Флуоресцентный оптический днк-сенсор

Авторы патента:

Наговицын Илья Анатольевич (RU)

Курилкин Владимир Васильевич (RU)

Чудинова Галина Константиновна (RU)

Бутусов Леонид Алексеевич (RU)

G01N33/64 - с использованием кетонов

G01N33/532 - получение меченых иммунологических материалов

G01N33/525 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

Владельцы патента RU 2684276:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)

Изобретение относится к аналитической химии, а именно для изучения различных биомолекул методом люминесцентной визуализации клеток и их компонент. Для этого используют флуоресцентный оптический ДНК сенсор, состоящий из подложки и адсорбированной на ней тонкой пленки комплекса ДНК-люминофор. Подложка выполнена из оксида цинка размером 18×18 мм, люминофором являются сложные оксиды редкоземельных элементов, такие как ванадаты, вольфраматы, молибдаты, ренаты иттрия и гадолиния, содержание которых в тонкой пленке составляет от 10^-8 до 10^-12 мг/мл. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности флуоресцентного оптического ДНК-биосенсора для детекции биомакромолекул в концентрации менее 10-15 мг/мл. 1 табл., 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к аналитической химии и касается биосенсорных технологий, в частности, флуоресцентного оптического ДНК-сенсора. Изобретение может быть использовано для изучения различных биомолекул методом люминесценции, для маркирования белков, в качестве клеточного маркера при люминесцентной визуализации клеток и различных их компартментов (митохондрий, клеточных белков и ядер), а также для изучения процессов миграции энергии при моделировании природного фотосинтеза.

Из уровня техники известен Перилен-нановолоконный флуоресцентный сенсор для высокочувствительного и селективного определения аминов (US 8486708 В2), который содержит матрицу из нановолокон перилена. Данный биосенсор заявлен как избирательное и высокочувствительное устройство. Пленка из нановолокон перилена наносится на подложку и после обработки представляется собой пористую структуру, захватывающую молекулы газообразных аминов с их последующей детекцией. При этом, стандартизация нановолокон не описана.

Также известен биосенсор для визуального детектирования (Заявка на выдачу патента на изобретение RU 2015102212), который включает в себя распознающую биомолекулу из перечня, состоящего из антител, пептидов, ферментов, полисахаридов, нуклеиновых кислот (ДНК), аптамеров или пептидно-нуклеиновых кислот; металлические наночастицы из перечня, состоящего из наночастиц золота, наночастиц серебра или наночастиц меди; молекулу-метку и молекулу, специфично связывающуюся с меткой; теплочувствительную бумагу, присоединенную к подложке из перечня, состоящего из стекла, кремния, полистирола, мембран из целлюлозы и ее модификаций. Главными недостатками данного устройства является 1) узкая селективность 2) визуальное определение наличия молекул аналита, что не дает представлений о концентрации анализируемых биомолекул.

Также известен "Флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор" (Патент RU 2616879), который содержит биосенсорное устройство с флуоресцентной регистрацией для определения белковых молекул на основе монокристаллического кремния. Недостатком данного устройства является сигнал низкой интенсивности, делающим затруднительным регистрацию биомакромолекул малых концентраций. Заявленный порог детекции белковых молекул составляет 10-15 мг/мл,

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности флуоресцентного оптического ДНК-биосенсора для детекции биомакромолекул в концентрации менее 10-15 мг/мл.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что оптический ДНК-биосенсор с флуоресцентной регистрацией, содержит подложку и его модификаций сложными оксидами редкоземельных элементов, обладающего возможностью многократного его использования без потери чувствительности, в частности, при определении белковых молекул в малых концентрациях. Технический результат достигается тем, что оптический ДНК-биосенсор флуоресцентной регистрацией состоит из подложки и адсорбированной на подложке тонкой пленки комплекса ДНК-белок - неорганический люминофор, при этом подложка выполнена из оксида цинка размером 18×18 мм, неорганическим люминофором являются сложные оксиды редкоземельных элементов - ванадаты, ренаты, молибдаты, вольфраматы иттрия и гадолиния, содержание ДНК 3 мг/мл, а содержание люминофора в тонкой пленке составляет от 10-8 до 10-14 моль/л.

Изобретение позволяет детектировать белковые молекулы в системе ДНК-белок, сформированной на подложке из оксида цинка, при малых концентрациях белковых молекул, так же существует возможность модификации для увеличения селективности, уменьшении или увеличении чувствительности биосенсорного устройства в зависимости от анализируемых белков или каких-либо других биоорганических молекул и их концентраций.

