Количественная оценка has-mir-16-5p, has-mir-425-5p, has-mir-17-5p, has-mir-20a-5p, has-mir-101-3p, has-mir-30d-5p и has-mir-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкогинекологии, и предназначено для неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников. Предложена количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин. Методом количественной ПЦР в реальном времени в образце плазмы крови женщины определяют уровень экспрессии семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p) с предпочтительным использованием стандартных ДНК для последующего расчета оценочного параметра (ОП) при построении модели PLS-DA. При значении 0<ОП<4,5 делают заключение о высокой вероятности наличия серозной опухоли яичников у женщины (серозных пограничных цистаденом и серозных цистаденокарцином высокой степени злокачественности). При значении -1,8<ОП<0 делают заключение о высокой вероятности отсутствия серозной опухоли яичников. Изобретение обеспечивает дифференциальную диагностику серозных опухолей яичников с высокой точностью и диагностической значимостью. 12 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к онкогинекологии, к способам неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом (СПЦАЯ) и высокой степени злокачественности серозных цистаденокарцином (СЦАКЯВСЗ) яичников методом количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) в реальном времени. Может быть использовано для неинвазивного экспресс-анализа наличия СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ у женщин в рамках плановой диспансеризации, в качестве дополнительного метода исследования с целью уточнения диагноза до хирургического лечения, оценки эффективности хирургического и консервативного лечения, выявления рецидивов заболевания.

На сегодняшний день рак яичников занимает седьмое место в структуре общей онкологической заболеваемости, пятое место среди причин смерти от всех злокачественных опухолей у женщин [1] и лидирующее место среди онкогинекологических заболеваний по данным Международного агентства по изучению рака (IARC). Эпителиальный рак составляет 90% от всех случаев диагностированного рака яичников, является гетерогенной группой карцином и состоит из нескольких гистологических подгрупп, а именно: карцинома Бреннера, эндометриоидная, муцинозная и серозная карцинома, каждая характеризующаяся индивидуальными молекулярно-генетическими характеристиками [2, 3]. Среди них, на долю серозного типа приходится 75-80% эпителиальных злокачественных новообразований, и большинство серозных карцином диагностируется уже на поздних стадиях заболевания. Наибольшая летальность (около 70%) наблюдается среди пациентов с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности, образуемой в результате трансформации первичной опухоли в агрессивный и высоко инвазивный тип опухоли, ассоциированный со сменой эпителиального фенотипа на мезенхимальный. На сегодняшний день отсутствуют клинико-диагностические и молекулярно-биологические способы раннего выявления этих преобразований опухоли. При этом серозный рак яичников высокой степени злокачественности, как правило, характеризуется высокой гетерогенностью опухоли и соответствующей геномной нестабильностью, изменением статуса метилирования промоторов кодирующих белок генов и некодирующих участков генома, изменением уровня экспрессии как белков, так и их регуляторов на посттранскрипционном уровне (в том числе микроРНК) [4-7], что обусловливает многокомпонентный и многоуровневый патогенез рака яичников и осложняет поиск маркерных молекул для характеристики этого заболевания. Используемые в настоящий момент диагностические маркеры (в том числе СА125 и НЕ4) не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью для выявления серозного рака яичников [8]. Известно, что ложноположительные результаты по уровню СА125 в сыворотке крови могут быть получены при эндометриозе, аденомиозе, воспалительных заболеваний в малом тазу, фиброме матки или доброкачественных кистах. Например, при проведении ретроспективного анализа образцов сыворотки 5500 женщин Швеции было выявлено повышение уровня СА125 у 175 женщин, среди которых лишь у 6 был диагностирован рак яичников, при этом у 3 женщин с нормальным уровнем СА125 был выявлен рак яичников [9].

МикроРНК (мкРНК) являются новым классом эндогенных некодирующих одноцепочечных коротких РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые регулируют функцию мРНК путем комплементарного взаимодействия, обусловливающего снижение стабильности мРНК и/или ингибирование трансляции соответствующего белка. Использование инновационного вычислительного метода при массовом объединении данных секвенирования малых РНК позволило в 2014 году идентифицировать 2469 последовательностей мкРНК человека [10], из которых в базе данных miRBase v21 зарегистрирована 1881 мкРНК человека [http://www.mirbase.org/cgibin/mirna_summary.p1?org=has]. Известные на 2014 год мкРНК кодируются в интронных (47%), межгенных (25%) областях, в экзонах (8%), повторяющихся последовательностях (12%) и других участках (4%) генома. Одна и та же мкРНК может участвовать в регуляции сотни генов-мишеней, в то время как каждый из структурных генов является мишенью для различных мкРНК [11]. Теоретически, экспрессия 60% генов человека находится под контролем мкРНК [12]. Большинство мкРНК обладает онкогенной или онкосупрессорной активностью и могут регулировать различные биологические процессы, включая клеточный метаболизм, пролиферацию, апоптоз и химиорезистентность [13, 14]. Поскольку экспрессия мкРНК является тканеспецифичной, детектируется в крови [15] и коррелирует с клиническими проявлениями онкологического заболевания [16], мкРНК можно использовать в качестве потенциальных диагностических и прогностических онкомаркеров.

