нижнего резервуара, что сокращает временные затраты, упрощает процедуры размещения и удаления графтов и смену растворов.

Набор компонентов для горизонтального и вертикального крепления сосудистых графтов включает в себя: крепление графта на гибком металлическом каркасе (условное обозначение - КГК) и концевом участке силиконовой трубки в вертикальном расположении (с дополнительной возможностью вертикальной ротации) и крепление (условное обозначение - ККН) графта на пластиковых конусовидных наконечниках с фильтром в горизонтальном положении. Использование креплений КГК и ККН позволяет устанавливать графты под широкий диапазон их внутренних диаметров, что минимизирует физические воздействия на их концы, приводящие, в большинстве случаев, к потере готового биоматериала на выходе. Крепление целого графта в просвете специально подготовленной гибкой трубки (условное обозначение - КПИ) или конца графта на участке трубки, наконечнике (условное обозначение - КГТ) через сквозной прокол проволокой или иглой в горизонтальном положении. Крепления КПИ и КГТ позволяют устанавливать сосудистый графт без дополнительной поддержки непосредственно в любой порт резервуаров и подключать функцию их ротации для оптимизации отмывки. Описанный набор компонентов позволяет загружать в одно устройство до 10-ти графтов длиной от 2 до 20 см и диаметром от 2,5 до 10 мм. Система индикации готовности графта или его аварийного состояния с использованием контрольно-измерительной аппаратуры позволяет оператору получить данные об оптимальном времени выключения системы без передерживания сосуда в агрессивной среде.

Способы динамического распределения жидкости по камере с ее установкой в биореактор, включают в себя: прямое соединение приводящей трубки от устройства с выступом вала головки перистальтического насоса для ротации графта (условное обозначение - ВВГ), что позволяет более эффективно омывать его стенки при горизонтальной перфузии; подключение съемного основания биореактора (например, EBERS ТЕВ-500) или самого устройства через гибкое проволочное соединение к орбитальному шейкеру (условное обозначение - ПОШ) вне биореактора, что обеспечивает контролируемое встряхивание либо одного устройства, либо всех установленных на основании; установку устройства на магнитную мешалку (условное обозначение - УММ) подходящих размеров с расположением якоря на дне нижнего резервуара. При вертикальной установке графта в нижнем резервуаре данный способ обеспечивает его эффективную отмывку; использование магнитной мешалки для вертикальной или горизонтальной ротации закрепленного графта (условное обозначение - ММР) без использования вала головки перистальтического насоса. Горизонтальная магнитная ротация позволяет использовать нижний резервуар устройства и более гибко регулировать высоту установки графтов. При наличии компактных магнитных мешалок возможна установка нескольких графтов в течении одного рабочего цикла. Помимо этого, данное решение, и решение ВВГ, позволяют проводить заселение децеллюляризированного графта клетками (рецеллюляризацию) с его медленной ротацией (0,1-1 об/мин). Описание устройства. Устройство выполняется из стекла или пластика, разрешенного для использования в медицине, методом трехмерной печати или литья. При использовании мануальной оценки состояния графтов методами микроскопии, а также для упрощения визуального контроля рекомендуется использовать максимально оптически прозрачный материал, тогда как для автоматизированного применения контрольно-измерительной аппаратуры материал должен быть непрозрачным. Само устройство состоит из трех резервуаров, два из них (BP - верхний и HP - нижний) соединены между собой через завинчивающий коннектор со сквозным портом, куда, в свою очередь, устанавливается третий, промежуточный (ПР), резервуар с отдельной крышкой. Верхний резервуар также имеет съемную крышку для удобства установки графтов и смены растворов. Для максимальной производительности рекомендуемые габариты верхнего и нижнего резервуаров должны соответствовать следующим пропорциям - 111×111×160 мм, габариты промежуточного резервуара могут варьироваться, с учетом его установки в сквозной порт. Верхний и нижний резервуары имеют по всем сторонам кроме основания пронумерованные порты диаметром 10 мм под перфузионные трубки для подачи и отвода соответствующей среды и обработки посредством роликового насоса биореактора. Для установки различных трубок в порты с максимальной герметичностью может потребоваться использование переходников и участков трубок большего диаметра. Порты могут использоваться для подключения различных схем и контрольно-измерительной аппаратуры, а также герметизируются в случае неиспользования. Дополнительно порты в области воздушного мешка в верхней половине резервуара (Н) могут использоваться для дополнительного асептического введения растворов внутрь резервуара без разбора устройства и остановки системы, а также для доступа газовых смесей через фильтры в случае заселения графтов клетками (рецеллюляризации). Промежуточный резервуар имеет один порт в крышке и до 5-ти портов в основании, в зависимости от количества загружаемых графтов. Расстояние между ними может меняться в зависимости от наличия бифуркаций и размеров графтов. Для всех портов и соединений заготавливается комплект герметично закрывающихся крышек с возможностью регулировки внутреннего диаметра. В случае невозможности создания таких резервуаров для устройства методом трехмерной печати / литья рекомендуется использовать модификацию доступных на рынке вакуумных фильтрационных систем из двух соединенных резервуаров (так у производителя ТРР имеются подходящие резервуары разного размера), а также использовать любую пластиковую тару с крышкой для промежуточного резервуара. В этом случае требуется мануально создать порты в резервуарах под диаметр перфузионных трубок, а также вырезать дно верхнего резервуара для создания сквозного порта. Все части устройства могут стерилизоваться, а также оно может быть выполнена в одноразовом исполнении.

