Способ определения внутриклеточной локализации рибонуклеаз

 

274 3II

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства № 223448

Заявлено 20.V.1969 (¹ 1331203/31-16) с присоединением заявки №

Приоритет

Кл. 30h, 14

МПК G Оlп 1/30

УДК 611-018(088.8) Комитет по делам изобретений и открытий при Соеете Министров

СССР

Опубликовано 24.VI.1970. Бюллетень ¹ 21

Дата опубликования описания 14.1Х.1970

Автор изобретения

Д. Ф. Глузман

Заявитель

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ

ЛОКАЛИЗАЦИИ РИБОНУКЛЕАЗ

В осно в ном акт. св. № 223448 описан способ определения внутриклеточной локализац ии piH бануклеаз, заключающийся в том, что объект .HiHtKубируют в среде, содержащей субстрат исследуемого фермента (дро:кжевую

РНК), л иофил из ированный и диализированный змеиный яд в качестве экзоген ной нуклеотидазы и растворимую соль свинца.

Однако такой способ недостаточно точен, а время инкубац ии объекта довольно Ilpoдолжительное. Предлагаемый способ отличаегся от из весгного тем, ч по в качестве субстрата используют циклический цитид ин(2,3 ) -фосф ат.

Это исключает пе р вый этап гистох имической реакции — разрыв межнуклеотидных фосфодиэфи рных связей, сокращает длительность ин кубации объекта, тем самым уменьшая возможность д иффузии промежуточных продуктов, и повышает точность локализации ферментативной активности, определяющую ценность гисгохимического метода.

Для опр едел ения внутри клеточной ло к ализации рибону клеаз по предлагаемому способу свежепригоговлен ные и высушеныые на воздухе мазки яров и и косгного мозга крыс фиксируют в парах 100/О-ного нейтрального формалина в течение 10 мин и помещают в и нкубац ионную смесь. П ри выявлении щелочнои

PНК-азы инкубационная смесь содержит

5 мг цитидин- (2,3 ) -фосфата (бар иевая соль), 0,05 мг змеи ного яда, 10 мг 0,2N трис-солянокислого буфера (рН 7,5), 0,125 мг 0,4М раствора нитрата свинца и дистиллированную во5 ду (до 25 мл).

П ри определении кислой РНК-азы инкубационная смесь содержит 5 мг цитидин-(2 .3 )фосфата, 0,05 «г змеиного яда, 6,25 мл 0.2М ацетатного буфера (рН 5,5), 0,125 мл 0,4М

10 раствора нитрата свинца и дистиллированную воду (до 25 мл) .

Мазки и нкубируют в термостате при 37 С в течен ие 3 час .п!ри выявлении щелочной

15 РНК-азы и 8 час прои определении кислой

РНК-азы. Затем мазки промывают ди стилли1рованной водой и погружают на 2 мин в раз:,веденный сульфид аммония. После промывки мазки сушат и микроскопируют. В процессе

20 обработки мазков внутриклеточные PHK-азы вызывают гидролиз цитлдин- (2,3) -циклофосфата, содержащегося в инкубационной смеси.

Образующиеся при этом нуклеозид-3-фосфаты специфически расщепляются нуклеотида2S зой, являющейся действующим началом два-. лизирова нного и лиофилизирован ного змеиного яда, и остатки фосфорной кислоты связываются ионами свинца. Полученные соединения переводятся в сульфид свинца, который

30 обнаруживается nip«микроскопировании. Яе274311

Составитель В. П. Казнин Корректор Л. А. Фирсова

Редактор Л. Мутовкина

Заказ 2561/6 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 ста его отложения отражают ло кали зацию рибонуклеазной активности.

П р ед м ет и з о б ip е те и и я

Способ Определения внутриклеточной локализации рибо нуклеаз по а|вт. ав. № 223448, отличпющийся тем, что, с целью повышения точности локал изац ии и соцрагцения срака инкубации, в качестве субстрата используют цикл|ический ц итидин- (2,3 ) -фосфат.