В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [17], согласно которому методом количественной ПЦР в реальном времени возможно определить содержание РНК в ткани или биологической жидкости организма посредством циклической реакции амплификации кДНК, являющейся копией РНК и синтезируемой в ходе реакции обратной транскрипции.

Количественное определение мкРНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени включает в себя три этапа: 1) синтез кДНК в ходе сопряженных реакций полиаденилирования и обратной транскрипции мкРНК с олиго(дТ), сцепленного с универсальным праймером; 2) амплификацию последовательности кДНК путем цикличной реакции денатурации ДНК, отжига специфичного для мкРНК смыслового праймера и универсального антисмыслового праймера, удлинения праймеров ДНК-полимеразой с одновременной детекцией флуоресценции интеркалирующего в двухцепочечную ДНК красителя SYBRgreen после каждого цикла реакции; 3) анализ полученных результатов и определение относительного количества кДНК в образце. Количество специфической кДНК в образце зависит от концентрации мкРНК в биологическом материале, степени деградации анализируемой РНК, эффективности выделения РНК, реакции обратной транскрипции, которая крайне чувствительна к примесям контаминирующих агентов в образце [18], эффективности ПЦР. Для того, чтобы учесть влияние вышеперечисленных факторов на количественную оценку специфической кДНК в каждом из образцов анализируют количество нормировочной эндогенной мкРНК, уровень экспрессии которой не меняется при развитии исследуемого патологического процесса. Для оценки эффективностей выделения РНК и реакции обратной транскрипции используют нормировочную экзогенную мкРНК, например, cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, Qiagen, Germany), которую добавляют в обработанные фенольной смесью анализируемые образцы в одинаковом количестве на этапе выделения РНК из данных образцов.

В настоящем изобретении выбор нормировочной эндогенной мкРНК осуществляется по схожести ее количественного профиля с таковым нормировочной экзогенной мкРНК во всех анализируемых образцах.

Как правило, относительный уровень экспрессии кДНК определяют по уравнению (1): (M_0s1/M_0s2)=2^-ΔΔCt, где M_0s1 и M_0s2 - исходные количества кДНК в образцах s1 и s2, ΔΔCt=(Ct_s1-Ct_norm1)-(Ct_s2-Ct_norm2), Ct - значение цикла амплификации в точке пересечения кинетической кривой накопления продукта амплификации с линией порогового уровня флуоресценции, который определяется автоматически программным обеспечением амплификатора; Ct_s1 и Ct_s2 - значение порогового цикла амплификации кДНК анализируемой мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2; Ct_norm1 и Ct_norm2 - значение порогового цикла амплификации кДНК нормировочной эндогенной или экзогенной мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2. Использование метода ΔΔCt возможно при условии, что эффективности реакций амплификации кДНК анализируемой и нормировочной мкРНК равны и близки к 100%. Невыполнение этого условия приводит к значительным ошибкам в результатах.

Для учета эффективности ПЦР проводят амплификацию исследуемой кДНК во всех анализируемых образцах и стандартной ДНК известной концентрации, взятой в реакцию в различных количествах. По калибровочной кривой зависимости Ct стандартной ДНК от десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК в реакционной смеси вычисляют исходную концентрацию исследуемой кДНК, исходя из значения Ct для данной кДНК. Стандартом для каждой исследуемой кДНК служит продукт ее амплификации, очищенный смесью фенол-хлороформ, осажденный 70% этиловым спиртом в присутствии 78 мМ ацетата натрия и промытый 80% этиловым спиртом. Концентрацию стандарта измеряют спектрофлуорометрическим способом, например, используя флуориметр Qubit 3.0 (Invitrogen™, USA), гомогенность стандартной ДНК оценивают по кривым плавления по окончании реакции амплификации.