Компонент для горизонтального и вертикального крепления сосудистых графтов в устройстве (варианты).

- Крепление (КПИ) через сквозной прокол проволокой или иглой одного конца графта на расстоянии 5 мм от его края с установкой на участок гибкой трубки или наконечник. Подходит в случае использования ротации графта и его горизонтального расположения в камере. При горизонтальном расположение можно разместить количество графтов равное количеству картриджей головки перистатического насоса (устройство тестировалось на биореакторе EBERS ТЕВ-500), желательно располагать их в два ряда друг напротив друга. Ротация графтов в верхней камере невозможна в этом случае без использования дополнительных технических решений. Также возможна модификация данного крепления с ассиметричным расположением порта камеры и графта на трубке, так чтобы уровень жидкости не достигал уровня порта и не создавал дополнительные риски протечек. В этом случае от порта должна отходить дополнительная гибкая трубка с подключением графта к ее концу. Графт может крепиться на нитки и на иголку. В случае невозможности использования гибкой трубки графт (и порт) может устанавливаться на границе раздела водной и воздушной фаз, с каждым оборотом ротора опускаясь в жидкость. При вертикальном размещении 6 сосудов используются два резервуара и две промежуточные камеры. В одном резервуаре не рекомендуется размещать более трех графтов. Увеличить количество графтов в промежуточном резервуаре можно за счет использования трубок с разветвлением, например, Y-фиттинги.

- Крепление графта (КГТ) в специально подготовленной гибкой трубке, для этого, отступая с обоих концов не менее 1 см. продольно вырезается стенка этой трубки так чтобы осталось не менее длины ее окружности. Один конец графта закрепляется на трубке через его сквозной прокол проволокой или иглой, свободный конец графта также может закрываться через наложение лигатуры, прокол иглой, проволокой или через пластиковый наконечник с фильтром, если его перфузия через просвет не требуется. Вся конструкция может располагаться как на весу, так и с дополнительной поддержкой. Рекомендуется использование данного крепления с ротацией графта. При горизонтальном расположении графта с погружением в жидкость наполовину рекомендуется использовать порт-1 на крышке верхней камеры, а также распределитель на конце перфузионной трубки, чтобы поток жидкости равномерно распределялся по всей длине графта. В этом случае его дополнительная ротация не требуется.

- Крепление (ККН) на основе пластиковых конусовидных наконечников с фильтром (например, наконечники для дозатора подходящего диаметра, разрезанные) Два наконечника дополнительно соединяются через гибкую трубку большего диаметра поверх них и/или через иглу проходящую через их просвет. В этом случае графт не фиксируется на нитках или как-то еще, располагаясь в горизонтальной плоскости за счет сцепления с наконечниками. Один наконечник можно закрепить на перфузионной трубке или на приводящей трубке во время ротации, наконечник на другом конце закрывается пластиковой пробкой или участком гибкой трубки с запаянным концом. В случае использования данного крепления для заселения графта клетками требуется модифицировать поддерживающую трубку / иглу перфорацией по всей длине, избегая концевых участков, а также сделать в герметизирующей трубке с запаянным концом и в наконечнике отверстия на одном уровне, так чтобы при закрывания свободного конца жидкость проходящая через просвет могла попадать через два совмещенных отверстия во внешнюю область вокруг закрепленного графта (область формируется через использование внешней поддерживающей трубки соединяющей два наконечника), в случае же смещения закрывающей трубки жидкость бы оставалась в просвете графта. Это необходимо для поочередного заселения графта клетками и подвода к ним питательной среды во внутреннем и внешнем контуре. Слив жидкости может происходить через удаление закрывающей трубки.