Сущность способа создания биосенсора заключается в том, что способ состоит из следующих стадий:

а) подготовка подложки

б) приготовление биоспецифичного слоя происходит в несколько этапов:

Навеску ДНК, полученную из тимуса теленка, в количестве 30 мг растворяют в 10 мл 0,1М раствора NaCl, добавляют неорганический люминофор к раствору ДНК в соотношении 1к1, обрабатывают ультразвуком на сонификаторе (частота 42 кГц) в течении 40 минут для полноты растворения и увеличения скорости взаимодействия;

в) нанесение биоспецифичного слоя из приготовленного раствора в количестве 20 мкл методом спинкоатинга (скорость вращения 2000 об/мин)

Пример 1. Определение гемоглобина человека с помощью предложенного сенсора

Использовали материалы: ДНК из тимуса теленка, гемоглобин человека. Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе Branson 1510 (42 кГц) 40 минут в 0,1 моль/л растворе NaCl. Раствор ДНК (0,3 мг/мл) смешивали с раствором белка различных концентраций в 0,1 моль/л NaCl в соотношении 9:1 так, чтобы концентрация белка в растворе для нанесения на подложку составляла от 10-13 до 10-17 моль/л.

Пленку получали методом спинкоатинга на подложках оксида цинка (18×18 мм) на установке на основе центрифуги «Элекон» ЦЛМН-Р 10-02 (Россия) при скорости вращения подложки 2000 об/мин. Объем наносимого раствора - 20 мкл.

Результаты определения гемоглобина человека с помощью предложенного сенсора представлены на рисунке 1. При определении белка в концентрации 10-17 мг/мл устройством биосенсора величина интенсивности сигнала существенно падает и составляет 9 относительных единиц.

Пример 2. Определение сывороточного альбумина человека с помощью предложенного сенсора

Использовали материалы: ДНК из тимуса теленка, сывороточный альбумин человека. Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе Branson 1510 (42 кГц) 40 минут в 0,1 моль/л растворе NaCl. Раствор ДНК (0,3 мг/мл) смешивали с раствором белка различных концентраций в 0,1 моль/л NaCl в соотношении 9:1 так, чтобы концентрация белка в растворе для нанесения на подложку составляла от 10-13 до 10-17 моль/л.

Результаты определения гемоглобина человека с помощью предложенного сенсора представлены на рисунке 2. При определении белка в концентрации 10-17 мг/мл устройством биосенсора величина интенсивности сигнала существенно падает и составляет 16 относительных единиц.

Пример 3. Получение комплекса ДНК-НЛ-Белок

Навеску ДНК обрабатывали ультразвуком на сонификаторе (42 кГц) 40 минут в 0,1 М растворе NaCl. Навеску сложного оксида люминофора (3 мг) добавляли в раствор ДНК-белок (сывороточный альбумин) (3 мг/мл) в 0,1 М NaCl с последующими разбавлениями до различных концентраций так, чтобы концентрация нанокристаллитов люминофора для нанесения на положки составляла от 10-6 до 10-14 М. Избыток люминофора, убирался из раствора путем фильтрации.

Пленки получали методом спинкоатинга на подложках оксида цинка (18×18 мм) на установке на основе центрифуги «Элекон» ЦЛМН-Р 10-02 (Россия) при скорости вращения подложки 2000 об/мин. Объем наносимого раствора - 20 мкл.

Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре. Регистрацию интенсивности флуоресценции осуществляли с интервалом 0.2 нм при щелях возбуждения 3 и 5 нм соответственно.

В качестве неорганического люминофора используются сложные оксиды иттрия и гадолиния: ванадаты (YVO4, GdVO4), вольфраматы (Y2(WO4)3, Gd2(WO4)3), молибдаты (Y2(MoO4)3, Gd2(MoO4)3) и ренаты (Y3ReO8, Gd3ReO8).

В таблице 1 показана величина сигнала для системы ДНК-Белок-НЛ при различных концентрациях неорганического люминофора и различном составе.

Флуоресцентный оптический ДНК сенсор, состоящий из подложки и адсорбированной на ней тонкой пленки комплекса ДНК-люминофор, отличающийся тем, что подложка выполнена из оксида цинка размером 18×18 мм, люминофором являются сложные оксиды редкоземельных элементов, такие как ванадаты, вольфраматы, молибдаты, ренаты иттрия и гадолиния, содержание которых в тонкой пленке составляет от 10^-8 до 10^-12 мг/мл.

Способ определения периода индукции окисления // 217031

Способ селективного анализа на основе иммунологических реакций с использованием биочипов // 2642055

Изобретение относится к медицине, в частности к средствам исследования и диагностики с помощью биочипов. Способ селективного анализа на основе иммунологических реакций с использованием биочипов включает подготовку пробы, смешение антигенов пробы с суперпарамагнитными частицами, соединенными с антителами к указанным антигенам пробы, транспортировку смеси в зону селективного детектирования по имуннологическим реакциям через капилляры и воздействие на смесь магнитным полем.