Задача, решаемая предложенным изобретением, заключается в создании неинвазивного достоверного количественного метода определения маркеров СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ в плазме крови женщин, а именно: hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p. Предложенный метод применим в том числе и в клинической практике в рамках плановой диспансеризации, в качестве дополнительного метода исследования с целью уточнения диагноза до хирургического лечения, оценки эффективности хирургического и консервативного лечения, выявления рецидивов заболевания.

Предложенный способ определения концентрации hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в плазме крови женщин методом количественной ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предполагает: 1) выделение РНК из образцов плазмы периферической крови колоночным способом, например, набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany), в течение 1 часа; 2) синтез кДНК в ходе реакции обратной транскрипции мкРНК, например, набором miScript® II RT Kit protocol (Qiagen, Germany) в течение 1 часа 30 минут; 3) амплификацию кДНК с помощью ПНР в реальном времени, например, набором miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) и специфичных для мкРНК смысловых праймеров, например, на приборе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA) в течение 5 часов, которая включает детекцию флуоресцентного сигнала с интеркалирующего в двухцепочечный продукт реакции красителя SYBRGreen в режиме реального времени, построение кривых плавления продуктов реакции, обработку данных и их представление в графическом виде с помощью специального программного обеспечения. Применение ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени позволяет уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики.

Предлагается количественное определение семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) для неинвазивной диагностики СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ, выявленных авторами настоящего изобретения методом глубокого секвенирования мкРНК образцов СЦАКЯВСЗ при сопоставлении как с тканью серозной доброкачественной цистаденомы яичников (СДЦАЯ), так и с нормальной тканью фимбриального отдела маточной трубы (Фиг. 1). Определение относительной исходной концентрации кДНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в реакционной ПЦР-смеси осуществляют либо методом AACt, используя нормировочную эндогенную мкРНК hsa-miR-140-3р, либо по калибровочным кривым соответствующих ДНК-стандартов, построенных в виде зависимости Ct стандарта от десятичного логарифма исходных концентраций стандарта в реакционной смеси. Каждый из стандартов известной концентрации добавляют в реакционную ПЦР-смесь в шести последовательно убывающих трехкратных разведениях. Полученные результаты по концентрации кДНК каждой из hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p нормируют на концентрацию hsa-miR-140-3р, вычисленную так же по калибровочной кривой ДНК-стандарта.

Осуществление Изобретения.

Пример 1.

Материалом исследования являются образцы периферической крови практически здоровых женщин (возраст - 30±4 года, n=13), пациенток с СПЦАЯ (возраст - 51±14 лет, n=3) и СЦАКЯВСЗ (возраст - 48±10 лет, n=8), Фиг. 2. Взятие образцов периферической крови объемом 5 мл осуществляют в пробирки VACUETTE®, содержащие 0,1М раствор ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови). Образцы центрифугируют в течение 20 минут при 300 g (4°С), отбирают плазму, которую повторно центрифугируют в течение 10 минут при 14500 g (4°С). РНК выделяют из 200 мкл плазмы крови набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany) с предварительным добавлением в каждый образец 5,6×10⁸ копий экзогенной нормировочной мкРНК cel-miR-39 (Qiagen, Germany) после обработки фенол-содержащей смесью Qiazol (Qiagen, Germany). Семь из четырнадцати микролитров РНК-содержащего элюата колонки набора Serum Plasma kit конвертируют в кДНК в реакционной смеси (20 мкл), содержащей буфер (1x Hispec buffer), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (1x Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Germany); по окончании реакции объем образца доводят деионизованной водой до 200 мкл.

Синтезированную кДНК (2 мкл) используют в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с применением смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3р (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-140-3р (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, Qiagen, Germany, Tm=55°C) и 1x реакционную смесь (SYBR PCR Master Mix) с добавленным lx универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР.