- Крепление (КГК) за счет расположения на гибком металлическом каркасе из лигатурной проволоки на одном конце и трубке на другом. Каждая трубка может дополнительно фиксироваться через сквозной прокол проволокой, в том числе через последовательное соединение всех трубок между собой. Перфузионная трубка, выходя из порта, опускается в субкамеру для ее заполнения и избегания риска протечек. Данное крепление может быть модифицировано под использование с графтом длиной более 20 см. Для этого требуется закрепить его в верхнем резервуаре и провести в нижний через увеличенный порт промежуточного резервуара. Для крепления графтов меньшего диаметра можно использовать переходники с их закреплением на трубке, например, наконечники для пипеток или участки трубок меньшего диаметра с отдельным креплением между собой.

Способ оптимизации работы устройства за счет динамического распределения жидкости по его резервуарам (варианты).

- Способ «ВВГ». Прямое соединение приводящей трубки к выступу вала головки перистальтического насоса с дополнительной ее фиксацией с использованием зажима или крепежного замка, в случае использования насоса без выступа вала головки требуется использование дополнительного переходника для соединения с трубкой. Заданная скорость вращения может достигать 1 об / минуту. Подобный способ позволяет добиться ротации графта в среде и тем самым увеличивать интенсивность его отмывки и более равномерного распределения среды. Может использоваться для горизонтальной установки графта в камере. Для данного способа используется двухканальное соединение для обеспечения перфузии и ротации одновременно. Однако возможен вариант использования одноканального соединения. Для этого требуется подсоединить к приводящей трубке Т-образный коннектор (например, 3-х ходовой стоп-кран), а уже к нему дополнительный перфузионный контур. Режим работы насоса во избежание перекручивания трубок должен включать четыре фазы с постоянным повторением, в первой фазе должен быть совершен половинчатый (на 50% от полного оборота) оборот вала головки перистальтического насоса влево против часовой стрелки с паузой в конце, во второй фазе, после паузы, происходит возвращение вала головки на исходную позицию половинчатым оборотом по часовой стрелке. В третьей фазе вал головки должен совершить, аналогично первой фазе, половинчатый оборот влево, но уже по часовой стрелке и с возвращением на исходную позицию в четвертой фазе. Для удобства определения оборотов требуется установить на трубку цветной индикатор. Длину перфузионной трубки рассчитывают исходя из доступного рабочего пространства биореактора / инкубатора. При использовании данного решения возможно использование двух перистальтических насосов с расположением устройства между ними.

- Способ «ПОШ». Подключение перфорированной пластины биореактора (на примере биореактора EBERS ТЕВ-500) через техническое отверстие с установленным мембранным фильтром к орбитальному шейкеру за счет гибкой проволоки из медицинской стали, это позволяет встряхивать основание вместе с камерами. В случае несъемной пластины рекомендуется подсоединять проволоку к горлышку каждой камеры. Скорость орбитального шейкера, при обязательной его фиксации для нужного натяжения проволоки, должна быть в границах 150-300 об / минуту.

- Способ «УММ». Установка камеры на магнитную мешалку подходящих размеров с расположением якоря на дне камеры. Подходит для вертикального расположения графтов в нижней камере. Общая высота камеры позволяет ее установку на магнитную мешалку в диапазоне стандартных размеров с возможностью использования в биореакторе с закрытой крышкой. Для удобства размещения магнитной мешалки в биореактор в случае ее больших габаритов возможен демонтаж резервуара (В) и использование только резервуаров (Н) и (П). Для этого в герметичной крышке резервуара (Н) (должна прилагаться отдельно для изолированного хранения в камере отфильтрованной жидкости) проделывается отверстие для установки резервуара (П) и герметизируются соединения. Трубка от насоса подсоединяется через порт на крышке резервуара (П).