Применение антитела i-3859 для выявления и диагностики рака // 2636032

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению выделенного антитела к CXCR4 в диагностике рака, что может быть использовано в медицине. В частности, раскрыты способы диагностики и/или прогнозирования онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, определения, является ли указанное расстройство или пациент, страдающий им восприимчивым к лечению анти-CXCR4 антителом, способы определения эффективной схемы лечения и наборы для лечения указанных заболеваний.

Способ определения содержания бактерий с использованием в качестве метки модифицированных магнитных наночастиц // 2612143

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к электрохимическому иммуноанализу. Предложен способ определения содержания грамотрицательных бактерий в анализируемой среде.

Терапевтические dll4-связывающие белки // 2570639

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) человека, в том числе в форме меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конструкции с константным доменом иммуноглобулина, конъюгата с терапевтическим или цитотоксическим средством и в кристаллизованной форме.

Анти-cd79b антитела и иммуноконъюгаты и способы их применения // 2553566

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты гуманизированного анти-CD79b антитела, каждый из которых характеризуется наличием легкой и тяжелой цепи и набором 6 CDR с установленной аминокислотной последовательностью и по меньшей мере одним свободным цистеиновым аминокислотным остатком, выбранным из А118С (по Европейской нумерации) в тяжелой цепи и V205C (по нумерации Кэбат) в легкой цепи.

Способы, устройства и наборы для детекции или мониторинга острого повреждения почек // 2519722

Группа изобретений относится к медицине и касается способа определения в образце индивидуума белка нейтрофильного происхождения липокалина, связанного с желатиназой (NGAL), для определения острого повреждения почек у индивидуума, где преобладающее количество мономерной и/или гетеродимерной форм белка NGAL, по сравнению с димерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума и что у индивидуума наблюдается острое повреждение почек, тогда как равное или преобладающее количество димерной формы белка NGAL, по сравнению с мономерной или гетеродимерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума и что указанный индивидуум не имеет острого повреждения почек; набора для определения в образце относительных количеств мономерной, димерной и гетеродимерной форм NGAL; применения набора в указанном способе.

Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом // 2497128

Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом относится к биохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного и ДНК гибридизационного анализа.

Способ верификации фазы гнойно-септических осложнений при остром деструктивном панкреатите // 2490646

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии, морфометрии, абдоминальной хирургии. .

Быстрый биосенсор со слоем реагента // 2482495

Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом // 2437159

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии. .

Способ количественного определения производных пиперидина (группы бутирофенонов) // 2684101

Изобретение относится к фармацевтическому анализу и может быть использовано для количественного определения производных пиперидина (группы бутирофенонов), а именно галоперидола, галоперидола деканоата, трифлуперидола, диклонина, эбастина, флуанизина, толперизона, дроперидола, бенперидола и окскарбазепина в субстанциях.

Способ ранней дифференциальной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом // 2683955

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).

Способ диагностики газового состава метаболитов микробиоты человека // 2683949

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и микробиологии и описывает способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека.

Способ определения суммарного содержания f-, cl- и br-органических соединений в волосах на уровне следов // 2683938

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для определения содержания галогенорганических соединений в волосах человека и касается экологического контроля загрязнения внутренней среды человека.

Способ количественного определения производных 5-нитроимидазола (группы нидазолов) // 2683783

Изобретение относится к фармацевтическому анализу, а именно к анализу материалов с помощью оптических средств, и может быть использовано при количественном определении производных 5-нитроимидазола (группы нидазолов) в субстанциях.

Ферментативное определение hba1c // 2683773

Изобретение относится к способу определения количества гликозилированного гемоглобина (HbA1c) в пробе, включающему гемолиз эритроцитов в пробе для высвобождения содержащегося в них HbA1c, приведение в контакт высвобожденного гемоглобина с протеолитическим агентом для получения гликозилированных продуктов разложения гемоглобина, определение количества HbA1c за счет количественного определения гликозилированных продуктов разложения гемоглобина.

Тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий hv2 мтднк // 2683571

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Погружной зонд для замера температуры и отбора пробы металлического и шлакового расплава в конвертере // 2683376

Изобретение относится к средствам измерения и касается устройств погружных зондов для замера температуры и отбора проб металлургических расплавов, в частности жидкой стали и сталеплавильного шлака.

Способ прогнозирования риска развития рожи // 2683314

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, терапии, медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития рожи.