Относительный уровень экспрессии кДНК вычисляют по разнице пороговых циклов амплификации кДНК анализируемой мкРНК (hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) и нормировочной эндогенной мкРНК (hsa-miR-140-3р) в одном и том же образце (Фиг. 3). Анализ значимости различий ΔCt мкРНК в группах женщин с серозными опухолями яичников и практически здоровых женщин выполняют с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни (Фиг. 4). Медиану ΔCt каждой из исследуемых мкРНК в группах СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ сопоставляют с таковой в группе практических здоровых женщин (Фиг. 5). Полученные данные ΔCt каждой из исследуемых мкРНК в образце используют для построения модели дискриминантного анализа методом частных наименьших квадратов (PLS-DA) и разработки оценочного параметра (ОП), позволяющего выявить различия между образцами плазмы женщин из группы серозных опухолей яичников (СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ; 1<ОП<8) и образцами плазмы практически здоровых женщин (-7<ОП<1). Результаты применения PLS-DA представлены на Фиг. 6. Вклад семи мкРНК в дифференциацию образцов по наличию или отсутствию СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ характеризуют значения параметра важности переменной в проекции (variable importance in projection - VIP), где наибольший вклад имеет miR-16-5p (VIP=1,19), наименьший - miR-30d-5p (VIP=0,53), а промежуточный - miR-17-5p (VIP=1,14), miR-93-5p (VIP=1,04), miR-20a-5p (VIP=1,03), miR-425-5p (VIP=0,97), miR-101-3р (VIP=0,92).

Пример 2.

Материалом исследования являются образцы периферической крови практически здоровых женщин (возраст - 30±4 года, n=13), пациенток с СПЦАЯ (возраст - 51±14 лет, n=3) и СЦАКЯВСЗ (возраст - 48±10 лет, n=8), Фиг. 2. Взятие образцов периферической крови объемом 5 мл осуществляют в пробирки VACUETTE®, содержащие 0,1М раствор ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови). Образцы центрифугируют в течение 20 минут при 300 g (4°С), отбирают плазму, которую повторно центрифугируют в течение 10 минут при 14500 g (4°С). РНК выделяют из 200 мкл плазмы крови набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany) с предварительным добавлением в каждый образец 5,6×10⁸ копий экзогенной нормировочной мкРНК cel-miR-39 (Qiagen, Germany) после обработки фенол-содержащей смесью Qiazol (Qiagen, Germany). Семь из четырнадцати микролитров РНК-содержащего элюата колонки набора Serum Plasma kit конвертируют в кДНК в реакционной смеси (20 мкл), содержащей буфер (1x Hispec buffer), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (1x Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Germany); по окончании реакции объем образца доводят деионизованной водой до 200 мкл.

Определение относительной исходной концентрации кДНК hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в реакционной ПЦР-смеси осуществляют по калибровочным кривым соответствующих ДНК-стандартов в виде зависимости Ct стандарта от десятичного логарифма исходных концентраций стандарта в реакционной смеси. Стандартом для каждой исследуемой кДНК служит продукт ее амплификации в 50 мкл реакционной смеси, содержащей один из смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3р (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-140-3р (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), 1x универсальный антисмысловой праймер (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany), 1x буфер (TaqTurbo buffer, Евроген) без флуоресцентного интеркалирующего красителя, lx смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (Евроген) и 5 единиц HS Taq ДНК-полимеразы (Евроген). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек. Синтезированные стандарты очищают смесью фенол-хлороформ, осаждают 70% этиловым спиртом в присутствии 78 мМ ацетата натрия и линейного акриламида, осадок промывают 80% этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл деионизированной воды. Концентрацию стандарта измеряют спектрофлуорометрическим способом в флуориметре Qubit 3.0 (Invitrogen™, USA).

Амплификацию синтезированных кДНК (2 мкл) проводят наряду с амплификацией соответствующей стандартной ДНК в шести последовательно убывающих трехкратных разведениях в реакционных смесях, содержащих один из смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3p (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR- 140-3p (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), 1x реакционную смесь (SYBR PCR Master Mix) с добавленным 1x универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР. На Фиг. 7 приведены кривые увеличения интенсивности флуоресценции реакционной смеси при амплификации последовательно уменьшающихся в три раза концентраций стандартной ДНК для miR-140-3р в зависимости от числа циклов ПЦР.

Для каждой анализируемой мкРНК в образце при помощи программного обеспечения прибора определяют величину порогового цикла (Ct), при котором значение флуоресценции реакционной смеси достигает «порогового» уровня (Т), одинакового для данной мкРНК во всех сравниваемых образцах, включая стандартную ДНК. Исходную концентрацию кДНК (М₀) в анализируемом образце вычисляют по уравнению калибровочной кривой:

Lg(M₀)=a-b*Ct, где a=1g(T), b=1g(1+Eff), Eff - эффективность ПЦР. Коэффициенты а и b уравнения вычисляют при построении калибровочной кривой. На Фиг. 8 приведены графики калибровочных кривых, определяющих зависимость значений Ct, полученных при амплификации шести разведений стандартной ДНК, и значений десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК 1g(M₀). По калибровочным кривым, представленным на Фиг. 8, вычисляют исходную концентрацию исследуемой кДНК hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-140-3р, исходя из значения Ct для данной кД НК. Полученные результаты по концентрации кДНК каждой из исследуемых мкРНК (hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20а-5р, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) нормируют на концентрацию hsa-miR-140-3р (Фиг. 9). Анализ значимости различий относительного уровня экспрессии мкРНК в плазме крови в группах женщин с серозными опухолями яичников и практически здоровых женщин выполняют с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни (Фиг. 10). Медиану относительного уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ сопоставляют с таковой в группе практических здоровых женщин (Фиг. 11).