Также возможно использование магнитной мешалки для перемешивания жидкости в верхней камере. Для этого к нижнему якорю прикрепляется приводящая проволока, которая поднимается в верхнюю камеру через порт в суб-камере. Другой ее конец закрепляется на втором якоре (или на любом пластиковым продолговатым объекте для перемешивания, например, трубке) который и перемешивает жидкость в верхней камере.

- Способ «ММР». Использование магнитной мешалки для вертикальной и горизонтальной ротации закрепленного графта без использования вала головки перистатического насоса. Для вертикальной ротации, аналогично предыдущей схеме, к нижнему якорю прикрепляется приводящая проволока, которая поднимается в верхний резервуар (В) через порт в промежуточном резервуаре и прикрепляется к металлическому каркасу, на котором стоит вертикально расположенный графт (как альтернатива проволока может закрепляться на перфузионной трубке, прилегающей к верхнему концу графта). Его перфузия происходит через порт в крышке верхней камеры. Обязательно необходимо закрепить перфузионную трубку на которой держится верхний конец графта к крышке за счет проволоки. Вторую трубку, меньшего диаметра, необходимо подсоединить к ней через помещение в ее просвет. Для дополнительной безопасности верхний конец графта рекомендуется закрепить на перфузионной трубке за счет лигатуры, сквозного прокола проволокой или иглой. Для горизонтальной ротации, по аналогии с решением ВВГ, магнитную мешалку необходимо повернуть на бок и закрепить (в том числе возможна ее установка за пределами камеры биореактора). После этого к якорю прикрепляется короткий (до 10 см) участок проволоки и без изгибов соединяется с трубкой, идущей через порт в верхний или нижний резервуар (на выбор), после входа в резервуар в трубку следует установить пробку во избежание протечек, после установки этой пробки в трубке продольно вырезается стенка под длину графта, так чтобы осталось не менее длины ее окружности. Другой конец трубки герметично закрывается или подключается по любой схеме к перфузионной системе насоса. В случае перфузии рекомендуется создать еще одно отверстие трубки сразу после установленной пробки для усиленного оттока жидкости в резервуар. Сам графт устанавливается в вырез трубки, а его свободный конец закрывается через наложение лигатуры или через пластиковый наконечник с фильтром и пробкой / крышкой, если его перфузия через просвет не требуется. Если же требуется перфузия, то свободный конец закрепляется на вращающейся трубке через прокол иглой, проволокой или плотную установку пластикового наконечника с открытым просветом. Все элементы соединения должны находится строго на одной линии. Резервуар заполняется рабочим раствором выше уровня, на котором закреплен графт или же на его уровне с обязательным подключением перфузии через порт на крышке верхнего резервуара. Скорость ротации трубки может дополнительно настраиваться через изменение ее соединения с магнитным якорем.

Система индикации готовности графта или его аварийного состояния с использованием контрольно-измерительной аппаратуры устанавливается следующим образом: при вертикальном креплении сосудистых графтов верхний резервуар использует порт (П1) под герметичную установку оптического модуля с двумя вариантами крепления (без дополнительных элементов для лазера и с использованием светонепроницаемой трубки для диодов), в случае использования горизонтального крепления сосудистых графтов используется любой порт точно напротив просвечиваемого объекта.

Нижний резервуар имеет окно визуального контроля органами технического зрения и сбора данных с помощью датчиков контрольно-измерительной аппаратуры, в т.ч. с передачей информации на ЭВМ в режиме реального времени. Работа контрольно-измерительной аппаратуры основана на измерении уровня вторичного рассеянного излучения (в т.ч., как вариант ультрафиолетового) от поверхности сосуда, чьи спектральные характеристики (уровень проницаемости стенок и их окрашивание) изменяются с течением времени ввиду удаления клеточного состава - иными словами на датчики внутри камеры будет поступать все больше и больше света. Так в случае аварийного разрыва креплений сосуда оператор получит предупреждение о резко изменившемся уровне освещенности камеры и будет иметь возможность оперативного вмешательства. Контрольно-измерительная аппаратура подключается по известным схемам и не оказывает влияния на сущность устройства. На выбор оператора может быть установлен следующий тип датчика: датчик ультрафиолетового излучения, фоторезистор, CCD / CMOS чип. На выбор оператора может быть использован следующий источник излучения: фиолетовый лазерный модуль (длинна волны - 405 нм, 20 мВт), светодиод ультрафиолетовый, белый или цветной светодиод. Для сбора и анализа данных используется стандартное программное обеспечение, прилагающееся к контрольно-измерительной аппаратуре. Также нижний резервуар имеет в области воздушного мешка в верхней половине одно или несколько самогерметизирующихся отверстий для дополнительного введения растворов. Описание работы устройства. Устройство работает следующим образом. В зависимости от планируемого объема работ, количества и размеров сосудистых графтов, обрабатываемых за одну операцию, оператор выбирает нужный размер резервуаров устройства, схему крепления графтов, перфузионные трубки под их длину и диаметр и нужное количество активных портов, при этом неиспользуемые порты герметизируются или используются для подключения контрольно-измерительной аппаратуры или смены растворов. Графты могут устанавливаться в оба резервуара сразу, в том числе с совместным использованием горизонтального и вертикального типов крепления. После подготовки детергентно-ферментативных растворов по любому удобному для оператора протоколу сосудистый графт / графты закрепляют в резервуарах, используя любой удобный тип крепления. При вертикальном расположении графтов рекомендуется закреплять их под небольшим углом, в частности для удобства лазерной биоспектрофотометрии. После герметизации всех соединений обоих резервуаров и заполнения нижнего рабочим раствором включают перистальтический насос биореактора, тем самым перекачивая раствор из нижнего резервуара в верхний (одноканальная схема перфузии сосудистого графта). В зависимости от расположения и крепления графтов, раствор либо проходит через их просвет под силой тяжести обратно в нижний резервуар (вертикальное расположение), либо за счет прямой перфузии от трубки, подключенной к насосу, с регулируемой скоростью (горизонтальное расположение, рекомендуемая скорость перфузии - 40 мл / мин). Для увеличения динамики тока жидкости в просвете графта и вокруг него оператор должен выбрать одно из технических решений, исходя из его материально-технической базы. После изменения проницаемости тканей графта или по прошествии заданного отрезка времени оператор выключает насос и производит удаление графтов из системы.

При подключении нескольких графтов для их перфузии рекомендуется подключение силиконовых трубок 1/4’’ * 1/8’’ или 1/8’’ * 1/8’’ к Y-фиттингом для более экономного использования рабочего пространства биореактора, также можно подключить к устройству дополнительный перистальтический насос большей мощности через техническое отверстие биореактора в случае одновременной обработки более 8-ми графтов в одном резервуаре. При отсутствии возможности по подключению перфузионных трубок ко всем графтам, возможен вариант их крепления с закрытым концом и отмывкой их сверху вниз.

Пример осуществления способа.

В Центре биомединских технологий ФМБЦ им. А.И. Бурназяна был создан и испытан опытный образец устройства с использованием крепления графтов типа КПК и способа распределения жидкости УММ в сравнении с трубчатой горизонтальной камерой двухканального подключения, предлагаемой компанией EBERS Medical для использования в биореакторе EBERS-TEB500. Для получения графтов использовались два идентичных участка бедренной артерии человека. Качество полученных графтов оценивалось при гистологическом исследовании и определении остаточного количества ДНК. По результатам испытаний вертикальная камера (описанная в данной полезной модели) продемонстрировала более качественную децеллюляризацию по сравнению с вертикальной, что подтверждалось содержанием ДНК в графте 10 и 50 ng/mg соответственно.

Условные обозначения для фиг. 1

1 - Верхний резервуар (BP)

2 - Нижний резервуар (HP)

3 - Промежуточный резервуар (ПР)

4-16 - Порты для подключения перфузионных трубок и контрольно-измерительной аппаратуры с самогерметизирующимися отверстиями.

17 - Завинчивающийся коннектор со сквозным портом для соединения двух резервуаров между собой (К)

18-19 - Съемная крышка с портом по центру для верхнего и нижнего резервуаров (СК)

20 - Оптический модуль (ОМ)

21 - Окно визуального контроля и порт для подключения контрольно-измерительной аппаратуры (ОК)

22 - Якорь магнитного перемешивателя (ЯМ)

23 - Удаленный магнитный перемешиватель с якорем (УМП)

24 - Вертикальное крепление графта на гибком металлическом каркасе (КГК)

25 - Вертикальное крепление графта в гибкой трубке с вырезом (КГТ)

26 - Вертикальное крепление графта на двух наконечниках (ККН)

27 - Вертикальное крепление графта проколом иглой или проволокой (КПИ)