Полученные данные относительного уровня экспрессии каждой из исследуемых мкРНК в образце используют для построения модели дискриминантного анализа методом частных наименьших квадратов (PLS-DA) и разработки оценочного параметра (ОП), позволяющего выявить различия между образцами плазмы женщин из группы серозных опухолей яичников (СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ; 0<ОП<4,5) и образцами плазмы практически здоровых женщин (-1,8<ОП<0). Результаты применения PLS-DA представлены на Фиг. 12. Вклад семи мкРНК в дифференциацию образцов по наличию или отсутствию СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ характеризуют значения параметра важности переменной в проекции (variable importance in projection -VIP), где наибольший вклад имеет miR-16-5p (VIP=1,96), наименьший - miR-30d-5p (VIP=0,34), а промежуточный - miR-20a-5p (VIP=0,98), miR-101-3р (VIP=0,75), miR-93-5p (VIP=0,75), miR-17-5p (VIP=0,69), miR-425-5p (VIP=0,65). Высокое значение Q2, равное 0,70, для модели PLS-DA указывает на то, что разделение образцов групп здоровых женщин и женщин с серозными опухолями яичников по профилям экспрессии вышеперечисленных семи мкРНК является качественным и надежным.

Фиг. 1. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в образцах ткани фимбриального отдела маточной трубы, СДЦАЯ, СЦАКЯВСЗ по данным глубокого секвенирования мкРНК.

Фиг. 2. Клинические характеристики пациенток, взятых в исследование.

Фиг. 3. Относительный уровень экспрессии кДНК анализируемых мкРНК методом ΔCt.

Фиг. 4. Результаты статистического анализа показателей уровней экспрессии кДНК анализируемых мкРНК методом ΔCt.

Фиг. 5. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ и контрольной группе (норма) методом количественной ПЦР. На бокс-диаграмме представлены медианы значений ΔCt, 25% и 75% квартилей.

Фиг. 6. Модель PLS-DA, построенная с использованием ОТ-ПЦР данных по экспрессии семи мкРНК в плазме крови в виде значений ΔCt в группах здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.

Фиг. 7. Кривые ПЦР в реальном времени трехкратных разведений стандартной ДНК для miR-140-3р. Стрелками обозначен уровень флуоресценции реакционной смеси, одинаковый для всех сравниваемых образцов, при котором определяется значение Ct.

Фиг. 8. Калибровочные кривые зависимости Ct стандартной ДНК от десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК для количественной оценки hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-140-3р в плазме крови женщин исследуемых групп.

Фиг. 9. Относительный уровень экспрессии кДНК в образцах групп здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.

Фиг. 10. Результаты статистического анализа относительного уровня экспрессии кДНК анализируемых мкРНК, вычисленного по калибровочным кривым с использованием стандартных ДНК.

Фиг. 11. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ и контрольной группе (норма) методом количественной ПНР с использованием калибровочных кривых стандартных ДНК. На бокс-диаграмме представлены медианы значений ΔCt, 25% и 75% квартилей.

Фиг. 12. Модель PLS-DA, построенная с использованием ОТ-ПЦР данных по экспрессии семи мкРНК в плазме крови в виде относительных концентраций, рассчитанных по калибровочным кривым стандартных ДНК, в группах здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.

Список литературы

1. Reid ВМ, Permuth JB, Sellers ТА. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biol Med. 2017 Feb; 14(1):9-32.

2. Seidman JD, Kurman RJ. Pathology of ovarian carcinoma. Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug; 17(4):909-25, vii. Review

3. Shih IeM, Kurman RJ. Ovarian tumorigenesis: a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis. Am J Pathol. 2004 May; 164(5):1511-8. Review

4. Levanon K, Crum C, Drapkin R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J Clin Oncol. 2008 Nov 10;26(32):5284-93.

5. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 2011 Jun 29;474(7353):609-15.