Предлагаемое устройство повышает качество процесса децеллюляризации, а именно позволяет проводить более тщательную процедуру отмывки от клеток биоматериала человеческого или животного происхождения, в частности сосудистых графтов, увеличивает количество биоматериала на выходе (позволяя обрабатывать более 10-ти сосудистых графтов в одном устройстве) и возможные его варианты по внутреннему диаметру (это позволяет выбрать для создания сосудистых графтов большинство сосудов и вен доступных для изъятия), увеличивает общую безопасность процесса (следить за их состоянием сосудистых графтов и за работой устройства в автоматическом режиме) и оптимизирует временные затраты, а также позволяет более эффективно использовать рабочее пространство биореактора. Помимо этого, устройство позволяет менять расположение обрабатываемых сосудистых графтов, тип их крепления, а также задавать ротацию в вертикальной или горизонтальной плоскости, а также модифицировать саму схему отмывки от клеток.

При проведении патентных исследований на территории РФ не обнаружены решения полностью идентичные заявленному, а, следовательно, заявленная полезная модель соответствует критерию «новизна».

Изобретение не ограничивается описанным здесь вариантом обработки как в части, касающейся типа и происхождения сосуда, используемого для получения графта, так и в части параметров процесса его детергентно-ферментативной обработки в устройстве.

1. Устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра, включающее проточную камеру, отличающееся тем, что камера смонтирована вертикально, имеет три резервуара с регулируемыми по диаметру герметичными крышками, причем верхний и нижний резервуары соединены между собой через завинчивающийся коннектор со сквозным портом, куда, в свою очередь, установлен промежуточный резервуар, где верхний и нижний резервуары имеют по всем сторонам кроме основания порты для перфузионных трубок подачи и отвода среды и для контрольно-измерительной аппаратуры, а промежуточный резервуар имеет один порт в крышке и до пяти портов в основании, причем устройство также содержит трубки подвода и отвода среды, компоненты для вертикального закрепления графтов на гибком металлическом каркасе и на конце силиконовой трубки с возможностью ротации и для горизонтального закрепления на пластиковых конусовидных наконечниках с фильтром, в просвете гибкой трубки с продольным вырезом или через сквозной прокол проволокой или иглой в верхнем и нижнем резервуарах, а также систему индикации готовности графтов или аварийных ситуаций с использованием интегрируемой контрольно-измерительной аппаратуры и методов рефрактометрии и спектрофотометрии.

2. Способ оптимизации работы устройства по п.1, включающий перемешивание жидкости в резервуарах за счет встряхивания, отличающийся тем, что устройство или съемное основание нижнего резервуара соединяют проволокой с орбитальным шейкером.

3. Способ оптимизации работы устройства по п.1, включающий перемешивание жидкости в резервуарах, отличающийся тем, что устройство устанавливают на магнитную мешалку с якорем в нижнем резервуаре.

4. Способ оптимизации работы устройства по п.1, включающий перемешивание жидкости в резервуарах, отличающийся тем, что магнитную мешалку устанавливают перпендикулярно устройству, на боку, и используют для вертикальной и горизонтальной ротации закрепленного графта.

5. Способ оптимизации работы устройства по п.1, включающий перемешивание жидкости в резервуарах, отличающийся тем, что трубку подвода устройства соединяют с выступом вала головки перистальтического насоса для контролируемой ротации графта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих.

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложен выделенный пептид-эпитоп, полученный из ассоциированной с кинетохором молекулы 2 (KNTC2) и обладающий способностью к индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) в присутствии антигенпрезентирующей клетки (APC), несущей HLA-A*0201.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мыши для экспрессии гуманизированного белка SIRPα, содержащей замещение экзонов 2, 3 и 4 гена SIRPα мыши в эндогенном локусе SIRPα мыши на экзоны 2, 3 и 4 гена SIRPα человека с образованием гуманизированного гена SIRPα, а также к клетке и ткани вышеуказанной мыши.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу получения хромогранин A(CHGA)-отрицательных клеток. Способ включает обеспечение контакта клеток человеческой дефинитивной эндодермальной линии (исключая клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных итсключительно способом, требующим разрушения эмбриона) in vitro с по меньшей мере 50 нг/мл члена суперсемейства TGFβ и по меньшей мере 25 нг/мл члена семейства Wnt.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения неистощенных незрелых дендритных клеток (ДК), происходящих из двух различных аллогенных доноров, с их последующей активацией и получением провоспалительных ДК.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, способам дифференцирования клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на дефинитивную энтодерму, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на панкреатическую энтодерму, способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, указывающие на эндокринную часть поджелудочной железы.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к композиции среды для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбриона, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью и способу получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к пошаговой дифференцировки in vitro плюрипотентных клеток в популяцию клеток линии панкреатической энтодермы, которые экспрессируют PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с панкреатическими клетками передней кишки, а также к дифференцировке в панкреатические бета-клетки.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью (варианты).

Изобретение относится к области биохимии. Предложено устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих.

Изобретение относится к криоконсервации биологических объектов. Предложенный способ подбора условий для криоконсервации биологических объектов в вязких средах с использованием гидратообразующих газов предусматривает внесение исследуемых криопротекторов в среду для криоконсервации, при этом: а) на первом этапе измеряют вязкость контрольного раствора одного или более криопротекторов, дополнительно содержащего наночастицы при его охлаждении в рабочем диапазоне температур от +20˚С до целевой температуры, выбранной в интервале от -10 до -130°С; б) на втором этапе измеряют вязкость раствора криопротектора или композиции криопротекторов, дополнительно содержащего наночастицы с пониженной концентрацией на 5-45% под давлением гидратообразующего газа в процессе охлаждении раствора; в) если значение вязкости криопротектора или композиции криопротекторов с пониженной концентрацией не достигает вязкости контрольного раствора вплоть до целевой температуры, то сниженную концентрацию криопротектора или композиции криопротекторов необходимо повышать и снова проводить измерение согласно пункту б); г) если же в интервале до целевой температуры значение вязкости криопротектора или композиции криопротекторов с пониженной концентрацией достигает значения параметра вязкости в контрольном растворе, то проводится третий этап.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл.

Изобретение относится к медицине, в частности к хранению биологических образцов. Устройство для криоконсервации в закрытой системе для витрификации биологических образцов содержит удлиненный корпус, усеченный конус, проходящий от первого конца удлиненного корпуса, наконечник для сбора образцов, проходящий от указанного конуса в направлении, противоположном удлиненному корпусу, и удлиненный колпачок для герметичного закрытия биологического образца удлиненной полой камерой.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ и устройство для экстракции биомолекул.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен носитель для культивирования клеток человека и животных.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении клеточных культур. Для криоконсервации используют контейнер с регулируемым объемом и возможностью его герметизации, при этом осуществляют вывод атмосферного газа из внутреннего объема контейнера и последующий ввод объема суспензионной клеточной культуры.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена оснастка для получения заготовки микрофлюидного чипа, способ получения заготовки микрофлюидного чипа, заготовка микрофлюидного чипа, способ изготовления микрофлюидного чипа и микрофлюидный чип.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к безвекторной микрожидкостной платформе для внутриклеточной доставки в цитозоль эукариотической клетки соединения или композиции.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к получению биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка. Способ включает обработку ткани из натурального шелка водно-спиртовым раствором хлорида кальция при молярном соотношении хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8 соответственно, при 20-80°С в течение 10-120 минут, нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способного к адгезии и пролиферации клеток млекопитающего.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью (варианты).

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для двухсторонней децеллюляризации сосудистых графтов различного диаметра и способ оптимизации работы указанного устройства. Устройство включает проточную вертикальную камеру с тремя резервуарами, систему индикации готовности графтов или аварийных ситуаций, трубки подвода и отвода среды, компоненты для вертикального и горизонтального закрепления графтов в верхнем и нижнем резервуарах. Верхний и нижний резервуары имеют по всем сторонам кроме основания порты для трубок подачи и отвода среды и для контрольно-измерительной аппаратуры, а промежуточный резервуар имеет один порт в крышке и до пяти портов в основании. Способ включает перемешивание жидкости в резервуарах, где устройство или съемное основание нижнего резервуара соединяют проволокой с орбитальным шейкером, либо устройство устанавливают на магнитную мешалку с якорем в нижнем резервуаре, либо магнитную мешалку устанавливают перпендикулярно устройству и используют для вертикальной и горизонтальной ротации закрепленного графта, либо трубку подвода устройства соединяют с выступом вала головки перистальтического насоса для контролируемой ротации графта. Изобретения обеспечивают высокую производительность процедуры тщательной отмывки сосудистых графтов от клеток. 5 н.п. ф-лы, 1 ил.

Наверх