6. Kanchi KL, Johnson KJ, Lu C, McLellan MD, Leiserson MD, Wendl MC, Zhang Q, Koboldt DC, Xie M, Kandoth C, McMichael JF, Wyczalkowski MA, Larson DE, Schmidt HK, Miller CA, Fulton RS, Spellman PT, Mardis ER, Druley ТЕ, Graubert ТА, Goodfellow PJ, Raphael BJ, Wilson RK, Ding L. Integrated analysis of germline and somatic variants in ovarian cancer. Nat Commun. 2014;5:3156.

7. Yang D, Sun Y, Hu L, Zheng H, Ji P, Pecot CV, Zhao Y, Reynolds S, Cheng H,Rupaimoole R, Cogdell D, Nykter M, Broaddus R, Rodriguez-Aguayo C, Lopez-Berestein G, Liu J, Shmulevich I, Sood AK, Chen K, Zhang W. Integrated analyses identify a master microRNA regulatory network for the mesenchymal subtype in serous ovarian cancer. Cancer Cell. 2013 Feb 11;23(2): 186-99.

8. Sturgeon CM, Duffy MJ, Stenman UH, Lilja H, Briinner N, Chan DW, Babaian R,Bast RC Jr, Dowell B, Esteva FJ, Haglund C, Harbeck N, Hayes DF, Holten-Andersen M, Klee GG, Lamerz R, Looijenga LH, Molina R, Nielsen HJ, Rittenhouse H, Semjonow A, Shih IeM, Sibley P, Soletormos G, Stephan C, Sokoll L, Hoffman BR, Diamandis EP; National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian cancers. Clin Chem. 2008 Dec;54(12):ell-79.

9. Einhorn N, Sjovall K, Knapp RC, Hall P, Scully RE, Bast RC Jr, Zurawski VR Jr. Prospective evaluation of serum С A 125 levels for early detection of ovarian cancer. Obstet Gynecol. 1992 Jul;80(l):14-8.

10. Friedlander MR, Lizano E, Houben AJ, Bezdan D, Banez-Coronel M, Kudla G, Mateu-Huertas E, Kagerbauer B, Gonzalez J, Chen КС, LeProust EM, Marti E, Estivill X. Evidence for the biogenesis of more than 1,000 novel human microRNAs. Genome Biol. 2014 Apr 7;15(4):R57.

11. Gerstein M. Genomics: ENCODE leads the way on big data. Nature. 2012 Sep 13;489(7415):208

12. Sayed D, Abdellatif M. MicroRNAs in development and disease. Physiol Rev. 2011 Jul;91(3):827-87

13. Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer. 2006 Nov;6(l l):857-66; Wang F, Fu XD, Zhou Y, Zhang Y. Down-regulation of the cyclin El oncogene expression by microRNA-16-1 induces cell cycle arrest in human cancer cells. BMB Rep. 2009 Nov 30;42(11):725-30.

14. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, Wang J, Wu K, Chen X, Liang J, Tian J, Cao F. Noninvasive visualization of microRNA-16 in the chemoresistance of gastric cancer using a dual reporter gene imaging system. PLoS One. 2013 Apr 17;8(4):e61792.

15. Resnick KE, Alder H, Hagan JP, Richardson DL, Croce CM, Cohn DE. The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecol Oncol. 2009 Jan;112(l):55-9.

16. Yu SL, Chen HY, Chang GC, Chen CY, Chen HW, Singh S, Cheng CL, Yu CJ, Lee YC, Chen HS, Su TJ, Chiang CC, Li HN, Hong QS, Su HY, Chen CC, Chen WJ, Liu CC, Chan WK, Chen WJ, Li КС, Chen JJ, Yang PC. MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer. Cancer Cell. 2008 Jan;13(1):48-57.

17. Saunders NA. Real-time PCR. Methods Mol Biol. 2004;266:191-211

18. Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques. 1999 Jan;26(l):l 12-22, 124-5. Review.

Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников, отличающийся тем, что методом количественной ПЦР в реальном времени в образце плазмы крови женщины определяют уровень экспрессии семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p) с предпочтительным использованием стандартных ДНК для последующего расчета оценочного параметра (ОП) при построении модели PLS-DA: при значении 0<ОП<4,5 делают заключение о высокой вероятности наличия серозной опухоли яичников у женщины (серозных пограничных цистаденом и серозных цистаденокарцином высокой степени злокачественности), при значении -1,8<ОП<0 делают заключение о высокой вероятности отсутствия серозной опухоли яичников.